四种基因定量方法对实时荧光PCR与微滴式数字PCR检测霍乱弧菌基因表达量的分析

基因表达量测定对基因功能解析和探索生命机理具有重大意义,目前实时荧光PCR和微滴式数字PCR技术是进行基因表达量测定的有效方法。本文以低温处理的霍乱弧菌sfs、vcc、Rec A、hly及16S r RNA基因为研究对象,分别用实时荧光PCR和微滴式数字PCR技术对低温处理前后霍乱弧菌的上述基因表达量进行测定,实时荧光PCR实验数据分别采用??CT和ge Norm法进行分析,微滴式数字PCR实验数据分别采用相对定量和绝对定量法进行分析,获得处理组基因表达量相对于对照组的变化倍数;使用多维尺度法来分析四种基因定量方法的数据。结果表明,在本实验条件下,四种基因定量方法的分析结果存在差异;16S r RNA基因表达量发生了变化,不适合作为内参基因;微滴式数字PCR能更直观的给出基因表达量变化的结果,并且基因表达差异相对定量分析的准确度更高。     

微滴式数字PCR对肉制品中羊肉和猪肉定量分析

为了实现肉制品中羊肉和猪肉的量化研究,本文应用微滴式数字PCR对肉制品进行定量检测。通过在看家基因上设计单拷贝特异性引物,能更好的鉴别是人为因素的掺假还是在加工过程中无意的带入。根据dd PCR的结果显示,在一定范围肉质量和DNA的浓度,DNA浓度和DNA拷贝数(C)成现一定的线性关系。通过人为掺假及市售样品检测以验证此方法。以DNA浓度作为中间换算值,得到肉质量和DNA拷贝数之间的换算关系M_羊=0.12C-10.6 M_猪=0.07C+4。通过对已知掺假比例的肉样及市售样品进行检测,能够较好的得到掺假肉的质量。目前市场上存在一定的掺假现象且该检测方法具有一定市场应用前景,本文建立的微滴式数字PCR在羊肉和猪肉及其制品中的掺假检测具有较强的应用潜力,对目前混乱的肉制品掺假的市场监管提供了科学的依据。     

应用实时荧光PCR技术量化检测羊肉中猪源性和鸡源性成份

目的建立羊肉中猪源性成份和鸡源性成份的定量检测方法。方法以新鲜羊、猪和鸡瘦肉为样本提取DNA分子作为检测模板,针对基因组中单拷贝基因设计特异性的引物和探针,应用荧光实时定量PCR技术对模板DNA进行扩增。通过绘制扩增标准曲线和确定羊、猪和鸡的质量与DNA比值常数,对4种不同掺混比例的混合肉样进行定量分析。结果检测质量百分比的绝对误差可以控制在7%以内,量化结果基本准确。结论对于组织成份单一的样品,可以通过在基因组单拷贝基因上设计特异性的引物,利用PCR技术实现在质量水平上对食品中动物源性成份的量化分析,该技术方法的建立可以为肉类掺假的监管工作提供有力的技术支撑。     

基于实时荧光定量PCR和数字PCR的肉制品中牛源性成分检测

为了能够快速有效的检测出肉制品中牛源性成分,采用实时荧光定量PCR和数字PCR检测方法,检测肉制品中牛源成分。先依据牛肉单复制基因组特异区域,通过多序列比对设计特异性引物与探针,再利用苯酚-氯仿法提取标准品基因组DNA,确立实时荧光定量PCR和数字PCR两种方法的反应条件,测定DNA模版纯度及浓度可得实验提取的DNA溶液不含杂质,在此基础上构建牛源性成分荧光定量PCR标准曲线,检测两种方法的特异性、抗干扰性与肉制品中牛源性成分。分析实验结果可知,引物与探针在两种方法中均对牛肉有荧光信号显示,两种方法具有牛源性特异性,检测数值与实际样品数值基本一致,且两种方法抗干扰性较好,当存在其他肉类干扰时,仍可准确监测出牛源性,两种方法的最大误差分别为3.8%和4.0%;可定量检测不同肉制品中牛源性成分,两种方法均未检测出样品10牛肉丸中牛源性成分,验证了市面上确实存在假肉情况。说明所用方法能够准确、快速地检测出肉制品中的牛源性成分,适用于市场中肉制品的检测,对保障消费者的权益和健康具有十分重要的意义。     

实时荧光PCR定量检测肉制品中猪源性成分

为了准确可靠地对肉制品中猪源性成分进行定量检测,通过生物信息学方法筛选到猪细胞核单拷贝基因(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 2-like,CACA).以CACA基因为扩增靶标,设计了特异性引物、TaqMan探针,建立了基于实时荧光定量PCR...     

