食品中羊肉源性成分微滴数字PCR定量方法的建立

为了对肉制品中羊肉源性成分进行准确定量,该研究采用微滴数字PCR(dd PCR)技术对羊肉的单拷贝基因进行定量检测,根据基因拷贝数建立肉制品中羊肉源性成分dd PCR的定量检测方法。结果表明,通过向样品中添加牛肉作为内标,建立了基于DNA拷贝数与样品质量间线性关系对羊肉源性成分进行dd PCR内标定量的方法,实现了从靶基因拷贝数到样品质量间的一步转化。该方法在检测出0. 01%的羊肉源性成分时,检测结果达0. 12 copies/μL,能够对含量5%以上的羊肉源性成分进行准确定量。通过对已知成分的混合样品和市售样品进行检测,显示该方法能够准确检出不同样品中羊肉源性成分含量。因此,该方法在肉及肉制品中羊肉源性成分检测和掺假鉴别方面具有较大应用潜力。     

猪链球菌微滴数字PCR定量检测方法的建立

根据猪链球菌(Streptococcus suis,SS)gdh基因的保守序列设计特异性引物和Taq Man探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立可对其准确定量的微滴数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法进行比较分析。结果表明,该方法特异性良好,与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒无交叉反应;灵敏度优于qPCR,线性相关系数(R2)为0.991,呈良好线性关系,最低可检测到2.692 copies/μL的阳性质粒;稳定性好,变异系数为1.66%。临床样品定量检测结果表明,dd PCR具有敏感性高、特异性好等优点,能对qPCR检测的可疑样品进行精确定量。本研究建立的dd PCR能够准确定量检测SS,将为SS相关研究提供有益参考。     

食品和饲料中鹅源性成分微滴式数字PCR检测与定量分析

本研究利用微滴式数字PCR(droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)技术对食品和饲料中鹅源性成分进行检测与精确定量。选取鹅的单拷贝核基因作为靶基因,建立了鹅源性成分靶基因拷贝数与样品质量之间的线性关系;选取21种常见动物物种及鹅的9个品系对所设计的引物及探针的种间特异性和种内保守性进行了验证,并对该方法的检测下限(limit of detection,LOD)和定量检测下限(limit of quantification,LOQ)进行了验证,利用已知鹅源性成分含量的样品和市售商品对该方法的准确性和适用性分别进行了验证。结果表明,所设计的引物及探针具有良好的种间特异性和种内保守性,该定量检测方法的检测下限和定量检测下限分别为1 copy/μL和5 copies/μL,且该方法具有良好的准确性和适用性,可用于对食品和饲料中鹅源性成分进行检测和精确定量。     

猪圆环病毒3型微滴数字PCR定量检测方法的建立

猪圆环病毒3型是一种新型猪圆环病毒,可引起猪感染相关疾病。本实验根据猪圆环病毒3型的OPF2基因序列,设计引物探针,建立了可对其准确定量检测的微滴数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)方法。通过对dd PCR反应体系中的引物探针浓度和退火温度进行优化,得到dd PCR反应的最佳引物探针浓度比为800 nM:800 nM:400 nM;最佳退火温度为60℃。该dd PCR方法的标准曲线相关系数(R2)为0.999,呈良好的线性关系;灵敏度高,可达4.4 copies/μL;特异性良好,与常见猪病原无交叉反应。通过对临床样品的检测结果证明,本研究建立的猪圆环病毒3型dd PCR检测方法比实时荧光PCR检测方法的灵敏度高1个数量级,检测结果与荧光PCR定性结果一致,并且可对可疑样本进行定量分析。结果表明:新建立的dd PCR方法灵敏度高、特异性强,可用于猪圆环病毒3型的定量检测。     

肉制品中羊源性成分微滴数字PCR法定量检测方法的研究

为准确定量肉及肉制品中羊源性成分的含量,建立了微滴数字PCR定量检测系统。结果显示在一定范围内羊肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,选择DNA含量作为中间换算值,计算出羊肉的质量与拷贝数之间的关系为M_羊=0.03C+0.69。应用建立的微滴数字PCR定量检测方法对已知质量分数的羊肉模拟混合样品进行检测,发现无论在两两混合还是多肉样混合的情况下,其含量偏差最大为1.52%,具有较强的抗干扰能力。通过对市售样品的检测,显示该方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现可能存在掺假现象,说明该检测方法具有良好的市场应用前景。本实验建立的微滴数字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分检测方面具有较大的应用潜力,为肉制品日常检测及是否掺假提供有力的科学依据。     

