基于基因转录和代谢物分析的异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌YILW的理性改造（英文）

为获得异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YILW的理性改造策略,考察该菌株与出发菌株C.glutamicum ATCC 13032异亮氨酸合成途径中关键酶及代谢产物的差异。结果表明,C.glutamicum YILW丙酮酸羧化酶编码基因pyc的下调表达使得其胞内草酰乙酸含量降低,过表达该基因显著增加胞内草酰乙酸含量及异亮氨酸产量(分别从1.32μmol/g(细胞干质量,下同)和5.18 g/L提高至3.32μmol/g和5.81 g/L),但副产物赖氨酸及胞内2-酮丁酸积累量提高。针对该问题采用强启动子替换手段过表达ilv BNC操纵子,使得其异亮氨酸产量提高至6.63 g/L。为进一步增加异亮氨酸合成,过表达输出载体编码基因brn E和brn F,其产量提高至7.31 g/L,较出发菌株C.glutamicum YILW提高41.1%,转化率提高40.0%。由此可见,在基因转录及代谢物分析结果指导下理性过表达pyc、ilv BNC操纵子及brn E和brn F能够显著提高异亮氨酸产量并降低副产物浓度。     

基于基因转录和代谢物分析的异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌YILW的理性改造

为获得异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）YILW的理性改造策略,考察该菌株与出发菌株C. glutamicum ATCC 13032异亮氨酸合成途径中关键酶及代谢产物的差异。结果表明,C. glutamicumYILW丙酮酸羧化酶编码基因pyc的下调表达使得其胞内草酰乙酸含量降低,过表达该基因显著增加胞内草酰乙酸含量及异亮氨酸产量（分别从1.32 μmol/g（细胞干质量,下同）和5.18 g/L提高至3.32 μmol/g和5.81 g/L）,但副产物赖氨酸及胞内2-酮丁酸积累量提高。针对该问题采用强启动子替换手段过表达ilvBNC操纵子,使得其异亮氨酸产量提高至6.63 g/L。为进一步增加异亮氨酸合成,过表达输出载体编码基因brnE和brnF,其产量提高至7.31 g/L,较出发菌株C. glutamicum YILW提高41.1%,转化率提高40.0%。由此可见,在基因转录及代谢物分析结果指导下理性过表达pyc、ilvBNC操纵子及brnE和brnF能够显著提高异亮氨酸产量并降低副产物浓度。     

代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,利用基因重组技术替换ilvLXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,以期获得L-异亮氨酸生产菌.将ilvLXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilvLXGM后获得ILE01菌株,于该菌株中分别过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvIH及共表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,获得菌株ILE02和ILE03,其L-异亮氨酸产量分别达到1.75 g/L和2.19g/L.针对ILE03 α-酮丁酸积累量过高的问题,通过改变操纵子中ilvA和ilvIH的顺序调节其转录水平,获得菌株ILE04,其L-异亮氨酸产量达2.85 g/L.利用ILE04于5L发酵罐中进行发酵实验,L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/(L·h)及4.6％.     

NCgl1221敲除和pyc过表达对谷氨酰胺发酵的影响

谷氨酰胺在生命活动中具有重要的作用,已被广泛应用于食品、医药等诸多领域。谷氨酸是谷氨酰胺生物合成的前体物质,也是谷氨酰胺生产过程中最常见的副产物。研究发现,NCgl1221基因的编码蛋白是谷氨酸分泌的重要载体,丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌回补途径中的关键酶。为减少谷氨酰胺发酵过程中谷氨酸的积累量并提高谷氨酰胺产量,本研究利用同源重组技术敲除谷氨酰胺生产菌GM34的谷氨酸分泌载体编码基因NCgl1221,获得GM34ΔNCgl1221菌株;构建了丙酮酸羧化酶基因pyc过表达菌株GM34-pXMJ19pyc。5 L罐发酵实验表明,NCgl1221基因缺失可以使得谷氨酸积累量降低19.05%,过表达pyc基因使得谷氨酰胺产量和转化率分别提高5.54%和2.37%。可见,敲除NCgl1221、过表达pyc能够有效降低谷氨酸分泌并提高谷氨酰胺产量。     