实时荧光定量PCR技术在肉及肉制品中的应用

实时荧光定量PCR技术作为一种DNA定量检测的工具,可应用于肉制品种类鉴别和定量分析中。相比于传统感官和理化的鉴别方法,该技术具有灵敏性高、特异性强、操作简便、省时省力等特点。使用Taq Man荧光探针和荧光染料可以直接测定PCR循环后产物的总量,确定扩增DNA片段的种类及数量,从而确定肉品种类及添加量。因此,可以将该技术应用到肉制品成分及安全的检测中。本文介绍了实时荧光定量PCR技术的基本原理,主要综述了该技术在肉品种类鉴定方面的应用,简述其在肉制品细菌污染检测的应用,并对该技术在肉类研究中的应用进行展望。      

非洲猪瘟病毒核酸荧光定量PCR检测方法研究

目的 建立非洲猪瘟病毒核酸的荧光定量PCR检测方法, 并与微滴式数字PCR检测方法的优缺点进行比较。方法 根据非洲猪瘟病毒保守基因VP72和K205设计合成引物和探针, 探究荧光定量PCR检测方法的反应条件和方法的特异性、线性、灵敏性和重复性, 及其与微滴式数字PCR检测方法灵敏度差异。结果 本研究建立的非洲猪瘟病毒核酸荧光定量PCR检测方法检出限达到0.1 fg/反应, 在0.1~500.0 fg/反应范围内呈现良好的线性关系, 检测重复性变异系数均低于1%, 不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒发生交叉反应。结论 本研究建立的荧光定量PCR法灵敏度高、特异性强, 适用于猪肉及其制品中非洲猪瘟病毒的检测。     

中药材浙贝母的实时荧光定量PCR方法研究

目的:探讨荧光定量PCR对浙贝母鉴别的可行性。方法:采用实时荧光定量PCR法从试样中提取DNA,进行引物扩增,并通过Cq值和扩增曲线对样品进行判断。结果:4批浙贝母的Cq值均低于30,曲线有明显的指数增长期;平贝母、川贝母和土贝母则无Cq值,曲线为一直线。结论:本方法用于鉴别浙贝母操作简单,准确率高,重现性好,可行有效。     

实时荧光定量PCR技术在食用油脂检测中的应用

荧光定量PCR检测技术具有快速、准确的优点,在转基因食品检测等领域得到了广泛的应用。采用荧光定量PCR技术进行油脂转基因、掺假检测也成为研究热点。利用不同油料作物所含有的独特核酸序列,采用荧光定量PCR技术可简单、高效、快速地检测出油脂中所含的特定核酸成分,从而判定油脂原料的构成,为打击食用油脂掺假造假提供判定依据。植物油的加工过程中都经过多个步骤的处理,其中的核酸降解严重,含量极低,所以从植物油中提取出较高质量的DNA是对油脂进行荧光定量PCR检测鉴定的关键。本文主要对油脂DNA提取方法及存在的难点、引物设计特点和结果分析进行了论述,以期为今后荧光定量PCR检测技术进一步推广与应用提供思路。     

微滴式数字PCR和实时荧光PCR在豆奶饮料转基因成分检测中的应用

为探索数字PCR在转基因成分筛选检测中的应用,解决现行转基因食品标准实施中的问题,完善我国转基因食品的检测监管体系。本文选取转基因启动子Ca MV35s和终止子NOS基因为靶标,大豆内源基因Lectin为内标,以转基因大豆标准品分别测定数字PCR和实时荧光PCR的浓度和含量检测低限,并应用于30批次豆奶饮料转基因成分实测。结果表明,数字PCR在转基因筛查的浓度检测低限达到0.04ng/反应,含量检测低限达到0.05%,均优于实时荧光PCR(0.2ng/反应,1%),且能够满足最严欧盟转基因标识阈值0.9%的检测要求。在豆奶饮料实际应用中发现,26批次样品两个平台检测结果一致为阴性,1批次一致为阳性,3批次Ct值在34.59～38.28之间的样品经数字PCR检测得到确切结果,说明数字PCR可辅助确认RT-PCR可疑结果,解决现行标准判定难题。     

微滴式数字PCR与实时荧光PCR检测羊肉制品中羊源和猪源性成分方法的比较

参考外文文献中羊肉和猪肉的特异性引物及TaqMan探针,分别建立一种定量检测羊肉制品中羊源和猪源性成分的微滴式数字PCR方法,并将该方法与标准SN／T 2051－2008中实时荧光PCR方法做对比来检测3份羊肉制品中的羊源和猪源性成分。结果表明,实时荧光PCR方法检测5号、9号、23号样品中的羊源性成分的Ct值分别是14?424／19?214、18?345／20?147、17?321／20?542;猪源性成分的 Ct 值分别是18?923／34?483、20?121／28?963、20?352／33?851;微滴式数字PCR方法检测5号、9号、23号样品中的羊源和猪源性成分的DNA拷贝数分别为236／0 copies／μL、421／0?3copies／μL、402／0?11copies／μL。表明两种方法均能检出3份样品中均含有羊源和猪源性成分,而微滴式数字PCR方法能够对DNA模板定量分析。结论：在肉种成分真伪鉴定上,微滴式数字PCR方法较实时荧光PCR方法更科学、准确。     

