N+注入诱变选育纤维素酶高产菌株及发酵产酶营养因子优化研究

应用低能氮离子（N⁺）注入技术对纤维素酶产生菌里氏木霉（Trichoderma reesei）进行诱变选育,在能量为 10 keV,注量为150×10¹⁴和200×10¹⁴ N⁺/cm²的条件下分别筛选得到3株纤维素酶高产菌株,连续5代遗传稳定性实验结果表明,所得到的高产菌株遗传稳定性较好,羧甲基纤维素酶活力均提高到3.300 IU/mL 以上,较出发菌株 （2.698 IU/mL） 提高了20.0%以上。采用Plackett-Burman实验设计法和旋转中心组合设计法系统地研究高产菌株 150-1-1 发酵营养因子组成,得到了纤维素酶产量随葡萄糖、麸皮和微晶纤维素等营养因子的变化规律及相应的响应面分析图。实验结果表明,葡萄糖、麸皮和微晶纤维素浓度与纤维素酶活存在显著的相关性,当葡萄糖浓度为4.9 g/L,麸皮浓度为23.0 g/L,微晶纤维素浓度为7.7 g/L时,150-1-1纤维素酶滤纸酶活力达到2.439 IU/mL,较优化前 （2.000 IU/mL） 提高了22.0%。     

应用里氏木霉发酵制备纤维素酶固体曲的研究

应用本实验室筛选得到的纤维素酶高产菌株里氏木霉（Trichoderma reesei）150-1-1发酵制备纤维素酶固体曲,通过优化固态发酵培养基组成及发酵条件,制备得到纤维素酶活力较高的固体曲及粗酶液。实验结果表明,在原料量为10 g,麸皮与秸杆粉质量比为4：1,料液比为1：2.5,发酵时间为120 h,发酵温度为31℃,发酵起始pH值为5.5的条件下,应用里氏木霉150-1-1发酵得到的纤维素酶固体曲酶活力达到423.6 U/g。     

麸皮对里氏木霉Rut C-30产 纤维素酶的促进作用

本研究尝试通过里氏木霉Rut C-30添加适量的麸皮以及利用实验设计软件Design-Expert寻找适宜的麸皮与微晶纤维素的配比来研究麸皮对里氏木霉Rut C-30产纤维素酶的影响.结果表明,适当的麸皮添加量能够促进纤维素酶的生产;通过二元二次正交旋转组合设计,确定了微晶纤维素添加量和麸皮添加量分别为12.23和23.50 g/L的优化产酶条件.此条件下,在250 mL摇瓶中滤纸酶活达到6.383 FPIU/mL,得率系数为521.913 FPIU/g;在.5 L发酵罐中,滤纸酶活为6.80 FPIU/mL,得率系数为556.582 FPIU/g.相比于优化前,优化后摇瓶实验和发酵罐实验中滤纸酶活分别提高了14.24%和1.403%.而纤维素酶的得率系数却分别降低了6.584%和4.005%.分别以酸解杨木残渣和蒸汽爆破杨木浆替代微晶纤维素作为碳源,最终获得最高滤纸酶活1.953 FPIU/mL和1.45 FPIU/mL.     

外切-β-葡聚糖酶基因重组里氏木霉的筛选及其产酶性能

外切-b-葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一,提高该组分的活力是增强纤维素酶协同降解性能、降低纤维素水解成本的关键。分别采用微晶纤维素琼脂平板法和滤纸崩解法,对已有的基因重组转化子进行筛选试验,获得了6个优良转化子,其滤纸崩解速率和微晶纤维素琼脂平板上的生长速率都较大。进一步在摇瓶条件下进行复筛试验,获得了外切-β-葡聚糖酶（C₁）高产转化子Trichoderma reesei ZU-101,液体培养48 h,其C₁酶活力可达18.24 U·ml^-1,是出发菌株的2.16倍;分析结果表明：重组转化子的纤维素酶体系中内切-b-葡聚糖酶和纤维二糖酶的活力与出发菌株相比变化不大,但由于外切-b-葡聚糖酶活力得到了大幅度提高,纤维素酶的总活力（滤纸酶活力FPA）也提高了61.9%。采用纤维素酶对碱预处理玉米秸秆进行酶解试验,当酶用量为20 FPIU·（g底物）^-1,水解48 h,重组转化子T.reesei ZU-101纤维素酶的酶解得率高达94.4%。本文的研究结果在可再生纤维素资源的生物转化与利用方面具有广阔的应用前景。     

