菲律宾蛤仔PPAR基因家族特征分析及干露胁迫下表达变化

为研究干露胁迫下菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum脂质代谢相关基因PPAR所发挥的作用,对菲律宾蛤仔PPAR基因家族(PPARα、PPARβ、PPARγ)进行了鉴定及组织表达分析,并考察了低温(5℃)、常温(20℃)干露胁迫对菲律宾蛤仔PPAR基因表达变化的影响。结果表明:PPARα、PPARβ和PPARγ的开放阅读框长度分别为912 bp、1644 bp和2124 bp,分别编码了239、547、707个氨基酸;系统进化树显示,菲律宾蛤仔PPARα和PPARγ与虾夷扇贝Patinopecten yessoensis亲缘关系较近,PPARβ与福寿螺Pomacea canalicalata亲缘关系较近;荧光定量分析显示,菲律宾蛤仔脂质代谢相关基因PPARα/β/γ均可不同程度地响应干露胁迫;整体来看,干露胁迫会抑制PPARα及PPARγ表达,并且低温(5℃)干露会显著抑制二者表达(P<0.05),但会诱导PPARβ表达,并且20℃干露胁迫对菲律宾蛤仔机体内部脂质代谢平衡的影响显著高于5℃(P<0.05)。研究表明,干露胁迫下,菲律宾蛤仔PPAR基因家族参与调控脂肪酸氧化,以维持保蛤仔体内能量平衡,并且低温可减少干露胁迫下菲律宾蛤仔机体的能量消耗,有助于菲律宾蛤仔适应干露环境。     

菲律宾蛤仔捕后干露处置对其复水湿藏稳定性的影响

为探讨捕后干露处置对菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum复水湿藏稳定性的影响,将采捕后体质量为(12.0±1.6)g的菲律宾蛤仔分别进行冷却干露预处理(干露-4℃组)、室温干露预处理(干露-室温组)及无预处理(对照组)后进行海水湿藏,跟踪监测了湿藏期间菲律宾蛤仔生化代谢情况,指标包括各部位质量百分比、体腔液pH、肌肉pH、水溶性蛋白质、肌肉糖原、ATP关联物、AEC值和K值。结果表明:干露预处理会消耗肌肉中ATP,但这种消耗在湿藏期间(50 h)能得到部分恢复;复水湿藏过程中3个处理组的内脏团质量略呈下降,质量百分比由5.8%降至1.2%,其他软体部位质量保持稳定;水溶性蛋白质含量基本无变化;对照组糖原含量比干露组下降更明显,由43.6 mg/g显著降至25.6 mg/g(P<0.05);pH均随贮藏时间推移呈现降低趋势,其中肌肉pH由7.0显著降为6.7(P<0.05),体腔液pH由7.7降为7.3(P>0.05);各组菲律宾蛤仔的AEC值一直保持在71%~76%,K值保持在2%~6%。研究表明,50 h复水湿藏过程中,3个试验组均能保持较好的生理状态,短时间(24 h)的干露放置不会对菲律宾蛤仔复水湿藏稳定性产生影响。     