常见肉类中鸭源性成分荧光PCR检测方法的建立

目的通过筛选引物、探针体系,优化PCR反应条件,建立常见肉品中鸭源性DNA的荧光PCR检测方法。方法针对线粒体基因设计50对引物探针,以鸭DNA为模板,利用PCR和荧光PCR方法筛选引物探针并确定反应条件,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,最终确定荧光定量PCR方法的引物、探针及反应条件。结果当样本含量为0.1%时,本方法仍可特异、灵敏地检出鸭肉成分,检测Ct值可稳定在20以下。结论建立了常见肉品中鸭源性DNA的荧光PCR检测方法,可用于肉类制品中鸭源性成分的鉴定。     

基于全自动核酸提取的荧光定量PCR鉴别羊肉制品真伪

摘要：目的 建立一种基于自动化的快速核酸提取方法,联合三重实时荧光定量PCR技术,提高羊肉制品真伪鉴别的检测效率。方法 分别采用全自动核酸提取法、磁珠手提法与柱提法对不同状态羊肉制品进行核酸提取,比较不同方法的提取时间差异,通过三重实时荧光定量PCR扩增结果评估不同方法的提取效果。以国标法为对照,对市售的羊肉制品进行平行检测,评估本方法的检测性能。结果 与磁珠手提法、柱提法相比,全自动核酸提取法的提取时间缩短了15-30 min,且提取的核酸扩增效果更好。全自动核酸提取法在羊猪混合样本中羊源核酸检出限为0.010 mg·g-1。全自动核酸提取法在生鲜肉、生肉及熟肉制品等多种类型产品中提取的羊源核酸PCR检测结果的CV值均<3.000%。分别采用三重实时荧光定量PCR法与国标法对全自动提取的21份市售的涵盖不同类型的羊肉制品核酸进行平行检测,符合率为100.00%。结论 本研究方法可为羊肉制品掺假的快速真伪鉴别提供操作简便、稳定灵敏、快速准确的整套解决方案。     

不同酸奶微生物的实时荧光定量PCR比较研究

采用实时荧光定量PCR技术对不同酸奶中乳酸菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和大肠菌群等主要微生物进行了比较研究。结果表明,不同酸奶中乳酸菌总数和大肠菌群均显著高于国家标准。不同酸奶中乳酸菌总数差异显著,1号酸奶比2号高63%,而3号又是1号的2.45倍。1号酸奶的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌明显高于2号或3号,而2号和3号却差异不明显。     

微滴式数字聚合酶链式反应精准定量检测羊肉中掺杂猪肉

以羊和猪的单拷贝持家基因DNA复制蛋白A1为靶基因设计合成了适用于微滴式数字聚合酶链式反应的特异性引物和探针,通过理论推导获得了单位质量两种肉基因拷贝数之比的固定值,并进行了验证,据此将样品中羊肉和猪肉的拷贝数转换为相对质量分数,从而建立了羊肉中掺杂猪肉的精准定量检测方法。该方法可以很好地应用于羊肉中掺杂猪肉的含量检测,猪肉的最低定量限为1%,在5%~80%范围内绝对误差小于±1.30%,相对误差小于±10%,定量结果准确、重复性高,可以为肉类掺假的监管工作提供有力的技术参考。     

肉制品中鸭源性成分的实时荧光PCR检测

目的：建立基于实时荧光PCR技术的鸭源性成分的快速检测方法。方法：以鸭线粒体DNA序列为目的基因,设计并筛选了鸭源性特异性引物及探针,进行荧光定量PCR扩增,建立鸭源性成分检测方法。通过特异性、灵敏性、及盲样检测试验,对该体系进行验证。结果：该方法能够快速有效的检测鸭源性成分,具有较强的特异性及灵敏性,灵敏度约为0．01％（质量分数）;通过市售盲样肉制品的检测,表明该体系可用于定性检测加工肉制品中的鸭源性成分。结论：该方法特异性强,灵敏度高,可用于对肉制品中鸭源性成分的掺假鉴别。     

微滴数字PCR方法检测畜肉食品中鸭源性成分

目的利用微滴数字PCR技术,建立鸭源性成分的快速、特异、灵敏检测方法。方法根据鸭线粒体基因全序列设计的引物及探针,利用微滴数字PCR进行扩增,建立鸭源性成分检测方法;以市场中常见畜禽肉为参考物种作微滴数字PCR特异性检测;以羊肉为干扰物观察微滴数字PCR的抗干扰性;将鸭肉DNA进行梯度稀释,对方法灵敏度进行检测。结果该方法能够有效对鸭源性成分进行检测,特异性强,灵敏度高,并且其他物种成分的存在对方法灵敏度检测没有影响。结论该方法特异性强,灵敏度高,可以实现畜肉食品中的鸭源性成分检测。