代谢工程改造酿酒酵母生产L-苹果酸

为了研究胞质还原路径对酿酒酵母积累L-苹果酸的影响,通过在酿酒酵母中过量表达源于黄曲霉的丙酮酸羧化酶(Afpyc)、苹果酸脱氢酶(Afmdh)及C4-二羧酸转运蛋白(Afmae),成功构建了L-苹果酸合成的胞质还原路径。结果表明:(1)当低水平表达Afpyc时,其丙酮酸浓度降低了42%,但不能积累L-苹果酸;(2)当共表达Afpyc和Afmdh时,菌株W005积累了1.93 g/L的L-苹果酸,与对照菌株W004相比细胞干重提高了350%,丙酮酸降低了65.9%;(3)当共表达Afpyc、Afmdh和Afmae时,菌株W006的L-苹果酸产量提高了21.2%,达到2.34 g/L;4)通过提高接种量至初始OD_(600)=2,L-苹果酸的产量提高到3.28 g/L。通过在酿酒酵母中过量表达黄曲霉胞质还原路径的关键基因,使得工程菌能够积累L-苹果酸,为目标产物的高效积累提供了一种可借鉴的思路。     

代谢工程优化大肠杆菌高效合成L-苯丙氨酸

为获得1 株稳定高产的L-苯丙氨酸工程菌株,利用规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9技术,在大肠杆菌W3110中引入己解除反馈抑制的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶PheA,随后利用不同强度的启动子对莽草酸途径中各反应酶进行调控,并通过摇瓶发酵确定了莽草酸途径各步反应酶的最适表达强度,最后通过增加前体物磷酸烯醇式丙酮酸供应,...     

代谢工程改造酿酒酵母合成玉米黄质

玉米黄质是一种类胡萝卜素,在很多领域都有一定的应用。该研究在前期构建的脂质体积累酿酒酵母的基础上,表达玉米黄质合成酶,初步得到一株能够积累玉米黄质的酿酒酵母工程菌。进一步优化补料碳源、补料时间和补料方式,最终在5 L的发酵罐从48 h开始以指数流加的方式流加葡萄糖,得到玉米黄质的产量为47.7 mg/L。综上,该研究构建了一株高产玉米黄质重组菌并对其进行了发酵验证,研究结果为后续进行发酵优化提供了基础以及改进的方向。     

肉桂酸酶法合成L-苯丙氨酸的研究

研究了粘红酵母hodotorula glutinis ZW194中苯丙氨酸解氨酶生物催化肉桂酸氨化合成苯丙氨酸的反应条件,考察了不同的表面活性剂对转化反应的影响,结果表明,最适转化反应条件:pH 10.5,铵离子浓度8 mol/L,碳酸氢铵/氨水(W/V)=2/8,t-Ca浓度15 g/L,反应时间8 h。最适反应温度为35℃,40℃时依然保持着88%的转化水平,具有抗高温稳定性。在转化反应系统中添加0.20%(W/V)的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)可以提高L-Phe积累量。     

L-苯丙氨酸脱色工艺的研究

采用活性炭对以酶法生产并通过模拟移动床分离得到的L-苯丙氨酸（L-phe）洗脱液的粗结晶溶液进行了脱色研究。考察了pH、脱色温度、活性炭用量、料液浓度、脱色时间等工艺条件对脱色效果的影响,确立了最佳的工艺条件,并成功应用于工业生产。      

L-苯丙氨酸脱色工艺的研究

采用活性炭对以酶法生产并通过模拟移动床分离得到的L-苯丙氨酸(L-phe)洗脱液的粗结晶溶液进行了脱色研究。考察了pH、脱色温度、活性炭用量、料液浓度、脱色时间等工艺条件对脱色效果的影响,确立了最佳的工艺条件,并成功应用于工业生产。     

L-苯丙氨酸的合成技术研究进展

重点介绍了L-苯丙氨酸的应用及国内外L-苯丙氨酸主要合成技术,讨论了各种合成方法的优缺点,针对我国生产企业的优势和存在的问题提出了建议,并对未来发展进行了展望。     

L-异亮氨酸及其衍生物代谢工程研究进展

L-异亮氨酸属于分支链氨基酸,是一种生糖兼生酮氨基酸,为人体8种必需氨基酸之一,广泛应用于医药、化妆品、食品等诸多领域.工业化生产L-异亮氨酸主要采用谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌发酵法合成.该文分析比较了谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌L-异亮氨酸的生物合成途径及代谢调控机制;尽管二者代谢途径相同,但关键酶多样性及其调控方式存在差异;...     

代谢工程改造大肠杆菌合成L-组氨酸

该研究主要通过多种代谢工程策略对大肠杆菌进行改造从而增强菌株L-组氨酸的合成.首先,用人工的开放阅读框(hisL′-λattB′-trpE)替换大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)L-组氨酸操纵子的前导区,同时表达来源于E.coli的ATP转磷酸核糖基酶突变体基因hisGE271...     

