小剂量辐照与rhEGF促培养人表皮细胞生长实验研究

通过对人表皮细胞培养方法的研究,叙述了从取材、消化处理标本、贴壁剂和滋养细胞的准备、培养基和培养条件选择到各种生长刺激因子的运用这一过程。并对低传能线密度(1et)小剂量照射和重组人表皮细胞生长因子(rhEGF)对人表皮细胞生长的促进作用作了对照研究,证实了小剂量照射和重组人表皮细胞生长因子对体外培养的人表皮细胞具有相同的促进生长作用,且两因素具有协同作用,初步检测了两因素在该实验条件下的最佳剂量和浓度,对两因素促进培养的人表皮细胞生长的机理作了初步探讨。     

小剂量辐射诱导淋巴细胞转化适应性反应研究

应用淋巴细胞丝裂原刺激后细胞~3H-TdR参入的方法,研究了小剂量γ射线照射(0～4 cGy)诱导淋巴细胞转化功能的适应性反应;探讨了影响适应性反应表现的几个因素,即D_1剂量、D_2剂量及D_1和D_2照射的时间间隔。结果表明,体外培养24h的人外周血淋巴细胞在小剂量γ射线(0.5～4.0cGy)照射后,均产生了适应性反应,并以1.0cGy的γ射线     

碳离子辐照哺乳动物细胞引起的旁观者效应

用经过碳离子辐照V79细胞的条件培养基(Irradiated conditionedmedium,简称ICM)和与受照射细胞共同培养两种方法,研究了未受照射细胞的旁观者效应。结果表明,ICM法可以明显降低未受照射细胞的克隆形成率;受照射细胞与未受照射细胞共同培养一段时间后,细胞克隆形成率比假定没有旁观者效应时的预期值低,细胞微核率和hprt(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)基因位点突变率与预期值基本相同。推测受照射细胞可能释放出了能对未受照射细胞生长产生毒性的因子,这种因子对未受照射细胞没有明显的致微核和致突变作用。     

小剂量辐射诱导淋巴细胞转化适应性反应研究

应用淋巴细胞丝裂原刺激后细胞~3H-TdR参入的方法,研究了小剂量丁射线照射(0～4cGy)诱导淋巴细胞转化功能的适应性反应;探讨了影响适应性反应表现的几个因素,即D_1剂量、D_2剂量及D_1和D_2照射的时间间隔。结果表明,体外培养24h的人外周血淋巴细胞在小剂量丁射线(0.5～4.0cGy)照射后,均产生了适应性反应,并以1.0cGy的γ射线照射所诱导的适应性反应最强。随剂量的增大,适应性反应减弱,说明了小剂量辐射诱导适应性反应存在着最适剂量范围。D_1(1.0cGy)照射后6,24,48,72h照射D_2(3Gy),结果表明24h的间隔适应性反应最强,这与照后细胞的增殖周期有关。1～7Gy的D_2照射,均可观察到适应性反应,而以3.0Gy照射后反应最强。D_2剂量过大,适应性反应不明显,剂量过小,适应性反应显现不充分,说明D_2剂量在适应性反应中亦有最适剂量范围。     

EGF和EGFR在急性放射性皮肤溃疡组织中的表达水平:与单纯伤口愈合的对比研究

为研究表皮生长因子(EGF)及表皮生长因子受体(EGFR)在急性放射性皮肤溃疡组织中的表达水平及对溃疡形成、发展、愈合的影响，采用雌性Wistar大鼠，以^60Coγ射线局部照射法建立急性放射性皮肤溃疡动物模型，并以手术法建立单纯皮肤伤口动物模型，观察病变55d，采用免疫组化、原位杂交和图像分析等方法检测单纯伤口及皮肤溃疡组织中EGF及其受体的转录和表达水平。结果表明，照射后14d照射野内开始出现皮肤溃疡，之后逐渐扩大、融合、加深。皮肤受照射区多种细胞，特别是溃疡床表皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞中EGF及其受体的转录及表达水平均较正常皮肤组织有所增强，但与单纯伤口组比较，溃疡组织中EGF及其受体的转录及表达水平明显降低。说明辐射诱导的皮肤溃疡组织中EGF及其受体表达水平降低可能与溃疡发生、发展及难愈合的分子机制相关。     

