L-苏氨酸发酵过程中乙酸的控制

大肠杆菌是表达外源基因常用的宿主菌,然而在培养过程中容易发生副产物乙酸的积累,不仅造成碳源的浪费,而且严重抑制菌体生长及外源基因的表达.本研究利用一株自主构建的大肠杆菌基因工程菌(MHZ0200-2)发酵生产L-苏氨酸.通过选择合适的发酵条件来控制其副产物乙酸的生成,从而提高L-苏氨酸的产量.L-苏氨酸的初始产量是0.09g/L,培养条件优化后产量提高到2.06g/L.     

L-2-氨基丁酸大肠杆菌生产菌株的构建

L-2-氨基丁酸作为新型药物的关键手性前体,在化工和制药行业应用广泛。该文以1株生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli) THRD为出发菌株,逐步延伸代谢途径,构建了L-2-氨基丁酸高产菌株。首先,分别把苏氨酸脱水酶编码基因ilv A2和ilv A4在THRD中过表达,菌株THRD/p Trc99a-ilv A2在5 L发酵罐中分批补料发酵,2-酮基丁酸积累量达到18 g/L。然后,分别与ilv A2串联表达酪氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶编码基因tyr B、gdh和bcdBS,将L-2-酮基丁酸转化为L-2-氨基丁酸,菌株THRD/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量达到19 g/L。最后,研究了阻断L-苏氨酸输出途径对发酵的影响,菌株THRDΔrht C/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量提升至22 g/L。因此,通过代谢途径延伸可以有效地将L-苏氨酸生产菌株转变为L-2-氨基丁酸生产菌株。该研究为L-2-氨基丁酸高产菌株的构建奠定了基础,且对其他延伸代谢途径获得新产品的代谢工程研究提供了参考。     

碳源对L-苏氨酸发酵的影响

以L-苏氨酸生产菌TRFC为供试菌株,研究了碳源对L-苏氨酸发酵的产量和糖酸转化率的影响。采用补料分批发酵工艺生产L-苏氨酸,利用氨基酸分析仪测定发酵液中L-苏氨酸的产量。确定了发酵的最佳碳源及其补料方式,通过10L罐补料分批发酵36h,产酸可达118.9 g/L,糖酸转化率为47.6%。     

以高浓度葡萄糖为碳源的L-苏氨酸发酵工艺研究

以L-苏氨酸生产菌TRFC为供试菌株,研究了高葡萄糖浓度下各种生长因子和培养条件对L-苏氨酸发酵的影响。结果表明,脯氨酸可以解除高浓度葡萄糖对L-苏氨酸发酵的抑制作用,生物素可以提高L-苏氨酸生产菌的细胞得率及L-苏氨酸的产量,利用摇瓶发酵确定最佳用量分别为60mg/L和120μg/L;控制pH7.0和采用控制溶氧的脉冲补料方式L-苏氨酸产量得到进一步的提高。在最优条件下,利用10L发酵罐发酵38h,L-苏氨酸产量可达110.2g/L,糖酸转化率为45.7%。     

代谢副产物对L-苏氨酸发酵的影响及应对措施

研究了L-苏氨酸的发酵过程,通过高效液相色谱和氨基酸分析仪测定了L-苏氨酸发酵液中的主要副产物为乙酸、乳酸、缬氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等。利用外源添加实验研究了各种代谢副产物对L-苏氨酸发酵的影响。结果表明乙酸浓度高于2 g/L、乳酸浓度高于10 g/L时对L-苏氨酸生产菌的生长和产酸有抑制作用,采用提高溶解氧和葡萄糖限制性脉冲流加措施将乙酸、乳酸的浓度控制在0.5 g/L以下,L-苏氨酸产量明显提高。     

大肠杆菌转运蛋白SstT和RhtC的改造对L-苏氨酸产量的影响

L-苏氨酸是一种必需氨基酸,广泛应用于食品、医药和饲料等领域。有报道表明降低胞内L-苏氨酸浓度,解除其对合成途径酶的反馈作用,有利于提高L-苏氨酸产量,因此,本实验利用Red重组技术和基因过表达技术,以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli TRFC为出发菌株,成功构建了TRFCΔsstT和TRFCΔsstT+pSTV28-rhtC。摇瓶发酵结果显示,与原菌相比,TRFCΔsstT的L-苏氨酸产量较原菌提高了4.00%,TRFCΔsstT+pSTV28-rhtC的L-苏氨酸产量较TRFCΔsstT+pSTV28提高了18.16%。此外,经检测发现重组菌株胞内L-苏氨酸浓度均低于原菌。最后进行了TRFCΔsstT+pSTV28-rhtC的5 L分批补料发酵实验,其L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别较原菌提高了15.33%和16.14%。综上所述,通过改造L-苏氨酸转运系统的SstT和RhtC蛋白,能有效地增强细胞内L-苏氨酸外排能力,降低细胞内L-苏氨酸的浓度,进而有利于L-苏氨酸产量的提高。     