数字PCR定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌方法的研究

目的建立微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的分析方法。方法选择基因hly A为靶序列,设计PCR扩增引物和Taq Man探针,优化反应条件和反应体系,通过细菌分离和dd PCR方法对靶标基因的检测特异性、灵敏度和重复性进行实验,并对定量结果进行分析。结果 ddPCR反应中的最佳探针浓度为5 pmol/μL,特异性好,检出限为(3.6±0.1)copies/20μL,重复性实验良好,标准偏差为0.067%。ddPCR的拷贝数(copy number)与细菌密度(colony forming units,CFU/mL)形成了较好的线性关系。结论本研究建立dd PCR的拷贝数和菌液密度或菌落数的线性关系,可以为单核细胞增生李斯特氏菌的快速定量检测提供参考。     

应用荧光聚合酶链式反应检测冷冻羊肉卷中羊肉的含量

目的:探索应用荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测冷冻羊肉卷中羊肉含量。方法:以羊线粒体细胞色素B基因为羊特异性基因,线粒体12S rRNA为内参基因,应用ΔCt法对羊肉含量进行相对定量,并与称重法进行比较,分析基因拷贝数和羊肉脂肪含量对定量结果的影响。结果:荧光PCR法建立的标准曲线在羊肉含量为1%~100%时具有良好的线性关系(R~2=0.990 1)。检测7个市售冷冻羊肉卷样品,荧光PCR方法检测出的羊肉含量与称重法羊肉含量的相关系数为0.945 0(P0.001),平均绝对差异为-11.0%,95%可信区间为(-7.4%,-14.6%)。基因拷贝数不同和羊肉脂肪含量不同对内参基因扩增Ct值影响没有统计学意义(P值分别为0.072和0.206)。结论:荧光PCR法可用于快速检测冷冻羊肉卷中羊肉成分的相对定量。     

微滴式数字PCR对肉制品中羊肉和猪肉定量分析

为了实现肉制品中羊肉和猪肉的量化研究,本文应用微滴式数字PCR对肉制品进行定量检测。通过在看家基因上设计单拷贝特异性引物,能更好的鉴别是人为因素的掺假还是在加工过程中无意的带入。根据dd PCR的结果显示,在一定范围肉质量和DNA的浓度,DNA浓度和DNA拷贝数(C)成现一定的线性关系。通过人为掺假及市售样品检测以验证此方法。以DNA浓度作为中间换算值,得到肉质量和DNA拷贝数之间的换算关系M_羊=0.12C-10.6 M_猪=0.07C+4。通过对已知掺假比例的肉样及市售样品进行检测,能够较好的得到掺假肉的质量。目前市场上存在一定的掺假现象且该检测方法具有一定市场应用前景,本文建立的微滴式数字PCR在羊肉和猪肉及其制品中的掺假检测具有较强的应用潜力,对目前混乱的肉制品掺假的市场监管提供了科学的依据。     

乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法

目的：为快速准确检测乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌,建立实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。方法：根据嗜酸乳杆菌NCFM的SPIDR保守区域设计特异性引物与探针,借助建立的实时荧光定量PCR方法进行特异性、灵敏度、重复性以及抗干扰能力验证,并利用模拟样品对方法进行检验,最后对市售的实际样品进行检测。结果：该方法的特异性较好;方法的绝对灵敏度达到3pg,相对灵敏度达103 CFU/mL;重复性检测表明相对标准偏差在2.6%以下。同时进行杂菌干扰实验,在纯基因组水平和培养物水平混合大肠杆菌,扩增均无明显影响,表明建立的方法抗干扰能力较好。利用建立的实时荧光定量PCR方法对模拟样品进行检测并建立标准曲线,得出R2为0.987,线性较好,可进行实际样品的检测。对市售的11 份样品进行检测,其中6 份含有嗜酸乳杆菌菌株,5份不含嗜酸乳杆菌菌株,标记嗜酸乳杆菌的样品全部检测出嗜酸乳杆菌且含量在5.83×102～3.68×104 CFU/mL之间。结论：建立的实时荧光定量PCR方法可快速、准确地检测出乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌。     