小剂量辐射对淋巴细胞亚群间调节的影响

应用单克隆抗体铺皿法,从人外周血中分离出CD_4,CD_8,CD_(19)(B)和CD_(57)(NK)四种淋巴细胞亚群,观察了各亚群细胞的肿瘤杀伤活性和相互调节以及小剂量辐射对CD_(57)细胞功能和亚群间调节的影响。结果发现,以上四种淋巴细胞亚群均具有肿瘤杀伤活性,其中以CD_(57)细胞的杀伤活性最强。CD_4和CD_(57)细胞混合培养后的总NK活性超过两者之和,而CD_8,CD_(19)分别与CD_(57)细胞混合培养后,总NK活性与两者单独培养之和相比无显著性差异。50cGy和80cGy的γ线照射可使CD_(57)细胞的功能增强。照射CD_4或CD_(57)细胞后二者混合培养的总NK活性比未受照的混合培养组显著升高。而CD_8或CD_(19)分别与CD_(57)混合培养则无此现象。表明小剂量辐射可增强CD_4和CD_(57)细胞间的协同作用。外周血NK细胞受到多种亚群细胞的影响,外周血NK活性反映了多种细胞自然杀伤活性的总和。     

小剂量辐射诱导的免疫增强效应及其细胞学机制

在研究小剂量X射线照射对全淋巴细胞刺激效应的同时,探讨了小剂量照射(0,0.02,0.05,0.10,0.20,0.50Gy)对三种单克隆抗体分离出的CD_4~ 、CD_8~ 和B亚群细胞的刺激效应,观察了小剂量照射后的CD_4~ 、CD_8~ 细胞对B细胞功能的影响。结果表明,Panning法分离的各亚群细胞的纯度和存活率均在90％以上,全淋巴细胞在0.10Gy剂量内有刺激作用,尤以0.10Gy剂量点效应最大(为对照组的139.2％);各亚群细胞在0.20Gy照射内,均有刺激效应的发生,CD_4~ 和B细胞在0.10Gy剂量点效应最强(为对照的179.3％和182.5％),而CD_8~ 在0.05Gy点效应最强(为对照的169.6％);相同剂量,CD_4~ 和B细胞的刺激效应大于CD_8~ 。0.50Gy照射则表现出明显的抑制作用。正常CD_4~ 细胞对B细胞具有辅助功能,CD_8~ 细胞对B细胞具有抑制作用,小剂量照射可加强CD_4~ 细胞对B细胞的辅助作用,促进CD_8~ 细胞对B细胞的抑制功能,以0.10Gy照射后这种效应最强,0.20Gy照后仍可观察到这种效应。     

小剂量辐射诱导的免疫增强效应及其细胞学机制

在研究小剂量X射线照射对全淋巴细胞刺激效应的同时,探讨了小剂量辐射(0,0.02,0.05,0.10,0.20,0.50 Gy)对三种单克隆抗体分离出CD_4~ 、CD_8~ 和B,亚群细胞的刺激效应,观察了小剂量照射后的CD_4~ 、CD_8~ 细胞对B细胞功能的影响。结果表明,Panning法分离的各亚群细胞纯度和存活率均在90％以上,全淋巴细胞在0.10 Gy剂量内有刺激作用,尤以0.10 Gy剂量点效应最大(为对照组的139.2％);各亚群细胞在0.2 Gy照射内,均有刺激效应的发生,CD_4~ 和B细胞在0.1 Gy剂量点效应最强(为对照的179.3％和182.5％),而CD_8~ 在0.05 Gy点效应强(为对照的169.6％);相同剂量,CD_8~ 和B细胞的刺激效应大于CD_8~ 。0.5 Gy照射则表现出明显的抑制作用。正常CD_4~ 细胞对B细胞具有辅助功能,CD_8~ 细胞对B细胞具有抑制作用,小剂量照射可加强CD_8~ 细胞对B细胞的辅助作用,促进CD_8~ 细胞对B细胞的抑制功能,以0.1 Gy照射后这种效应最强,0.2 Gy照后仍可观察到这种效应。     