一株耐NMMO纤维素酶菌株的筛选及发酵优化

在常规筛选方法的基础上,利用在富集培养基中加入10 g/L NMMO,从土壤中筛选获得一株耐NMMO的高活性纤维素酶菌株Galactomyces sp. CCZU11-1。经研究,最适产酶培养条件为：碳源为甘蔗渣（5 g/L）,氮源为(NH4)2SO4（5 g/L）,表面活性剂为Tween-80（8 g/L）,培养温度为30 ℃,初始培养pH值为5.5。在此条件下菌株培养7天后,FPA及CMCase分别为13.5 IU/mL和24.6 IU/mL。在培养体系和反应体系中分别加入200 g/L NMMO,Galactomyces sp. CCZU11-1纤维素酶仍具有良好的活性,表明其具有较高的耐NMMO性能及应用前景。     

麸皮对里氏木霉Rut C-30产纤维素酶的促进作用

本研究尝试通过里氏木霉RutC-30添加适量的麸皮以及利用实验设计软件Design-Expert寻找适宜的麸皮与微晶纤维素的配比来研究麸皮对里氏木霉RutC-30产纤维素酶的影响。结果表明,适当的麸皮添加量能够促进纤维素酶的生产：通过二元二次正交旋转组合设计,确定了微晶纤维素添加量和麸皮添加量分别为12．23和23．50g/L的优化产酶条件：此奈件下,在250mL摇瓶中滤纸酶活达到6．383FPIU／mL,得率系数为521．913FPIU／g;在7．5L发酵罐中,滤纸酶活为6．807FPIU／mL,得率系数为556．582FPIU／g。相比于优化前,优化后摇瓶实验和发酵罐实验中滤纸酶活分别提高了14．247％和17．403％,而纤维素酶的得率系数却分别降低了6．584％和4．005％。分别以酸解杨木残渣和蒸汽爆破杨木浆替代微晶纤维素作为碳源,最终获得最高滤纸酶活1．953FPIU／mL和1．745FPIU／mL。     

降解水葫芦中纤维素的优良菌株的筛选

在腐烂的水葫芦中利用刚果红平板染色法分离筛选具有产纤维素酶活性的四株菌株,通过考察其产纤维素酶活力及降解水葫芦的水平,从而筛选出一株产纤维素酶活较高同时能高效降解水葫芦的优良菌株D1。在降解水葫芦的过程中,CMC酶活最高为2.262μmol/min.mL,滤纸酶活最高为1.592μmol/min.mL。D1菌株发酵液中10天左右的还原糖质量浓度达到2.273 g/L,14天降解水葫芦达到39.13%。经初步鉴定该菌株为绿色木霉。     

草酸盐酸体系微晶纤维素水解动力学

对微晶纤维素在草酸-盐酸体系中的水解情况进行了研究,并对不同条件下反应产物中葡萄糖的质量浓度进行了测定。依据纤维素酸水解反应特点,根据Seaman模型,对微晶纤维素在草酸盐酸体系中的水解动力学规律进行了研究。动力学结果:纤维素水解和葡萄糖降解的活化能分别是58.02 k J/mol和144.2 k J/mol。升高反应温度,使纤维素水解反应速度加快,也会使葡萄糖的降解速率加快。该模型的最佳反应条件是:固液比1∶20 g/m L,草酸的质量浓度25 g/L,盐酸的质量浓度1 g/L,温度90℃,时间9 h,在此条件下,葡萄糖质量浓度为1.657 g/L。     

草酸盐酸体系微晶纤维素水解动力学

对微晶纤维素在草酸-盐酸体系中的水解情况进行了研究,并对不同条件下反应产物中葡萄糖的质量浓度进行了测定。依据纤维素酸水解反应特点,根据Seaman模型,对微晶纤维素在草酸盐酸体系中的水解动力学规律进行了研究。动力学结果:纤维素水解和葡萄糖降解的活化能分别是58.02 k J/mol和144.2 k J/mol。升高反应温度,使纤维素水解反应速度加快,也会使葡萄糖的降解速率加快。该模型的最佳反应条件是:固液比1∶20 g/m L,草酸的质量浓度25 g/L,盐酸的质量浓度1 g/L,温度90℃,时间9 h,在此条件下,葡萄糖质量浓度为1.657 g/L。     

