红鳍东方鲀白介素15的原核表达及其活性测定

为了开发红鳍东方鲀Takifugu rubripes免疫基因及其重组表达,生产重组免疫因子蛋白,通过提取红鳍东方鲀肾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到白介素15(interleukin15,IL15)基因序列,将IL15成熟肽序列与原核表达载体p ET-32a(+)连接,成功构建重组表达载体(重组子)p ET-32a(+)-IL15,并将其重组子转化至Escheria coli BL21(DE3)感受态细胞中获得重组表达IL15的基因工程菌,再经IPTG诱导,p ET-32a(+)-IL15在BL21中得到了融合表达。结果表明:通过对表达产物的纯化和Western Blotting检测,红鳍东方鲀IL15在大肠杆菌中的表达量较高,蛋白浓度为294.6μg/m L;用MTT法对该蛋白进行活性鉴定显示,加入稀释10倍和100倍的重组红鳍东方鲀IL15蛋白时,CTLL-2细胞的增殖率相对较高,分别为71%和73%。研究表明,重组红鳍东方鲀IL15蛋白具有体外促进CTLL-2细胞增值的能力。     

红鳍东方鲀白介素15的原核表达及其活性测定

为了开发红鳍东方鲀Takifugu rubripes免疫基因及其重组表达,生产重组免疫因子蛋白,通过提取红鳍东方鲀肾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到白介素15(interleukin15,IL15)基因序列,将IL15成熟肽序列与原核表达载体p ET-32a(+)连接,成功构建重组表达载体(重组子)p ET-32a(+)-IL15,并将其重组子转化至Escheria coli BL21(DE3)感受态细胞中获得重组表达IL15的基因工程菌,再经IPTG诱导,p ET-32a(+)-IL15在BL21中得到了融合表达。结果表明:通过对表达产物的纯化和Western Blotting检测,红鳍东方鲀IL15在大肠杆菌中的表达量较高,蛋白浓度为294.6μg/m L;用MTT法对该蛋白进行活性鉴定显示,加入稀释10倍和100倍的重组红鳍东方鲀IL15蛋白时,CTLL-2细胞的增殖率相对较高,分别为71%和73%。研究表明,重组红鳍东方鲀IL15蛋白具有体外促进CTLL-2细胞增值的能力。     

幽门螺杆菌BabA蛋白N段的基因克隆、表达纯化及体外粘附活性评价

目的:克隆幽门螺杆菌BabA蛋白的N段(氨基酸1-437位)基因(BabA1),构建其原核表达质粒,表达并纯化获得携带6×His标签的BabA1融合蛋白,评价融合蛋白的体外粘附活性。方法:以幽门螺杆菌J99菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得BabA1基因片段,并定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)。经酶切及测序分析正确后,将重组质粒pET32a-BabA1转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行IPTG诱导表达,并对表达产物进行镍柱纯化、SDS-PAGE和Westernblot鉴定。采用菌落计数法评价BabA1融合蛋白在体外的细胞粘附活性。结果:成功扩增了BabA1基因,构建了pET32a-BabA1原核表达质粒,并通过优化该表达系统的最适诱导和纯化条件,获得了具有活性的6×His-BabA1融合蛋白,后者能显著增强大肠杆菌BL21(DE3)在体外对胃癌MFC细胞的粘附。结论:成功诱导表达并纯化获得了有粘附活性的6×His-BabA1融合蛋白,为进一步研究其免疫活性和生物学功能奠定了基础。     

细胞穿透性重组酶Tat-FLPo的表达、纯化及活性检测

为了获得细胞穿透性的重组酶Tat-FLPe应用于基因重组研究,建立了高效稳定的Tat-FLPe原核表达与纯化体系。首先,以质粒pCAGGS-FLPe为模板,PCR扩增FLPe序列,将其克隆到pET28a-Tat中并与穿膜蛋白Tat相连,获得表达载体pET28a-Tat-FLPe,然后将Tat-FLPe分别插入到另外3个原核表达载体pET22b、pET30a、pET32a中,转入原核表达菌Rosetta诱导表达,结果发现只有载体pET32a-Tat-FLPe可在大肠杆菌中表达出稳定的、有活性的Tat-FLPe;在此基础上,为进一步提高Tat-FLPe的表达量,利用在线软件对Tat-FLPe的密码子进行了优化,发现优化后Tat-FLPe的表达量显著提高;另一方面还探索了诱导表达条件对Tat-FLPe表达的影响,发现Tat-FLPe转化菌的最佳诱导表达条件为0.05mol/L IPTG,30℃诱导表达4h。最后,采用阳离子交换柱纯化表达上清,获得细胞穿透性的Tat-FLPe,并通过质粒酶切实验及细胞实验验证了Tat-FLPe的体内体外活性。成功地在原核表达系统中获得了有活性的Tat-FLPe,并优化了其表达体系,为下一步应用于细胞及活体动物的基因操作奠定了基础。     