低剂量电离辐射预处理对高剂量辐射诱导的肝癌细胞hepG2细胞周期阻滞的影响

以人肝癌细胞hepG2为研究对象,用流式细胞术测定并分析了低剂量γ射线(5cGy)预照射对高剂量照射(3Gy)诱导的细胞周期阻滞的影响。结果显示：(1)低剂量照射可引起hepG2细胞在G2／M期短暂累积(至照射后4h);(2)低剂量照射促进hepG2细胞的生长;(3)高剂量照射后,hepG2细胞的G2期发生阻滞,而S期只发生短暂延迟;(4)与单纯高剂量照射相比,低剂量照射预处理后4h给予高剂量照射可进一步促进hepG2细胞在G2／M期累积,但预处理后8h给予高剂量可促进细胞通过G2／M期。实验结果表明,低剂量照射预处理对高剂量照射诱导的细胞周期阻滞的影响,取决于两次照射的时间间隔。     

三株肿瘤细胞对X射线辐射敏感性的比较

比较研究X射线对人子宫颈癌细胞(He La)、人肝癌细胞(Hep G2)和人粘液表皮样癌细胞(MEC-1)的辐射敏感性。X射线照射三株细胞至吸收剂量2、4、6、8 Gy后0.5、4和24 h,用克隆形成实验测定细胞增殖,中性彗星电泳法检测DNA双链损伤(DNA double strand breaks,DSB),免疫荧光染色法检测磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)焦点的形成。结果显示:2、4、6、8 Gy剂量组及照射后不同时间点均以Hela细胞的存活分数(Survival fraction,SF)最高;CASP软件分析显示,DSB增加呈现时间和剂量依赖关系,照射后4 h尾矩(Tail moment,TM)增加最为明显,其中以MEC-1细胞增加最为显著;照射后0.5和4 h,γH2AX阳性细胞率达到100%,照射后24 h逐渐下降,其中Hela细胞下降最为明显。结果提示,克隆形成实验、中性彗星电泳和γH2AX焦点检测法的联合使用能有效预测肿瘤细胞辐射敏感性。     

小剂量电离辐射引起体细胞染色体不分离及其与拓扑异构酶Ⅱα的关系

探讨小剂量电离辐射对体细胞染色体不分离的影响，及与DNA拓扑异构酶Ⅱα（TopoisomeraseⅡα，TOPOⅡα）的关系。用培137^Cs γ，为辐射源与中期染色体计数法，研究了小剂量照射与人外周血淋巴细胞有丝分裂染色体不分离关系，发现照射对染色体不分离的影响具剂量效应、时间效应和次数累加效应；用Western blot和RT-PCR检测了照射对Hela细胞中TOPOⅡα表达的影响，也存在剂量效应、时间效应和次数累加效应；以TOPOⅡα抑制剂（VP-16）抑制Hela细胞中TOPOⅡα活性，也引起Hela细胞有丝分裂染色体不分离率增加，照射和抑制TOPOⅡα活性的协同作用加重对不分离的影响。结果提示TOPOⅡα表达的变化是小剂量照射引起有丝分裂染色体不分离的机制之一。     

辐射诱导细胞内凝溶胶蛋白变化及其对小鼠氧化损伤的影响

为研究凝溶胶蛋白(Gelsolin)在辐射损伤中的作用,以6、8和12Gyγ射线分别照射BALB/c小鼠和人小肠上皮隐窝细胞(HIEC).于照后不同时间抽提HIEC全蛋白,Western blot半定量法检测胞浆型Gelsolin(cGSN)蛋白相对含量.照射后24h给受照小鼠注射重组人源Gelsolin蛋白,不同照后...     