易逝期干露对菲律宾蛤仔活品净化及贮藏特性的影响

为探究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum采捕后可容忍的干露时间,以研究干露对净化及随后的活品贮藏特性的影响,将采捕后的蛤仔原料设置6个处理组,分别为湿藏对照组(CW)、干藏对照组(CD)和干露0、1、3、4 d组(即E0、E1、E3、E4组),湿藏及净化条件均为室温海水,干露及干藏条件均为4℃湿布覆盖,分析各组的存活率、三磷酸腺苷(ATP)含量、核苷酸能荷(AEC)值和K值,并对各组蛤仔从外观、气味、滋味、质地和回味5个方面进行风味品质评价。结果表明:干露3 d内蛤仔有近100%的存活率,4 d干露存活率仍可保持90%左右,与初始原料相比,干露静置后的蛤仔均呈现恢复态势,E1、E3和E4组具有相同的ATP、AEC和K值水平,蛤仔呈现非愉悦性特征(苦、腥、土),经1～3 d静置后恢复了愉悦特征(甜、鲜、咸、香),干露4 d时则呈现臭味特征;原料经1、3、4 d干露,净化后蛤仔存活率分别为100%、91%和85%,随着干露时间的延长,净化过程ATP消耗增加,E4组的K值高于其他组,AEC值则未发现明显差异;感官评价结果显示,2 d内干露处理的净化产品具有良好的风味品质,而3 d以上的干露会导致风味下降,而E4组依然突出臭味;7 d活品湿藏的E0和E1组均具90%以上的存活率,E3组存活率在70%以上,而E4组存活率急剧下降至0;干藏下的E0、E1组同样具有90%以上的存活率,E3、E4组则可维持80%以上的存活率;E3、E4组在活品贮藏阶段的K值明显高于E0和E1组,除E4湿藏组外,其他所有组均呈现相同的ATP和AEC值平稳水平,而E4组则明显下降;此外,2 d内湿藏的E0、E1、E3组均可呈现愉悦特征;干藏的E0和E1组同样具有愉悦风味,E3组风味开始下降,E4组则突出臭味。研究表明,易逝期的菲律宾蛤仔品质可恢复,期间原料可容忍的干露期限是冷却条件下2 d左右,该阶段的干露暂存或运输不会影响后续的活品净化,且无论是干藏还是湿藏均具有7 d的活品货架期。     

越冬期前后菲律宾蛤仔体成分变化研究

为研究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum的低温耐受机制,对采集于大连市金石滩体质量为(15.45±1.00)g的越冬期蛤仔生理生化物质(结合水、糖原、甘油、脂肪、脂肪酸和氨基酸)含量的变化进行了检测。结果表明:与越冬前相比,越冬期后菲律宾蛤仔的糖原和脂肪含量均显著降低(P<0.05),甘油含量则显著升高(P<0.05);脂肪酸C18∶0、C20∶4n-6、C22∶5n-6和C22∶5n-3含量显著降低(P<0.05),C20∶5n-3(EPA)含量显著升高(P<0.05);异亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸含量显著升高(P<0.05)。研究表明,蛤仔体成分的变化与其低温耐受能力存在密切联系,该研究可为菲律宾蛤仔越冬期管理提供理论参考。     

高温、低盐对菲律宾蛤仔免疫能力的影响

为查明温度(21、30℃)和盐度(7、15、32)互作对菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum免疫能力的影响,对不同温度和盐度条件下试验0、3、6、12、24、48、72 h时,体质量为(14.8±0.731)g蛤仔的血细胞数、血淋巴吞噬能力和渗透压,以及血清中溶菌酶(LZM)、碱性磷酸酶(AKP)活性的变化进行了研究。结果表明:以各指标0 h水平为对照,常温常盐组(21℃,32)蛤仔各指标在0~72 h内虽有波动,但变化并不显著(P>0.05);各试验组蛤仔血细胞数有不同的变化趋势,72 h时,常温低盐组(21℃,7)蛤仔恢复初始水平,而常温中盐组(21℃,15)、高温中盐组(30℃,15)和高温常盐组(30℃,32)蛤仔血细胞数最终仍未恢复,高温低盐组(30℃,7)蛤仔虽在24 h时恢复初始水平,但在48 h时全部死亡;高温常盐组蛤仔吞噬能力先升高后降低在72 h时仍低于初始水平(P<0.05),2个中盐组和常温低盐组蛤仔吞噬活性最终恢复,而高温低盐组蛤仔吞噬活性在24 h时仍处于较高水平(P<0.05);各试验组蛤仔LZM活性在72 h时均显著高于初始水平(P<0.05);常温中盐组蛤仔AKP活性在3 h出现最大值,最终所有试验组AKP在72 h时恢复初始水平;2个中盐组和2个低盐组蛤仔渗透压均逐渐降低,而高温常盐组蛤仔渗透压逐渐升高,在72 h时均未恢复初始水平。研究表明,温度升高的同时降低盐度,将会对贝类免疫能力造成严重的影响,这可能是夏季滩涂贝类死亡率较高的一个重要原因。     