L-酪氨酸和L-苯丙氨酸在732树脂上的吸附平衡

实验研究了L-酪氨酸和L-苯丙氨酸在732树脂上的吸附平衡。分别采用Freundlich等温线和Langmuir等温线拟合吸附平衡数据。料液初始pH值介于3．5～4．5时，对平衡吸附量影响不大，而料液中过多H^＋的存在（pH值≤2．0）会降低氨基酸在树脂上的吸附量。所得到的等温线方程可用于双组分竞争吸附平衡及其动力学的数学建模与数值模拟研究。     

L-色氨酸和L-苯丙氨酸在732树脂上的吸附行为研究

研究L-色氨酸和L-苯丙氨酸在732树脂上的吸附平衡.探讨NaCl浓度对L-色氨酸和L-苯丙氨酸单组分平衡吸附量的影响.同时测定L-色氨酸和L-苯丙氨酸双组分竞争吸附动力学曲线.分别采用扩展Freundlich模型和LCA模型拟合了双组分吸附平衡数据,其中单组分吸附平衡数据采用Freundlich和Langmuir模型拟合.结果表明,扩展Freundlich模型拟合L-色氨酸和L-苯丙氨酸的平均误差分别为3.74%和3.85%,优于LCA模型.双组分竞争吸附动力学试验表明,L-色氨酸为强吸附组分.     

代谢工程改造酿酒酵母高效合成β-葡聚糖

β-葡聚糖是存在于酵母细胞壁中的一种多糖,具有抗炎抗氧化等重要的作用。为提高酿酒酵母中β-葡聚糖的产量,该研究采用代谢工程中常用的“推-拉-抑制”策略。首先,通过在酿酒酵母中过表达β-葡聚糖合成途径关键酶及其调节亚基“拉”动关键前体二磷酸尿苷(uridine diphosphate, UDP)-葡萄糖流向β-葡聚糖合成途径;之后通过强化前体UDP-葡萄糖途径酶,将代谢通量“推”向前体UDP-葡萄糖的有效合成;最后抑制蛋白质糖基化等UDP-葡萄糖的其他消耗途径,积累更多的UDP-葡萄糖用于目的产物β-葡聚糖的合成。除此之外,通过引入木糖还原酶基因xyl1,木糖醇脱氢酶基因xyl2和木酮糖激酶基因xyl3,构建了木糖氧化还原途径;进一步通过过表达转运蛋白Hxt7(F79S),敲除snf1基因,提高了对木糖的利用能力,并最终将β-葡聚糖的产量提高至86.09 mg/g。最后,利用半乳糖诱导型启动子P_gal1动态调控内切葡聚糖酶基因(eng1)表达,使酿酒酵母中β-葡聚糖的分子质量从1×10⁶～2×10⁶ g/mol降低至1.2...     

代谢工程改造枯草芽孢杆菌促进L-赖氨酸高效合成研究

为了构建具有益生功能和L-赖氨酸合成功能的“双功能”枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重组菌株,对饲料工业常用的益生菌B.subtilis ACCC11025进行系统的代谢工程改造。结果表明：以来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的lysC³¹¹、zwf²³⁴和gnd³⁶¹替换B.subtilis中的thrD、zwf和gnd,即构建重组菌B.subtilis XH4,有利于L-赖氨酸的合成,其产量达到(20.3±1.9) g/L;将B.subtilis中hom替换成来源于C.glutamicum的hom⁵⁹,即构建重组菌B.subtilis XH5,可显著降低副产物积累量,提高L-赖氨酸产量至(23.2±1.7) g/L,且不影响菌体生长;在重组菌B.subtilis XH5中引入C.glutamicum中的DapDH会改变二氨基庚二酸途径(DAP)碳分布进而促进L-赖氨酸的合成,目标重组菌B.subtilis XH6的L-赖氨酸产量达到(25....     

代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,利用基因重组技术替换ilvLXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,以期获得L-异亮氨酸生产菌.将ilvLXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilvLXGM后获得ILE01菌株,于该菌株中分别过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvIH及共表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,获得菌株ILE02和ILE03,其L-异亮氨酸产量分别达到1.75 g/L和2.19g/L.针对ILE03 α-酮丁酸积累量过高的问题,通过改变操纵子中ilvA和ilvIH的顺序调节其转录水平,获得菌株ILE04,其L-异亮氨酸产量达2.85 g/L.利用ILE04于5L发酵罐中进行发酵实验,L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/(L·h)及4.6％.     