粉尘螨第十六类变应原的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的 获得大量具有良好IgE结合活性的粉尘螨第十六类变应原（Der f16）的重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究.方法 挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知Der f16基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Der f16基因片段,产物连入pMD32-T载体中.扩增后,利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ双酶切将目的 基因片段连接到pET32a表达载体上,转化到大肠杆菌（E.coli BL21）中经IPTG诱导表达.表达载体经亲和层析纯化,SDS-PAGE检测蛋白纯度,Western bolt检测变应原免疫学活性.结果 以粉尘螨总RNA为模板成功克隆出Der f16基因,与数据库中Der f16基因同源性为100%;经IPTG诱导后,大肠杆菌大量表达Der f16蛋白,所获得的重组蛋白分子质量为73 ku,上清及沉淀物均有蛋白表达,且上清表达量高于沉淀物.重组Der f16能够与螨过敏患者血清中的IgE 反应,而不与健康者血清中的IgE反应.结论成功构建了Der f16的原核表达载体,并高效表达和纯化出具有免疫原性的Der f16重组蛋白.     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

果蝇Bves蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的为了进一步研究细胞粘附分子Bves在肿瘤的发生及转移过程中的作用,需要获得Bves蛋白并制备其抗体。方法根据Flybase网站所提供的Bves基因序列,以果蝇的总RNA为模板进行PCR扩增,得到Bves部分编码序列,随后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达载体。重组表达质粒经酶切测序鉴定后,转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,并用IPTG诱导融合蛋白的表达,使用活化的Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化后得到的His-Bves融合蛋白免疫注射新西兰大白兔制备Bves多克隆抗体,并用Western blot对抗体效价进行检测。结果和结论获得了Bves原核表达重组融合蛋白及高效价的兔抗Bves多克隆抗体,为后期深入研究Bves基因的功能奠定了基础。     

基于密码子优化策略的无乳链球菌表面蛋白LrrG的原核表达、纯化及免疫原性

为高效获得可溶性无乳链球菌表面蛋白(LrrG),通过密码子优化及构建LrrG基因优化后的pCzn1-LrrG重组表达载体,并转染至BL21(Plys)感受态细胞中,高效表达了无乳链球菌Streptococcus agalactiae(GBS)富含亮氨酸重复序列蛋白(LrrG)。根据大肠杆菌密码子偏好性,优化并人工合成LrrG全基因序列,经双酶切后插入至表达载体,将优化后的重组质粒pCzn1-LrrG转染至感受态细胞进行原核表达,经裂解和纯化后获得上清重组蛋白LrrG。结果表明:PCR扩增得到2 286 bp的优化LrrG基因片段,构建的重组质粒pCzn1-LrrG经双酶切获得约4 400 bp和2 286 bp两条片段,与预期值相符;重组载体的测序结果与优化后的基因碱基序列比对结果完全一致,编码的氨基酸序列未发生突变;SDS-PAGE和Western blot鉴定结果显示,获得了相对分子质量约为108 000的LrrG重组蛋白,与理论值相符,且优化后LrrG重组蛋白具有GBS抗原反应原性;通过亲和层析纯化LrrG上清蛋白后,发现优化后可溶性LrrG蛋白表达量较优化前提高了2.2～3.8倍;利用优化后的LrrG蛋白免疫罗非鱼后,发现其对罗非鱼抗GBS感染具有61.54%～69.23%的相对免疫保护率。研究表明,按照大肠杆菌密码子优化GBS表面蛋白LrrG,可有效提高其在大肠杆菌中的表达量,且优化后的LrrG重组蛋白仍然具有较好的免疫原性,本研究结果为基于LrrG基因工程疫苗的制备和应用提供了科学参考。     

斑马鱼ISL1蛋白多克隆抗体的制备

目的为了进一步研究ISL1作为第二生心区心脏前体细胞的分子标志在心脏发育中的功能,需要获得ISL1蛋白并制备其抗体。方法根据已报道的ISL1基因序列,以斑马鱼mRNA为模板进行PCR扩增得到ISL1部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达载体。将重组质粒进行酶切测序鉴定,然后利用大肠杆菌E.coli BL21对该重组质粒进行表达。经过IPTG诱导,采用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的his-ISL1融合蛋白免疫新西兰大白兔制备ISL1多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体效价。结果获得了ISL1原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗ISL1多克隆抗体。结论本实验为ISL1在斑马鱼心脏发育中的新功能的进一步研究奠定了基础。