纤维素酶高效水解麦秆的工艺研究

以纤维素酶水解蒸汽爆破麦秆的过程为研究对象,考察了底物浓度、纤维素酶用量、β-葡萄糖苷酶装载量以及化学激活剂对麦秆水解的影响。结果表明,高底物浓度下的最佳酶解工艺条件为底物(麦秆)浓度20%,酶装载量(U/g纤维素):滤纸酶活45、β-葡萄糖苷酶25、木聚糖酶800,0.1 mmol/L Mg2+、0.1 mmol/L Co2+、10 mmol/L Fe3+,1 g/L PEG2000、1 g/L Tween80和1 g/L山梨醇,搅拌速度120~150 r/min,分批补料,p H4.8,50℃,水解时间144 h。在此条件下,还原糖浓度达115.43 g/L,葡萄糖浓度达88.39 g/L,转化率也分别达到78.04%和88.73%。     

直接降解木质素的漆酶/木聚糖酶体系的合成

对一株高产漆酶及伴有木聚糖酶和少量纤维素酶的菌株,用不同的碳源和氮源对其调控培养,合成漆酶/木聚糖酶体系。实验结果表明,最佳的碳源是可溶性淀粉,用它作碳源,漆酶活性高达730IU/mL,木聚糖酶活性是4.49IU/mL,纤维素酶活性只有0.23IU/mL;最佳的氮源是蛋白胨,用其作氮源,合成漆酶活性可达812IU/mL,木聚糖酶活性是4.68IU/mL,纤维素酶活只有0.09IU/mL。     

外切-β-葡聚糖酶基因重组里氏木霉的筛选及其产酶性能

外切-β-葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一,提高该组分的活力是增强纤维素酶协同降解性能、降低纤维素水解成本的关键。分别采用微晶纤维素琼脂平板法和滤纸崩解法,对已有的基因重组转化子进行筛选试验,获得了6个优良转化子,其滤纸崩解速率和微晶纤维素琼脂平板上的生长速率都较大。进一步在摇瓶条件下进行复筛试验,获得了外切-β-葡聚糖酶(C1)高产转化子Trichoderma reesei ZU-101,液体培养48 h,其C1酶活力可达18.24 U·ml-1,是出发菌株的2.16倍;分析结果表明:重组转化子的纤维素酶体系中内切-β-葡聚糖酶和纤维二糖酶的活力与出发菌株相比变化不大,但由于外切-β-葡聚糖酶活力得到了大幅度提高,纤维素酶的总活力(滤纸酶活力FPA)也提高了61.9%。采用纤维素酶对碱预处理玉米秸秆进行酶解试验,当酶用量为20 FPIU·(g底物)-1,水解48 h,重组转化子T.reesei ZU-101纤维素酶的酶解得率高达94.4%。本文的研究结果在可再生纤维素资源的生物转化与利用方面具有广阔的应用前景。     

黄曲霉YZC产纤维素酶的固态发酵条件优化

为了提高黄曲霉YZC固态发酵所产纤维素酶的酶活力,采用单因素试验分别研究了碳源、氮源、氮源质量浓度、培养温度、培养时间、初始p H值、接种量对纤维素酶酶活的影响。优化后的固态发酵条件为：碳源为质量比3∶2的稻草粉与麸皮,氮源为NH4Cl,其质量浓度为10 g/L,培养温度为30℃,培养时间为7 d,初始p H值为4.0,接种量为20%。在此基础上,采用响应曲面法对影响纤维素酶活的3个因素包括氮源NH4Cl的质量浓度、培养时间、初始p H值进行优化,以期提高纤维素酶酶活。通过响应曲面分析得到滤纸酶活力与这三个因素的最优回归方程,确定滤纸酶活力最大时的最佳组合为NH4Cl质量浓度为8.5 g/L、培养时间为6.5 d、初始p H值为4.5,该条件下滤纸酶活力为10.87 IU/m L,是优化前的2.39倍,并与响应曲面拟合所得方程的预测值10.50 IU/m L符合良好。     

两种木质素对纤维素酶水解的影响机制

为探究木质素对纤维素酶水解效率的影响,将苦竹中提取的乙醇木质素（EOL-B）和磨木木质素（MWL-B）作为模型物添加到微晶纤维素中进行酶吸附和水解。结果表明：添加8 g/L MWL-B使得反应72 h的葡萄糖得率从51.34%降低到46.06%;添加8 g/L EOL-B使得反应72 h葡萄糖得率从51.34%增加到61.06%。与MWL-B相比,EOL-B与纤维素酶蛋白之间亲和力和结合力较低,故纤维素酶在EOL-B上的非特异吸附更少。FT-IR和¹³C NMR分析表明：经乙醇处理后,木质素分子中C-C凝缩单元减少,β-O-4'键断裂,导致木质素分子的亲水性增加,阻断了与纤维素酶蛋白疏水性氨基酸的结合,对纤维素酶蛋白吸附量减少,从而使得纤维底物周围的酶蛋白浓度增加,水解率提高。     