L-苏氨酸产生菌的原生质体融合育种研究

采用原生质体融合等技术,以谷氨酸棒杆菌GY360 (Mer+ AECr+ AHVr)为亲株(A)与乳糖发酵短杆菌HS58 (Ala-+ AHVr )为亲株(B)进行原生质体融合,选育出一株产L-苏氨酸菌NRH66,该菌株遗传标记为Met-+ Ala-+ AEC+ AHVr,在摇瓶上发酵可产L-苏氨酸46.2g/L,比亲株A产酸提高了17.7%,比亲株B产酸提高64%.     

代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,利用基因重组技术替换ilvLXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,以期获得L-异亮氨酸生产菌.将ilvLXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilvLXGM后获得ILE01菌株,于该菌株中分别过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvIH及共表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,获得菌株ILE02和ILE03,其L-异亮氨酸产量分别达到1.75 g/L和2.19g/L.针对ILE03 α-酮丁酸积累量过高的问题,通过改变操纵子中ilvA和ilvIH的顺序调节其转录水平,获得菌株ILE04,其L-异亮氨酸产量达2.85 g/L.利用ILE04于5L发酵罐中进行发酵实验,L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/(L·h)及4.6％.     

高产L-苏氨酸的缺陷型大肠杆菌发酵条件优化研究

采用选育高产大肠杆菌,对原发酵培养基配方中葡萄糖、玉米浆和硫酸铵配比含量及摇瓶工艺的摇床转速、温度、培养基装液量和菌液接种量优化,测定不同条件下的L-苏氨酸含量。结果表明,以5%的接种量,37 ℃,220 r/min条件下,发酵培养基中葡萄糖含量为41.0 g/L、玉米浆含量为11.0 g/L和硫酸铵含量为20.0 g/L时,赖氨酸缺陷型菌株的L-苏氨酸产量为5.90 g/L,与优化前(4.06 g/L)相比产率提高了45.32%,甲硫氨酸缺陷型菌株的L-苏氨酸产量为5.76 g/L,比优化前相比(3.89 g/L)产率提高了48.07%。     

利用重组枯草芽孢杆菌产Bacillus pumilus来源的γ-谷氨酰转肽酶及其在L-茶氨酸合成中的应用

L-茶氨酸作为一种非天然氨基酸对人体健康具有多方面的功效,其作为食品饮品添加剂和制药原料的需求量日益增加。本文以安全菌株Bacillus subtilis 168作为宿主菌,表达生产B.pumilus来源的γ-谷氨酰转肽酶(GGT)。结果显示,该来源GGT成功在B. subtilis 168中实现了胞外分泌表达。最后,通过关键转化条件优化,并结合批次流加策略,该重组GGT能够在16 h催化合成50.8 g/L的L-茶氨酸,该结果可以和已报道的以大肠杆菌作为宿主菌表达GGT并催化合成L-茶氨酸的产量相媲美。     

重组枯草芽孢杆菌PaE菌株的构建及碳代谢阻遏效应研究

通过基因重组的方法,将枯草芽孢杆菌168的α-淀粉酶基因amyE（除掉启动子）整合在Paxo1质粒上,然后将重组表达质粒Paxo1-amyE导入枯草芽孢杆菌168菌株基因组中的半乳糖苷酶基因lacZ位点。通过转化筛选和重组基因分析,获得含有重组α-淀粉酶基因的工程菌株PaE。经过添加4 种不同的碳源发酵实验检测,在外加2 g/100 mL木糖诱导的情况下,重组菌株的α-淀粉酶产量均有增加。而且重组菌株在一定程度上能够克服葡萄糖等还原性糖引起的碳代谢阻遏现象,提高了α-淀粉酶产量。     

一株芽孢表面稳定展示海藻糖合酶工程菌的构建

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168-Tres基因组为模板,PCR扩增得到同源臂基因sleB1和cwlJ1,重叠PCR连接sleB1与卡那霉素抗性(kmr )基因,电转获得B. subtilis 168-TresΔsleB菌株;连接cwlJ1与博来霉素抗性(zeor)基因,电转获得B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ菌株。结果表明,经kmr、zeor抗性筛选及PCR鉴定,成功获得sleB、cwlJ基因双缺失菌株B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ;发酵结果显示,B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ与出发菌株的芽孢形成率一致,约为88%;在LB固体培养基和麦芽糖转化生成海藻糖体系中B. subtilis 168-Tres的芽孢萌发数为4.8×108 CFU/mL,B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwlJ芽孢未萌发;在麦芽糖转化生成海藻糖体系中,重组菌海藻糖合酶酶活为10.42 U,比原始菌提高了78.7%。敲除sleB、cwlJ基因后,不影响枯草芽孢杆菌生成芽孢的量,但能有效控制芽孢在上述转化体系中的萌发,使芽孢表面稳定展示海藻糖合酶,提高了芽孢的利用率。     