基于代谢途径改造谷氨酸棒杆菌生产L-缬氨酸

L-缬氨酸是一种重要的支链氨基酸，随着市场对其需求量的不断提升，进一步提高L-缬氨酸的产量和糖酸转化率具有重要意义。在该研究中，使用实验室保藏的谷氨酸棒杆菌VHL-1作为出发菌株，通过对L-缬氨酸合成路径进行代谢改造显著提高了L-缬氨酸的产量和丙酮酸前体物的供应。首先，通过敲除ldh(编码乳酸脱氢酶)、poxB(编码丙酮酸氧化酶)、pyc(编码丙酮酸羧化酶)基因以及弱化alaT(编码丙氨酸转氨酶)基因表达来实现丙酮酸的富集。其次，通过强启动子P_tuf替换ilvBNC操纵子原始启动子并增加ilvBN(编码乙酰羟酸合酶)基因拷贝数来增强丙酮酸向L-缬氨酸合成的碳代谢流。最后，通过过表达支链氨基酸转运蛋白编码基因brnFE和调节蛋白编码基因lrp增强L-缬氨酸胞外输出效率。最终构建的重组菌株VHL-9在5 L生物反应器中进行补料分批培养，L-缬氨酸产量可到达(82.5±5.6) g/L,生产强度为1.15 g/(L·h),糖酸转化率为0.302 g/g葡萄糖。     

过表达L-赖氨酸合成途径关键基因和ε-聚赖氨酸合成酶基因对ε-聚赖氨酸合成的影响

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是小白链霉菌(Streptomyces albulus)产生的一种具有广谱抑菌活性的次级代谢产物,作为一种新型天然食品防腐剂在食品工业领域获得了广泛应用。通过代谢工程手段提高ε-PL生产菌的产物合成能力是降低ε-PL生产成本的有效手段,但目前关于ε-PL生物合成的关键代谢节点和调控机制还不清晰,因此还缺乏有效的靶基因。该研究基于文献挖掘了5个L-赖氨酸合成途径关键基因pyc(丙酮酸羧化酶基因)、ppc(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)、zwf(6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因)、dapA(二氢吡啶二羧酸合成酶基因)、lysA(二氨基庚二酸脱羧酶基因)和1个ε-PL合成酶基因(pls),并借助基因过表达手段,寻找影响ε-PL生物合成的关键靶基因。研究结果发现,过表达ppc、pyc和pls能够有效促进S.albulus WG608合成ε-PL。在补料分批发酵方式下,过表达菌株OE-ppc、OE-pyc和OE-pls的ε-PL产量较出发菌株S.albulus WG608分别提高2.8%、9.9%和16.3%,单位菌体合成能力分别提高12.7%、2...     

L-异亮氨酸高产菌种的选育研究

以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)为出发菌株,利用低能氮离子束注入对其进行多次诱变,结合异亮氨酸氧肟酸盐(Ile Hx)等氨基酸结构类似物定向筛选,得到一株稳定的高产L-异亮氨酸菌株:摇瓶培养72 h,产酸可达21~22 g/L,在50 L发酵罐上发酵51 h,产酸可达32 g/L。     