绿色木霉高效纤维素酶菌株的选育

采用NTG和UV连续处理绿色木霉IFO31137菌株（TTichodermaviTideIFO31137），并对菌株纤维素酶活力和酶吸附率作双重比较，获得突变株SO－465。其微晶粉末纤维素酶（Avicelase）活力提高8．2倍，酶对废物的吸附率增加约5倍。突变菌株对四种纤维素底物（微晶粉末纤维素、滤纸、纸浆纤维和KCFloc）的水解率分别为87．5％、81．9％、90．5％和83．2％，比原始菌株增加幅度为101％、230％、83％和74％。     

以里氏木霉制备纤维素酶的研究

以里氏木酶（Trichoderma reesei Rut C-30)为产酶菌株,采用不同纤维底物（麸皮,玉米皮及玉米秸杆）制备纤维素酶,研究其酶解效果及酶系构成。研究表明,玉米秸杆底物最佳,滤纸酶活达到1．87IU/mL,产酶收获期为112h,麸皮底的收获期最短,达48h但滤纸酶活最低,达0．76IU/mL,产酶时间长短将影响酶系构成,时间长酶系结构合理,滤纸酶活高。     

酸碱复合处理和酶浓度对药渣纤维素水解效率的影响

为了研究酸碱复合处理对药渣木质纤维素水解效率的作用效果,探究药渣纤维素转化酶解转化乙醇的可行性,以水提药渣为原料,用NaOH-PAA进行预处理,在不同反应体系下用纤维素酶进行水解。实验结果表明,预处理后药渣酶解的葡萄糖浓度比预处理前提高3～4倍;在酶总量不变的情况下,增加底物数量和酶浓度能显著提高反应体系中的葡萄糖浓度。83～116 mg/mL的底物浓度和5.8 U/mL的酶浓度可使反应体系中的葡萄糖浓度达到12 mg/mL以上。在83 mg/mL的底物浓度和5.8 U/mL的酶浓度下,对预处理后的丹参药渣、甘草药渣及混合药渣进行纤维素酶解,60 h时,其糖产率分别为29.07 g/kg、49.31 g/kg、52.83 g/kg。结论:预处理能显著提高纤维素的酶解效率,药渣的葡萄糖产率主要取决于其纤维素含量,与药渣类型没有密切关系。     

亚硝基胍-紫外复合诱变选育高产衣康酸菌株

为提高土曲霉KYK-031发酵生产衣康酸能力,对出发菌株开展诱变育种和高产能力选育研究。采用亚硝基胍（NTG）和紫外（UV）复合诱变方法,通过平板初筛和摇瓶复筛,筛选衣康酸高产突变株。结果表明,亚硝基胍在500μg/mL浓度下的最佳诱变时间为40 min,15 W紫外诱变的最佳诱变时间为2 min,亚硝基胍-紫外复合诱变后筛选得到一株衣康酸高产菌株KYK-1035,摇瓶发酵产量为73.7 g/L,比出发菌株（41.8 g/L）提高了76.3%,糖酸转化率为63.4%。采用亚硝基胍-紫外复合诱变,提高了出发菌株诱变的正突变率,为衣康酸发酵继续放大和工业化生产奠定了基础。     

里氏木霉Rut-C30产纤维素酶培养基优化及其酶解特性

以廉价的工业纤维素诱导里氏木霉Rut-C30产纤维素酶,并对液体深层发酵培养基进行优化,采用响应面中心组合设计,以滤纸酶活为响应值,考察工业纤维素、麦麸、大豆粉浓度对纤维素酶活的影响. 结果表明,优化后的培养基组成为：工业纤维素35.62 g/L、麦麸19.37 g/L、大豆粉38.49 g/L,该条件下滤纸酶活达9.13 IU/mL,比优化前提高了72.26%,葡萄糖苷酶酶活提高了80.39%. 在121℃下用2% NaOH对玉米秸秆预处理45 min,物料中纤维素含量达64.94%,用该粗酶液酶解后酶解得率为94.68%.     

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件的研究

植物纤维是自然界最丰富的资源,筛选高产纤维素酶菌株,降低纤维素酶的生产成本,让植物纤维变废为宝一直是研究热点。从腐烂植物叶片中分离到一株高产纤维酶菌株CXYJ-1。对CXYJ-1菌株进行发酵培养条件的研究,结果表明,以豆饼粉为碳源,(NH_4)_2SO_4为氮源,培养温度为35～37℃,初始pH=5,培养96 h,产酶活力最高,CMC酶活为4.8 U/mL,FP酶活为4.5 IU/mL。