液滴数字PCR定量检测鸭血制品中掺假成分

鸭血制品作为市场常见商品,掺假现象十分严重。选取鸡、鸭、鹅基因组中的特异性单拷贝基因为靶基因,设计引物和探针,建立鸡、鸭、鹅血微滴数字PCR定量检测方法。使用人工混合样品对该方法的准确性进行验证,同时通过检测市售样品来验证方法的适用性。实验结果表明,样品含量在1~1000 μg/mg时,靶基因拷贝数与样品质量之间具有良好的线性关系,检测限和定量限分别为5 μg/mg和1 μg/mg。通过人工混合样品和市售样品检测证明,该方法具有良好的准确性和适用性,可用于对鸡、鸭、鹅血制品的定量检测。     

基于全自动核酸提取的荧光定量PCR鉴别羊肉制品真伪

摘要：目的 建立一种基于自动化的快速核酸提取方法,联合三重实时荧光定量PCR技术,提高羊肉制品真伪鉴别的检测效率。方法 分别采用全自动核酸提取法、磁珠手提法与柱提法对不同状态羊肉制品进行核酸提取,比较不同方法的提取时间差异,通过三重实时荧光定量PCR扩增结果评估不同方法的提取效果。以国标法为对照,对市售的羊肉制品进行平行检测,评估本方法的检测性能。结果 与磁珠手提法、柱提法相比,全自动核酸提取法的提取时间缩短了15-30 min,且提取的核酸扩增效果更好。全自动核酸提取法在羊猪混合样本中羊源核酸检出限为0.010 mg·g-1。全自动核酸提取法在生鲜肉、生肉及熟肉制品等多种类型产品中提取的羊源核酸PCR检测结果的CV值均<3.000%。分别采用三重实时荧光定量PCR法与国标法对全自动提取的21份市售的涵盖不同类型的羊肉制品核酸进行平行检测,符合率为100.00%。结论 本研究方法可为羊肉制品掺假的快速真伪鉴别提供操作简便、稳定灵敏、快速准确的整套解决方案。     

微滴式数字聚合酶链式反应精准定量检测羊肉中掺杂猪肉

以羊和猪的单拷贝持家基因DNA复制蛋白A1为靶基因设计合成了适用于微滴式数字聚合酶链式反应的特异性引物和探针,通过理论推导获得了单位质量两种肉基因拷贝数之比的固定值,并进行了验证,据此将样品中羊肉和猪肉的拷贝数转换为相对质量分数,从而建立了羊肉中掺杂猪肉的精准定量检测方法。该方法可以很好地应用于羊肉中掺杂猪肉的含量检测,猪肉的最低定量限为1%,在5%~80%范围内绝对误差小于±1.30%,相对误差小于±10%,定量结果准确、重复性高,可以为肉类掺假的监管工作提供有力的技术参考。     

实时荧光PCR定量检测肉制品中猪源性成分

为了准确可靠地对肉制品中猪源性成分进行定量检测,通过生物信息学方法筛选到猪细胞核单拷贝基因(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 2-like,CACA).以CACA基因为扩增靶标,设计了特异性引物、TaqMan探针,建立了基于实时荧光定量PCR...     

实时荧光PCR定量测定肉制品中羊源性成分

为准确定量肉制品中羊源性成分的含量,以羊单拷贝基因为扩增靶基因,设计合成羊源的引物、探针,制备羊源和脊椎动物通用基因的重组质粒以构建标准曲线,通过方程算出各自的拷贝数,根据拷贝数的比值计算样品中羊肉源成分占总肉成分的百分比含量,建立荧光定量PCR检测体系,并对已知目标肉含量的混合肉样进行定量检测。结果显示,该方法具有良好的特异性和灵敏度,最低检测到羊的DNA含量为0.02 ng/μL。对已知目标肉含量的混合肉样进行定量检测发现,羊肉掺入量为90%、50%时所得结果相对准确,相对标准偏差分别为5.69%和10.82%, 且不受外源物种的干扰。本试验建立的定量PCR方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现存在掺假现象。     

基于实时荧光定量PCR和数字PCR的肉制品中牛源性成分检测

为了能够快速有效的检测出肉制品中牛源性成分,采用实时荧光定量PCR和数字PCR检测方法,检测肉制品中牛源成分。先依据牛肉单复制基因组特异区域,通过多序列比对设计特异性引物与探针,再利用苯酚-氯仿法提取标准品基因组DNA,确立实时荧光定量PCR和数字PCR两种方法的反应条件,测定DNA模版纯度及浓度可得实验提取的DNA溶液不含杂质,在此基础上构建牛源性成分荧光定量PCR标准曲线,检测两种方法的特异性、抗干扰性与肉制品中牛源性成分。分析实验结果可知,引物与探针在两种方法中均对牛肉有荧光信号显示,两种方法具有牛源性特异性,检测数值与实际样品数值基本一致,且两种方法抗干扰性较好,当存在其他肉类干扰时,仍可准确监测出牛源性,两种方法的最大误差分别为3.8%和4.0%;可定量检测不同肉制品中牛源性成分,两种方法均未检测出样品10牛肉丸中牛源性成分,验证了市面上确实存在假肉情况。说明所用方法能够准确、快速地检测出肉制品中的牛源性成分,适用于市场中肉制品的检测,对保障消费者的权益和健康具有十分重要的意义。     