代谢工程构建谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸

非蛋白氨基酸5-氨基乙酰丙酸是合成四氢吡咯化合物的前体物,被广泛应用于医药、农业和畜牧业。为提升5-氨基乙酰丙酸合成效率,该研究以谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032为出发菌株,首先敲除L-谷氨酸输出蛋白编码基因NCgl1221阻断其分泌,菌株5-氨基乙酰丙酸产量达到0.62 g/L。然后利用脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)脚手架体系组装关键酶谷氨酰-tRNA还原酶和谷氨酸-1-半醛氨基转移酶,当二者比例为2∶1时最有利于5-氨基乙酰丙酸的合成,产量为0.84 g/L;为增强三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环,分别通过过表达pyc、ppc和pckA强化回补途径,结合过表达gltA强化柠檬酸合成,结果表明以共表达pckA和gltA的效果最佳;在此基础上通过敲除aceA并过表达pntAB以增强α-酮戊二酸和NADPH供应,所获菌株ALA-10的5-氨基乙酰丙酸产量为1.47 g/L。该研究可为提升5-氨基乙酰丙酸的发酵合成效率提供参考。     

组成型过表达ido基因对4-羟基异亮氨酸合成的影响及其发酵培养基的响应面优化

为考察组成型过表达异亮氨酸羟化酶（isoleucine dioxygenase,IDO）基因ido对4-羟基异亮氨酸合成的影响,构建ido组成型表达质粒pXM01-ido及菌株HIL017,其ido转录量及IDO活性较诱导型过表达菌株HIL016显著提升,4-羟基异亮氨酸产量较HIL016提高19.4%。为进一步提高4-羟基异亮氨酸产量,通过Plackett-Burman试验确定HIL017发酵培养基中玉米浆、谷氨酸和FeSO4·7H2O用量为主要影响因素,利用最陡爬坡试验和响应面法确定其最优用量为玉米浆34.1 mL/L、谷氨酸2.98 g/L、FeSO4·7H2O 0.016 7 g/L,此时4-羟基异亮氨酸理论产量为5.57 g/L。验证实验结果表明,最佳条件下4-羟基异亮氨酸产量为5.53 g/L,较优化前提高19.7%。     

敲除aceA和gogat及过表达gltA对谷氨酸棒状杆菌GKGD合成α-酮戊二酸的影响

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)在生命活动中具有重要的作用,被广泛应用于食品、医药等领域。以α-KG生产菌谷氨酸棒状杆菌GKGD为出发菌株,敲除其异柠檬酸裂解酶编码基因ace A以增加异柠檬酸供应,获得GKGD-1,摇瓶发酵条件下其α-KG产量和转化率分别提高14.72%和9.76%;敲除谷氨酸合酶编码基因gogat以降低L-谷氨酸生成量,获得GKGD-2,其α-KG产量和转化率分别提高7.39%和5.43%,L-谷氨酸生成量降低52.87%;过表达柠檬酸合酶编码基因glt A以进一步增加前体物供应,获得GKGD-3,其α-KG产量提高35.9%;于7.5 L发酵罐经30 h发酵,GKGD-3α-KG产量达49.5 g/L,较出发菌株提高36.4%,L-谷氨酸生成量降低50%。敲除ace A和gogat并过表达glt A可显著提高α-KG产量并降低L-谷氨酸生成量。     

Distinct roles of two anaplerotic pathways in glutamate production induced by biotin limitation in Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium glutamicum is a biotin auxotrophic bacterium in which glutamate production is induced under biotin-limited conditions. During glutamate production, anaplerotic reactions catalyzed by phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) and a biotin-containing enzyme pyruvate carboxylase (PC) are believed to play an important role in supplying oxaloacetate in the tricarboxylic acid cycle. To understand the distinct roles of PEPC and PC on glutamate production by C. glutamicum, we observed glutamate production induced under biotin-limited conditions in the disruptants of the genes encoding PEPC (ppc) and PC (pyc), respectively. The pyc disruptant retained the ability to produce high amounts of glutamate, and lactate was simultaneously produced probably due to the increased intracellular pyruvate levels. On the other hand, the ppc knockout mutant could not produce glutamate. Additionally, glutamate production in the pyc disruptant was enhanced by overexpression of ppc rather than disruption of the lactate dehydrogenase gene (ldh), which is involved in lactate production. Metabolic flux analysis based on the 13C-labeling experiment and measurement of 13C-enrichment in glutamate using nuclear magnetic resonance spectroscopy revealed that the flux for anaplerotic reactions in the pyc disruptant was lower than that in the wild type, concomitantly increasing the flux for lactate formation. Moreover, overexpression of ppc increased this flux in both the pyc disruptant and the wild type. Our results suggest that the PEPC-catalyzed anaplerotic reaction is necessary for glutamate production induced under biotin-limited conditions, because PC is not active during glutamate production, and overexpression of ppc effectively enhances glutamate production under biotin-limited conditions.     