腺病毒载体携带HSV1-TK报告基因感染BMSCs后摄取~(131)I-FIAU的实验研究

用内部核糖体进入序列(IRES)将报告基因单纯疱疹I型病毒胸苷激酶(HSV1-TK)和治疗基因脑源性神经营养因子(BDNF)连接,双启动子法将TK-IRES-BDNF与增强绿色荧光蛋白(EGFP)包装到重组腺病毒载体中,得到Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP,扩增、纯化、测定病毒滴度;以感染复数(MOI)为0、50、100、150、200、250感染体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs),以重组腺病毒Ad5-EGFP为无效对照病毒。荧光显微镜下观察感染细胞的绿色荧光细胞阳性率。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测感染细胞增殖能力。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)诱导感染细胞向神经元细胞分化,显微镜下观察细胞形态变化。实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)和2-△△CT法分析两目的基因的相对表达量(CT)。观察感染细胞对131I-FIAU的摄取情况。重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP在MOI为150可高效感染BMSCs,感染细胞存活率98%,且保持良好的神经元细胞诱导分化能力。RQ-PCR检测两目的基因随着腺病毒MOI增加表达增强,且TK和BNDF两基因的表达有良好的线性相关(r=0.973,P0.05,n=3)。在前3h可见感染目的基因组细胞对131I-FIAU的摄取程度与时间呈正相关,3h感染目的基因组对131I-FIAU摄取率可达(31.42±0.46)%(n=3),随后增加不明显。各点感染目的基因组摄取率均显著高于对照组(t=23.06–173.83,P0.05,n=3)。重组腺病毒载体能高效、低毒感染BMSCs,IRES介导两目的基因表达有良好的线性相关。本研究表明感染目的基因细胞可有效介导HSV1-TK摄取131I-FIAU,为后续放射性核素报告基因活体显像示踪转基因BMSCs治疗脑梗死提供了细胞水平依据。     

肿瘤坏死因子促α粒子致细胞恶性转化的研究

实验以０．５Ｇｙ＾２３８Ｐｕ源α粒子照射后的斜利亚地鼠胚胎细胞为靶细胞，１０ｄ克隆形成实验评价人重且肿瘤坏死因子α促癌作用。通过传代的方法获得不同代龄的细胞，测定它们的生长速率、锚着独立性生长、裸鼠成瘤性等多项生物学指标。结果表明，人重组不死国α使０．５Ｇｙα粒子致叙利亚地鼠胚胎细胞转化频率增高２倍；经人重组肿瘤坏死因子α处理的０．５Ｇｙα粒子照射后的斜利亚地鼠胚胎细胞寿命明显延长，第４０代细胞的     

α辐射致细胞转化与基因突变

为探讨α辐射诱发体外细胞转化效应与hprt基因突变之间的相关关系。用体外培养的人胚肺细胞,经0．25－5Gyα粒子照射后,各受照射剂量组细胞兰固体琼脂培养集落形成能力明显增加,细胞获得了非锚着依赖性生长能力,说明人胚肺细胞在α辐射作用下发生了转化hprt基因突变检测。结果表明,随着α粒子照射剂量的增加,hprt基因变异系数逐渐增加。细胞转化与hprt基因突变相关分析证实,两者之间存在显著的线性正相关关系。研究结果显示,α辐射的致癌效应与hprt基因突变密切相关。     

小剂量辐射诱导哺乳动物细胞对基因突变的适应性反应

预先用小剂量γ射线照射小鼠SR-1细胞,然后观察其对随后大剂量γ射线照射诱发细胞hprt基因突变的影响。0.01 Gy小剂量一次预照射,18h、24h后能显著降低3Gy照射诱发SR-1细胞的hprt基因突变频率。细胞每天接受一次0.01Gy照射,共10d,累积剂量达0.1Gy后,6h就能产生上述效应,并可持续到小剂量刺激后的48h,hprt基因突变频率下降了30%—40%。     