菲律宾蛤仔闭壳肌组织学及其蛋白特性

为探讨菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum的加工特性与肌肉蛋白质特性的关系,对菲律宾蛤仔闭壳肌的组织形态、肌原纤维蛋白(Myofibrillar,Mf)的分布特性,以及与其低温凝胶化相关的特性等进行了分析。结果表明:闭壳肌肌纤维具有高度同向性,横纹肌呈直线柱状,平滑肌呈螺旋柱状;利用SDSPAGE电泳对两种类型肌肉的蛋白分布分析显示,横纹肌肌浆蛋白组分中存在相对分子质量为23 000的差异蛋白,且溶出更多的粗丝蛋白,平滑肌的Mf组分中存在标志性蛋白Myorod,且副肌球蛋白含量高,肌球和原肌球蛋白含量低,肌动蛋白含量接近;整个闭壳肌Mf的溶解性依赖于离子强度和有无三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)的添加;Ca~(2+)-ATPase活性在中等离子强度(KCl浓度为0.30 mol/L)时最高,偏离中等离子强度后活性逐渐降低;参与交联的蛋白包括肌球蛋白、副肌球蛋白、原肌球蛋白,离子强度越高交联作用越显著。本研究结果可为探究经济贝类软体可食部位蛋白特性提供参考。     

菲律宾蛤仔生长性状基因型与环境互作研究

为研究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum基因型和环境的相作效应,采用双列杂交方法构建了AA、AB、BB、BA 4个基因型家系遗传材料,分别在不同温度、盐度和养殖环境条件下养殖30~45 d,以壳长生长为指标分析基因型与环境互作遗传效应。结果表明:基因型与温度互作遗传效应中,温度对基因型存在显著影响(P<0.05),在20、24、28℃水温下,壳长生长由大到小分别为BB>BA>AB>AA,BA>AB>AA>BB,AA>BA>AB>BB,但温度与基因型互作效应不显著(P>0.05);基因型与盐度互作遗传效应中,盐度对基因型存在显著影响(P<0.05),在20、25、30盐度下,AA家系生长均显著快于BA、AB和BB家系(P<0.05),各盐度下壳长生长均依次为AA>AB>BA>BB,但盐度与基因型互作效应不显著(P>0.05);在室外土池、室内循环水槽、室内水桶3种养殖环境下,环境对壳长生长存在显著影响(P<0.05),各家系生长速度均为室外土池>室内循环水>室内水桶,环境对基因型也存在显著影响(P<0.05),各环境条件下BA、AA、AB家系生长速度均显著快于BB家系(P<0.05),壳长生长由大到小依次为AA>AB>BA>BB,且养殖环境和基因型的交互作用也存在显著影响(P<0.05),采用线性回归法对蛤仔4个基因型与养殖环境互作进行数据分析,得出了不同基因型的壳长增长率对环境的响应方法,回归系数所确定的各基因型对环境变化反应的灵敏程度顺序为BB>AB>BA>AA。本研究结果为蛤仔遗传育种工作提供了参考依据。     

菲律宾蛤仔选育家系间杂交的Kung育种值及配合力分析

为评估菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum家系间杂交的遗传效应,以生长和抗逆性状优良的壳面具有斑块花纹的蛤仔家系子一代(C31、C32)及壳面背景颜色为橙色的蛤仔家系子三代(Or)作为基础群体,采用单对单双列杂交方法构建选育家系,对建立的蛤仔家系进行Kung育种值、配合力和杂种优势分析。结果表明:15日龄时,C32(♀)×Or(♂)家系Kung育种值最大,30~90日龄时,C31(♀)×C32(♂)家系Kung育种值最大;6日龄时,各杂交家系一般配合力有极显著性差异(P<0.01),特殊配合力无显著性差异(P>0.05);9~90日龄时,除60日龄杂交家系特殊配合力无显著性差异外(P>0.05),各测量日龄杂交家系的一般配合力、特殊配合力和反交效应均有显著或极显著性差异(P<0.05或P<0.01);30日龄后,C31(♀)×C32(♂)杂交家系子代杂种优势最为明显。研究表明,以斑块花纹C31(♀)与斑块花纹C32(♂)为亲本的杂交家系表现出较好的Kung育种值、配合力和杂种优势,是较好的杂交亲本来源。     