代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌促进L-异亮氨酸发酵合成的研究进展

L-异亮氨酸作为必需氨基酸具有多种生理功能,对人体和动物健康有重要的调节作用。微生物发酵是工业生产L-异亮氨酸的主要方式,而谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）是L-异亮氨酸发酵生产的主要菌株,主要通过筛选和随机诱变得到,其遗传背景不明且很难通过诱变进一步提高产量,因而通过代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸成为近年来研究热点。该文综述了近年来代谢工程改造谷氨酸棒杆菌促进L-异亮氨酸生物合成的相关研究,主要涉及代谢通量调控、解除反馈抑制、强化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）水平以及提高产物分泌能力等方面,对进一步改造菌株和促进L-异亮氨酸发酵合成具有一定的参考意义。     

全营养流加对谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸的影响

在谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸的过程中,发酵后期菌体活力变弱,副产物增多,是限制L-异亮氨酸产业化的主要因素。研究通过3个阶段全营养流加策略探究最适发酵条件。首先,为解决L-异亮氨酸发酵中后期菌种活力下降的问题,实验通过利用发酵中后期全营养培养基流加策略,使得L-异亮氨酸达到了33.0 g/L。其次,为了解决初始发酵培养基高营养抑制问题,采用低浓度初始发酵培养基偶联发酵过程流加全营养控制策略,L-异亮氨酸达到了36.8 g/L。最后,由于玉米浆的高用量造成发酵染菌、起泡过多及后提取困难等产生的问题,通过清洁氮源丝肽粉等比例替换玉米浆全营养流加实验,使得副产物缬氨酸(valine,Val),亮氨酸(leucine,Leu),丙氨酸(alanine,Ala)分别降低到1.4、0.8、0.5 g/L,比初始降低了82.5%、86.7%和88.9%。通过上述3个阶段全营养流加策略,使得L-异亮氨酸产量提升的同时,副产物生成也得到有效的抑制。     

常温常压等离子体诱变选育高产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）23798为原始菌株,对其进行常温常压等离子体（ARTP）诱变,以磺胺胍抗性和氨基酸与茚三酮特异显色为筛选标记,以期得到高产L-异亮氨酸的诱变谷氨酸棒杆菌,并对其遗传稳定性进行研究。结果表明,原始菌株23798经过ARTP诱变处理180 s后,经0.4 mg/mL磺胺胍抗性筛选、多孔板高通量筛选、发酵培养复筛,选育出一株高产L-异亮氨酸诱变谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）B1。该菌株在摇瓶中发酵培养48 h,L-异亮氨酸产量达18.5 g/L,比原始菌株提高62.03%,且遗传性状稳定。     

葡萄糖亚适量流加对谷氨酸棒杆菌产L-异亮氨酸的影响

通过动态调节葡萄糖对谷氨酸棒杆菌的供应速率,解决菌种在发酵产L-异亮氨酸不同时期对葡萄糖消耗能力差异的问题。实验结果表明,以谷氨酸棒杆菌YILM1504为供试菌株,在发酵初始葡萄糖添加量80 g/L、90%最大补糖速率的亚适量补糖工艺下,得到动态补糖速率为0（0～8 h）、5.40～7.47（8～14 h）、7.47～7.00（16～24 h）、7.00～5.20 g/（L·h）（24～40 h）,L-异亮氨酸达到44.32 g/L,糖酸转化率为19.63%。经代谢流对比分析发现,葡萄糖经戊糖磷酸途径和糖酵解途径代谢流之比为0.56,进入Ile的代谢流增强了18.92%,进入缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸的代谢流减弱了67.12%、72.21%、30.23%,该方法针对谷氨酸棒杆菌在细胞生长阶段与产酸阶段不同的耗糖能力,提供了精细的补糖速率策略,产酸高峰期明显延长,副产物积累比例得到降低,原料利用率大幅提升。     