聚乙二醇/盐双水相萃取L-苯丙氨酸的研究

研究了聚乙二醇/盐双水相体系的成相行为及L-苯丙氨酸在双水相中的分配规律,其中包括聚乙二醇的分子量、聚乙二醇质量分数、盐的种类及加入量、L-苯丙氨酸初始浓度和pH对萃取分离的影响。当聚乙二醇1000的质量分数为27%,磷酸氢二钾的质量浓度为0.15g/mL,L-苯丙氨酸的质量浓度为10g/L,体系的pH为8.5时,L-苯丙氨酸的萃取率最高为99.5%,分配系数最大为186.5。     

聚乙二醇/盐双水相萃取L-苯丙氨酸的研究

研究了聚乙二醇/盐双水相体系的成相行为及L-苯丙氨酸在双水相中的分配规律,其中包括聚乙二醇的分子量、聚乙二醇质量分数、盐的种类及加入量、L-苯丙氨酸初始浓度和pH对萃取分离的影响。当聚乙二醇1000的质量分数为27%,磷酸氢二钾的质量浓度为0.15g/mL,L-苯丙氨酸的质量浓度为10g/L,体系的pH为8.5时,L-苯丙氨酸的萃取率最高为99.5%,分配系数最大为186.5。      

苹果醋发酵过程中L-苯丙氨酸促进乙酸-2-苯乙酯的合成

为了初步研究食品添加剂L-苯丙氨酸对苹果醋发酵过程中的特征性香气成分乙酸-2-苯乙酯的合成途径及关键酶活的影响,采用HS-SPME-GC-MS和ELISA,检测各合成相关基质生成量和关键酶活性的变化。结果表明,不同添加量的L-苯丙氨酸有明显促进乙酸-2-苯乙酯及其相关合成基质生成量积累的作用,并且对ADH、AAT的酶活性也有一定的促进作用,而对Esterase酶活性有抑制作用。其中当L-苯丙氨酸添加量为8 g/L时,乙酸-2-苯乙酯生成量显著提高了43.76%～86.59%。因此,本试验初步将8 g/L作为L-苯丙氨酸的最佳添加量,初步推测L-苯丙氨酸通过醇酰基转移酶途径促进乙酸-2-苯乙酯的合成及其相关基质和关键酶活的生成量,赋予苹果醋产品更多独特的香气和风味,为生产工艺提供一定的参考依据。     

理性代谢工程改造促进谷氨酸棒杆菌高效合成L-谷氨酰胺

L-谷氨酰胺（L-glutamine,L-Gln）是人体液中含量最丰富的一种半必需氨基酸,具有多种营养和药理功能,被广泛应用于医药、食品添加剂、营养保健品、饲料等领域。目前,微生物发酵法是生产L-Gln的主要方法,发酵产酸效率低、副产物多、菌种性能欠缺等问题严重限制了其工业化应用。为解决这一问题,作者以实验室前期构建的L-Gln生产菌株CGQ03为出发菌株,通过强化谷氨酸脱氢酶表达及辅因子NADPH供应促进前体L-谷氨酸合成、增强辅因子ATP胞内含量、过表达溶氧相关蛋白VHb提高细胞携氧能力、增强关键酶谷氨酰胺合成酶催化活性及发酵工艺优化等策略提高了L-Gln产量。最终的基因工程菌CGQ08/pDXW10-glnASc-gdhCg在5 L发酵罐上补料分批发酵66 h,L-Gln的产量最高达（94.5±1.8） g/L,糖酸转化率为34.8%,生产强度为1.43 g/（L·h）。本研究为L-Gln及其相关化合物的工业化生产提供了借鉴。     

多柱串联离子交换分离L-苯丙氨酸的研究

利用离子交换法结合多柱串联吸附、洗脱工艺从酶转化液中高效分离提取L-苯丙氨酸,研究了多柱串联吸附及洗脱过程的控制与洗脱尾流的利用。该法无吸附损失,树脂对L-苯丙氨酸的吸附量达135mg/g树脂。通过洗脱出口pH变化反映L-苯丙氨酸洗脱程度,收集pH3·3~10·7范围内的L-苯丙氨酸洗脱液。采用洗脱尾流串联洗脱除去杂质,并回收尾流中的L-苯丙氨酸,洗脱收集液的L-苯丙氨酸浓度达32g/L,收率97%。     

代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌促进L-异亮氨酸发酵合成的研究进展

L-异亮氨酸作为必需氨基酸具有多种生理功能,对人体和动物健康有重要的调节作用。微生物发酵是工业生产L-异亮氨酸的主要方式,而谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）是L-异亮氨酸发酵生产的主要菌株,主要通过筛选和随机诱变得到,其遗传背景不明且很难通过诱变进一步提高产量,因而通过代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸成为近年来研究热点。该文综述了近年来代谢工程改造谷氨酸棒杆菌促进L-异亮氨酸生物合成的相关研究,主要涉及代谢通量调控、解除反馈抑制、强化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）水平以及提高产物分泌能力等方面,对进一步改造菌株和促进L-异亮氨酸发酵合成具有一定的参考意义。