利用响应面法优化L-苏氨酸发酵条件

采用响应面设计方法对E.coli TRFC苏氨酸发酵培养基及培养条件进行了优化。用部分因子分析法研究了原始发酵培养基及培养条件对响应值的影响程度,发现蔗糖的质量浓度及接种量对苏氧酸产量的影响显著。利用最陡爬坡实验、中心旋转组合设计结合响应面分析确定了蔗糖的质量浓度及接种量(58.739 g/L,3.46%)。在优化条件下进行5L发酵罐实验,L-苏氨酸的产量达到121.20 g/L,比未优化条件下提高了12.43%。     

利用CRISPR-Cas9和Cre/loxP系统删除34个非必需基因构建L-苏氨酸生产菌

L-苏氨酸是一种被广泛应用于食品、饲料及医药等领域的必需氨基酸。大肠杆菌以葡萄糖为碳源合成L-苏氨酸的过程中,一些非必需基因的转录和翻译会消耗碳源。利用CRISPR-Cas9和位点特异性重组系统Cre/loxP,敲除了大肠杆菌MG1655基因组中puuE和ynaI区间的34个非必需基因（共30.372 kb）,获得了突变菌MG003,然后通过高表达L-苏氨酸合成途径中关键基因thrA*、thrB和thrC以及L-苏氨酸转运酶编码基因rhtA和rhtC提高L-苏氨酸产量。与对照菌MG1655/pFW01-thrA*BC相比,MG003/pFW01-thrA*BC生长加快,L-苏氨酸产量提高25.5%;MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA的L-苏氨酸产量提高了43.3%;MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC的L-苏氨酸产量提高了74.5%。研究结果表明,大肠杆菌基因组中34个非必需基因的删除有利于其提高L-苏氨酸合成能力。     

纳豆激酶基因工程菌的构建及酶活力分析

纳豆激酶由纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)的aprN基因编码,在体内外具有很强的溶解纤维蛋白活性。利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增B.subtilis natto的aprN基因,并依据B.subtilis的密码子偏好性优化了起始30个氨基酸的密码子,构建了重组表达质粒pHT01-aprN。经限制性酶酶切、PCR扩增和测序验证了其编码的正确性。通过电击法将含有强启动子的pHT01-aprN导入B.subtilis,利用氯霉素抗性筛选获得B.s 168/pHT01-aprN工程菌。经IPTG诱导表达,摇瓶发酵培养最高酶活力为(289.00±3.42)U/mL,是野生菌的3.9倍,酶活力表达稳定性良好。     

Difference in transcription levels of cap genes for gamma-polyglutamic acid production between Bacillus subtilis IFO 16449 and Marburg 168

In a strain carrying capB-lacZ fusion of Bacillus subtilis IFO16449, which produces a large amount of gamma-polyglutamic acid (PGA), beta-galactosidase activity was enhanced by about five times with the addition of L-glutamic acid. This increase was also confirmed by Northern blot analysis. On the other hand, the activity was not detected in a strain carrying capB-lacZ fusion of B. subtilis Marburg 168. However, when the cap genes (capBCA and ywtC) were fused to the IPTG-inducible spac promoter, B. subtilis Marburg 168 produced PGA. These results suggest that the inability of B. subtilis Marburg 168 to produce PGA is due to defective expression of the cap genes.     

枯草芽孢杆菌BJ3-2精氨酸脱羧酶基因speA的克隆与序列分析

根据GenBank中枯草芽孢杆菌168菌株的精氨酸脱羧酶基因speA序列设计特异性引物,提取Bacillus subtilis BJ3-2基因组DNA进行PCR扩增,并克隆至pGEM-T载体后测序。序列分析结果表明,Bacillus subtilis BJ3-2 speA基因ORF长为1 473 bp,可编码490个氨基酸,分子质量为53.53ku,基因登录号为KJ561348,与已报道枯草芽孢杆菌的speA基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达93%以上,精氨酸脱羧酶氨基酸序列系统进化树分析,发现Bacillus subtilis BJ3-2的ADC与Bacillus subtilis 168亲缘关系最近,属于典型的III型PLP依赖型鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族成员。speA基因序列分析及其蛋白保守结构域的分析,为有效控制水豆豉产品中生物胺含量的研究提供了理论依据。