磷酸盐对大肠杆菌发酵异亮氨酸的影响

探究磷酸盐浓度对大肠杆菌E.coli TRFP发酵生产L-异亮氨酸的影响。利用30 L发酵罐进行分批补料发酵试验,考察磷酸盐浓度对E.coli TRFP发酵生产L-异亮氨酸过程中生物量、比生长速率、L-异亮氨酸产量、发酵液中乙酸及NH4+浓度变化。结果表明,发酵初期维持低浓度磷酸盐(2 g/L KH2PO4),后期补加2 g/LKH2PO4可有效减缓菌体衰退,最终使菌体生物量和异亮氨酸产量分别提高了24.5%和12.7%,且副产物乙酸含量明显降低。     

基于响应面法优化谷氨酸棒杆菌发酵条件

该研究以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）P169为研究对象,以谷氨酸产量为主要评价指标,采用单因素试验和响应面法对其发酵条件进行优化,并进行摇瓶和20 L罐分批补料发酵验证。结果表明,谷氨酸棒杆菌P169产谷氨酸的最佳发酵条件为酵母粉41.0 g/L、葡萄糖27.0 g/L、尿素12.0 g/L和pH 7.0。在此优化条件下,谷氨酸产量达25.1 g/L,比优化前（16.5 g/L）提高了52.1%。以此为基料进行20 L罐分批补料发酵,谷氨酸产量达155 g/L,比优化前（142 g/L）提高了9.2%。该研究为提高谷氨酸棒杆菌谷氨酸产量提供了一种技术解决方案。     

高效合成L-高丝氨酸大肠杆菌基因工程菌株的构建

针对现有L-高丝氨酸生产菌株因营养缺陷需在发酵过程中添加L-苏氨酸等物质的问题,以大肠杆菌为底盘细胞,构建1株非营养缺陷型L-高丝氨酸高产菌株.首先通过下调thrB和thrC的转录弱化L-高丝氨酸的降解途径;并过表达thrA、ppc和pntAB以强化L-高丝氨酸合成代谢流、提高前体物以及辅酶供应;在此基础上过表达rht...     

谷氨酸棒状杆菌合成L-高丝氨酸的代谢改造与发酵条件探究

目的:本研究以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032为底盘细胞,构建1株L-高丝氨酸合成菌株并分析溶氧环境对其产物合成的影响。方法:首先通过外源添加0～40 g/L的L-高丝氨酸分析谷氨酸棒状杆菌的产物耐受性;随后,通过基因thrB敲除阻断L-高丝氨酸的降解途径,获得谷氨酸棒状杆菌重组菌H1;在此基础上利用挡板摇瓶进行细胞培养以增强发酵过程中氧气供给能力。结果:与大肠杆菌相比,谷氨酸棒状杆菌对L-高丝氨酸具有更强耐受性。研究中通过敲除基因thrB构建了L-苏氨酸缺陷型谷氨酸棒状杆菌重组菌H1,发现基础培养基中加入0.5 g/L的L-苏氨酸后,该重组菌生长恢复正常水平。挡板摇瓶条件下重组菌H1的L-高丝氨酸产量增加至836.7 mg/L,较普通摇瓶产量44.6 mg/L提高了17.76倍。结论:通过阻断L-苏氨酸的合成,成功构建L-高丝氨酸合成菌株谷氨酸棒状杆菌H1,并且发现利用挡板摇瓶增强发酵过程中供氧能力是促进谷氨酸棒状杆菌高效合成L-高丝氨酸的有效手段,为后续提高L-高丝氨酸发酵产量提供了参考。