应用实时荧光PCR技术量化检测羊肉中猪源性和鸡源性成份

目的建立羊肉中猪源性成份和鸡源性成份的定量检测方法。方法以新鲜羊、猪和鸡瘦肉为样本提取DNA分子作为检测模板,针对基因组中单拷贝基因设计特异性的引物和探针,应用荧光实时定量PCR技术对模板DNA进行扩增。通过绘制扩增标准曲线和确定羊、猪和鸡的质量与DNA比值常数,对4种不同掺混比例的混合肉样进行定量分析。结果检测质量百分比的绝对误差可以控制在7%以内,量化结果基本准确。结论对于组织成份单一的样品,可以通过在基因组单拷贝基因上设计特异性的引物,利用PCR技术实现在质量水平上对食品中动物源性成份的量化分析,该技术方法的建立可以为肉类掺假的监管工作提供有力的技术支撑。     

种属特异性PCR法鉴别罐头食品中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分

建立适用于肉类罐头等长时间高温加工食品中猪、牛、羊、鸡、鸭5种动物源成分种属特异性PCR鉴别方法。通过使用猪、牛、羊、鸡、鸭的种属特异性引物,对5种动物的总DNA模板进行PCR扩增,得到分别为212、147、202、131、201 bp的扩增产物,将测序结果在美国国家生物技术信息中心(US National Center for Biotechnology Information,NCBI)进行BLAST比对确认实验的准确性,并对市售罐头样品进行检测。该方法 5种动物引物种属特异性良好,对猪、牛、羊、鸭源性成分的检测灵敏度可达1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%。在对市售肉类罐头样品的检测中,6.6%样品与标签标注结果不符。该方法操作简便,成本低,结果准确可靠,可广泛用于肉类罐头食品和长时间高温加工食品中猪、牛、羊、鸡、鸭5种动物源成分的鉴别,具有十分广泛的实际应用价值。     

利用LAMP技术快速检测羊肉制品中的鼠源性成分

为实现羊肉制品中鼠源性成分的定性检测,基于环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术,以鼠的线粒体基因（大鼠环氧化酶基因KP244683.1和小鼠的16S rRNA基因KY018919.1）为靶标,分别设计相应的LAMP特异性引物,通过优化反应条件,确定最佳LAMP反应体系。对混合模拟样品进行特异性、灵敏度和稳定性评估,应用LAMP和聚合酶链式反应检测方法分别对市售羊肉制品进行检测,对比分析检测结果。结果表明,本研究建立的LAMP方法特异性强,大鼠和小鼠的检出限分别为0.1%和0.5%,稳定性好,LAMP与聚合酶链式反应市售实际样本检测结果具有高度的一致性。因此,本实验建立的鼠源性成分LAMP检测方法操作简便、高效、准确,为鼠肉掺假快速诊断和基层诊断提供了新的选择,可作为羊肉制品中鼠源性成分的快速检测新方法。     

PCR方法快速鉴别食品中肉的种类

本文针对食品中肉成分种类鉴别开发了一种快速灵敏的PCR检测方法,可检测食品中是否存在猪肉、牛肉、羊肉以及鸡肉等成分。采用微波助提法提取样品中DNA,简化了前处理步骤,可在短时间内完成从多种不同类型肉与肉制品中提取肉成分DNA。为了评价方法的可靠性与灵敏度,猪肉以及掺入了不同比例浓度猪肉成分的食品样品采用本方法进行了核酸提取与PCR分析。检测结果表明,方法可检测出低至含有0.5%浓度的猪肉成分的混合样品。随机抽取50份不同类型的市面食品样品,检测出5份食品含有猪肉成分,7份食品中含有牛肉成分,5份食品中含有羊肉成分。该样品前处理方法、DNA提取方法以及PCR检测方法可广泛应用于食品中肉成分种类的检测鉴别。