总氨态氮对菲律宾蛤仔早期生长发育的影响

为研究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum早期发育阶段对总氨态氮(TAN)和非离子氨(UIA)的耐受性,在水温为21~24℃、pH为7.9~8.3、盐度为27~30条件下,开展了TAN对菲律宾蛤仔受精卵、D形幼虫(壳长为103.2μm±3.0μm)和稚贝(壳长为318.1μm±27.3μm)的急性毒性试验。结果表明:TAN对菲律宾蛤仔受精卵孵化率的24 h EC_(50)为7.29 mg/L(UIA浓度为0.502 mg/L);对D形幼虫死亡率的96 h LC_(50)为7.94 mg/L(UIA浓度为0.212 mg/L);对稚贝死亡率的96 h LC_(50)为49.0 mg/L(UIA浓度为2.10 mg/L),对稚贝壳长相对生长的96 h EC_(50)为4.9 mg/L(UIA浓度为0.21 mg/L);对稚贝壳高相对生长的96 h EC_(50)为10.5 mg/L(UIA浓度为0.448 mg/L);菲律宾蛤仔对TAN的耐受能力为稚贝>D形幼虫。研究表明,菲律宾蛤仔育苗期间非离子氨浓度控制在0.020 mg/L以内较好。     

雌二醇刺激对菲律宾蛤仔Dmrt基因表达的影响

为研究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum不同发育时期及雌二醇刺激下Dmrt基因组织表达的变化状况,在菲律宾蛤仔基因组数据中(未发表),运用BLASTe比对确定了菲律宾蛤仔的3个Dmrt基因,运用MEGA、expasy、SMART等软件进行基因结构和进化分析,根据系统发生树的聚类对3个Dmrt基因进行命名,分别为Dmrt3-like、Dmrt4-like-1、Dmrt4-like-2,并采用实时荧光定量PCR方法对Dmrt基因在菲律宾蛤仔中的时空表达及其对雌二醇处理的响应进行了研究。结果表明:菲律宾蛤仔Dmrt 3个基因的表达量从担轮幼虫到壳顶幼虫时期呈迅速增长趋势,其中Dmrt4-like-2在菲律宾蛤仔的不同发育时期均有表达;在未进行雌二醇激素处理的正常菲律宾蛤仔体内,Dmrt4-like-1和Dmrt4-like-2在鳃和外套膜中表达量最高,Dmrt3-like在鳃和内脏团中表达量较高,在外套膜和水管中不表达;短时期内(72 h)雌二醇浸泡处理使得这3个基因在菲律宾蛤仔性腺中的表达量均发生上调;长时期(60 d)雌二醇浸泡处理后,空白组的雄性性腺中3个基因的表达量皆高于雌性性腺,试验组雌雄同体性腺中的Dmrt4-like-1和Dmrt4-like-2表达量略高于雌性中的表达量(P>0.05),但显著低于雄性中的表达量(P<0.05)。研究表明,菲律宾蛤仔Dmrt基因家族参与性别分化、性腺发育过程。     