电离辐射对神经干细胞分化的影响

为了研究电离辐射对神经干细胞分化的影响,用无血清培养技术对神经干细胞进行培养,在传代后将神经干细胞分为4组,分别用0Gy、0.5Gy、1Gy、2Gyγ射线进行照射,在不撤除EGF、bFGF条件下对细胞进行培养,7d后用免疫荧光方法对细胞进行巢蛋白(Nestin)检测。用同样的方法对神经干细胞进行照射,在培养基撤除EGF和bFGF后,用免疫荧光对神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)进行检测。培养的神经干细胞在经一定剂量射线照射后,与空白对照组比较,nestin阳性细胞较未经照射的细胞阳性率降低;经过照射的神经干细胞分化为神经元细胞的比例较未经照射的细胞增加。结果表明,电离辐射具有诱导神经干细胞分化的作用。电离辐射使神经干细胞分化为神经元的比例增加。     

骨髓瘤细胞与内皮细胞~(51)Cr粘附效应的研究

应用~(51)Cr标记人的多发性骨髓瘤(MM)细胞系U266、XG-7,着重研究了细胞因子对人MM系U266、XG-7——内皮细胞间粘附的调控作用及其对细胞表面粘附分子表达、细胞因子分泌的影响。主要结果表明:(1)IL-6及其IL-6Rgp130相关性生长因子(GM-CSF等)不仅是人MM细胞体内、外的生长因子,而且可以提高MM细胞——内皮细胞间的粘     

Egr-IFNγ重组质粒的构建和在B16细胞中的辐射诱导表达

小鼠IFNγ cDNA基因连接到Egr-1启动子的下游构建成Egr-IFNγ重组质粒,利用质脂体介导转染B16细胞,用ELISA方法检测x射线照射后IFNγ表达的剂量效应和时程。结果表明,实验组的表达水平明显高于对照组,其中20Gy和2Gy照射组高于其它实验组(p<0.01)。26y照射后6h IFNγ表达量最高(p<0.01)。转染后的B16细胞每隔24h接受2Gy x射线照射,结果显示第一次照射后表达量最高(p<0.01),然后逐渐降低。结果提示电离辐射可激活Egr-IFNγ重组质粒,并调节IFNγ基因表达,这项研究可能对肿瘤治疗的研究有一定的意义。     

辐射基因治疗黑色素瘤的实验研究

研究低剂量辐射结合腺病毒(AdCMV)载体介导的p53基因转导对人黑色素瘤A375细胞系基因转移效率和辐射敏感性的影响.用复制缺陷的重组腺病毒载体(AdCMV-p53)介导入p53基因转染1 Gy X-射线预辐照的A375细胞系,RT-PCR检测mRNA水平,流式细胞仪测定细胞周期阻滞及外源性P53蛋白表达情况,克隆形成率测定辐射后细胞存活率.用携带报道基因的复制缺陷重组腺病毒载体AdCMV-GFP作为对照.实验结果表明,1 Gy X-射线辐照可较高地增加AdCMV-p53对A375细胞的基因转导效率,转导的外源性野生型p53可在A375(wtp53)细胞中高效表达,并诱导细胞周期G1期阻滞;单纯转导p53对A375细胞无明显诱导凋亡和生长抑制效应;而转导p53后给予X-射线辐射,当剂量达到4 Gy及其以上时,48h后AdCMV-p53感染组细胞开始出现明显形态改变,克隆存活率明显低于AdCMV-GFP感染组和未感染组,显示存活曲线下移,4Gy时细胞存活率就减少了1个量级.小剂量辐射既可有效增加AdCMV-p53介导的p53转导,又不会对患者产生明显副作用;转导野生型p53的人黑色素瘤A375细胞系显示P53过表达;过表达的P53蛋白虽然对A375细胞无明显生长抑制及凋亡诱导作用,但可明显增加其辐射敏感性.这表明p53是基因治疗黑色素瘤较好的侯选基因,也为临床上放疗联合基因治疗黑色素瘤提供了实验室依据,即减轻临床上对于辐射敏感性差的肿瘤单纯大剂量照射或单纯基因疗法中rAd-p53制品用量过大而给病人造成的毒副作用.