亚硝酸态氮对菲律宾蛤仔浮游幼虫及幼贝的急性毒性

为探明亚硝酸态氮(NO_2-N)对菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum(以下简称蛤仔)的毒性,在实验室条件下,采用常规生物毒性试验方法,进行了NO_2-N急性胁迫对蛤仔浮游幼虫(壳长为162.2μm±15.9μm)存活和生长的影响,以及不同pH(7.2、7.6、8.0、8.4)条件下NO_2-N对蛤仔幼贝(壳长为9.4～10.3 mm)存活的影响试验。结果表明:在pH为8.00±0.20、水温为(26.1±0.6)℃、盐度为23条件下,NO_2-N对浮游幼虫的96 h LC_(50)为160.5 mg/L,随着胁迫时间的延长和NO_2-N浓度的增大,幼虫生长逐渐减慢,胁迫48 h时,97.8、146.8 mg/L NO_2-N浓度组蛤仔幼虫的壳长和壳高均与对照组无显著性差异(P>0.05),97.8 mg/L浓度下胁迫96 h时,壳长和壳高分别较对照组显著下降10.0%和11.3%(P<0.05),胁迫144 h时分别较对照组显著下降14.4%和14.7%(P<0.05);在pH为7.97±0.07、水温为(19.9±0.3)℃、盐度为30条件下,NO_2-N对蛤仔幼贝的96 h LC_(50)为628.1 mg/L,随着pH的升高,NO_2-N对幼贝的毒性逐渐减弱,pH为7.6、8.0和8.4时,96 h LC_(50)依次为497.0、628.1、1062.0 mg/L。研究表明,蛤仔浮游幼虫和幼贝对NO_2-N均有较强的耐受能力,且幼贝的耐受能力远大于浮游幼虫,生产实践中可维持较高pH以降低NO_2-N的毒性。     

4种壳色菲律宾蛤仔在低氧胁迫下的耐受能力比较研究

菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum对环境中溶氧剧烈的波动有较强的适应能力,为了探讨抗氧化酶和热休克蛋白在蛤蛤恣仔的低氧耐受过程中发挥的作用,以对低氧具有不同耐受能力的4种壳色蛤仔(野生蛤仔、斑马蛤、白蛤、白斑马蛤)为研究对象,比较了在1 mg/L的低氧胁迫条件下其抗氧化酶家族基因成员(TPx、CAT、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD)和热休克蛋白家族基因成员(HSP40、HSP75、Vps HSP-1、Vps HSP-2)的表达量变化情况。结果表明:在鳃组织中,野生蛤仔的抗氧化酶基因表现出先升高后恢复的趋势,在胁迫后6 h时表达量达到最高值(P<0.05),其他3种壳色蛤仔的抗氧化酶基因表现出先降低后恢复的趋势,在胁迫后6 h时表达量达到最低值(P<0.05),斑马蛤的TPx基因表达量在胁迫的各个时间点均显著高于其他3种壳色蛤仔(P<0.05);在外套膜组织中,4种壳色蛤仔中的抗氧化酶基因均表现出先升高后恢复的趋势,白蛤TPx基因和白斑马蛤CAT基因表达量在胁迫的各个时间点均显著高于其他3种壳色蛤仔(P<0.05);在鳃组织中,斑马蛤和白斑马蛤中热休克蛋白家族基因成员表现出先降低后升高再降低的趋势,分别在24 h、6 h时达到最低值(P<0.05),野生蛤仔和白蛤中热休克蛋白家族基因成员表现出先升高后降低的趋势,在胁迫6 h时,白蛤热休克蛋白家族基因成员表达量达到最高值(P<0.05),胁迫12 h时,野生蛤仔达到最高值(P<0.05);在外套膜组织中,白斑马蛤中热休克蛋白家族基因成员表达量出现先降低后升高的趋势,在胁迫6 h时达到最低值(P<0.05),而其他3个壳色蛤仔中热休克蛋白家族基因表达量表现出先升高后降低的趋势,在胁迫6 h时野生蛤仔和白蛤热休克蛋白家族基因成员表达量达到最大值(P<0.05),12 h时斑马蛤达到最大值(P<0.05),且白蛤HSP40基因表达量在胁迫的各个时间点均显著高于其他3种壳色蛤仔(P<0.05)。研究表明,斑马蛤和白蛤的TPx基因可能参与其体内黑色素合成的过程,初步证实了不同壳色蛤仔参与色素合成过程的相关基因在其对低氧的耐受过程中能够发挥重要作用。