产油丝状真菌高山被孢霉中蝶呤类化合物的提取及检测

建立了高效液相色谱-荧光检测法同时测定高山被孢霉体内新蝶呤、蝶呤和生物蝶呤的方法。高山被孢霉在液氮破壁、酸性条件下经碘-碘化钾溶液氧化1h、滴加抗坏血酸还原液后,体内的四氢生物蝶呤及其前体二氢蝶呤三磷酸盐和6-丙酮酰四氢生物蝶呤分别被氧化成相应的氧化产物新蝶呤、蝶呤、生物蝶呤。经离子交换树脂纯化后,利用高效液相色谱进一步分离得到了氧化产物蝶呤、新蝶呤和生物蝶呤,并采用电喷雾质谱对定性结果进行确认。色谱柱为Inertsil ODS-3C₁₈（5μm,150mm×4.6mm）,用10mmol/L的磷酸氢二钠（pH6.0）作为流动相,流速为1.2mL/min,荧光检测器激发波长为350nm,吸收波长为450nm。检测出的新蝶呤、生物蝶呤和蝶呤的检出限依次是:0.003、0.002、0.005μg/mL。本方法能快速并准确的检测各类蝶呤类化合物,为利用高山被孢霉发酵生产四氢生物蝶呤奠定一定基础。      

高山被孢霉产孢培养基的筛选

为了促进高山被孢霉产孢,研究分析了8种常用于促进丝状真菌产孢的培养基对高山被孢霉菌丝生长和孢子产量的影响,并对产孢培养基进行了改良。结果表明,在40 g/L的玉米粉培养基中补加10 g/L葡萄糖和无机盐（硝酸盐（2 g/L KNO3）、磷酸盐（1 g/L NaH2PO4）与镁离子（0.3 g/L MgSO4·7H2O））,接种高山被孢霉后于28 ℃培养10 d,再在4 ℃培养14 d,孢子平均产量达到 8.57×106个/mL,是目前用于高山被孢霉菌株保藏的葡萄糖酵母培养基（GY）(孢子平均产量 3.85×106个/mL)的2.23倍。因此,在有少量葡萄糖和无机盐促进菌丝生长的前提下,40 g/L的玉米粉最适合高山被孢霉产孢。     

高山被孢霉发酵生产多不饱和脂肪酸的初步研究

高山被孢霉具有很强的脂肪合成能力,并可积累多种多不饱和脂肪酸,为进一步提高高山被孢霉多不饱和脂肪酸产量,对碳源、氮源等对高山被孢霉菌体生长和多不饱和脂肪酸(PUFA)生产的影响进行分析。研究结果表明:甘油可以作为葡萄糖的替代物用于高山被孢霉工业化发酵生产多不饱和脂肪酸;当脱脂豆粉与硝酸钾的比例为2∶1时,此时菌体形态最利于脂肪酸生产,脂肪酸和花生四烯酸的产量分别为11.20g/L和5.89g/L,花生四烯酸的产量提高了4.0倍。      

高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的优化

研究了高山被孢霉液态发酵产花生四烯酸过程中主要底物和培养条件对花生四烯酸产量的影响。采用单因素和正交试验设计优化了碳源、氮源、无机盐的种类及浓度,找出了最佳的培养温度和变温策略。试验结果显示最佳碳源和氮源及浓度是:玉米粉66 g/L,豆粕粉54 g/L;最佳无机盐配方是:KH_2PO_43 g/L,MgSO_41 g/L,Na_2SO_42 g/L。采取逐级变温培养:30℃(3 d),25℃(4 d),20℃(4 d)。优化后生物量和花生四烯酸产量分别达到52.3和13.6 g/L。     

高山被孢霉生产多不饱和脂肪酸发酵条件的研究进展

高山被孢霉能发酵生产多不饱和脂肪酸如花生四烯酸等,具有安全性好、产率高、生产易控制等优点,适宜于工业化生产。本文论述了高山被孢霉产多不饱和脂肪酸发酵条件的研究进展,着重于论述发酵过程中碳源、氮源、溶解氧及培养条件等对产物产率的影响作用研究。     

高山被孢霉产花生四烯酸的代谢研究

研究了3个批次的高山被孢霉发酵产花生四烯酸(ARA)过程中,生物量、糖耗、氮耗、油脂含量和ARA含量的变化.结果表明,发酵7d的生物量(干重)为30.650 g/L,糖耗85.33％,氮耗78.81％,发酵液油脂含量17.142 g/L,ARA含量7.482 g/L.     

高山被孢霉发酵产鸟苷酸二磷酸岩藻糖的研究

鸟苷酸二磷酸岩藻糖(GDP-L-Fuc)是一种重要的核糖类化合物,其作为岩藻糖基的受体具有重要的生理功能。尝试利用高山被孢霉发酵产GDP-L-Fuc。高山被孢霉经液氮研磨破壁,甲酸(含10%丁醇)溶液萃取后,利用高效液相色谱进一步分离得到了GDP-L-Fuc,并采用四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱对结果进行定性分析。然后对高山被孢霉不同发酵时期GDP-LFuc产量进行分析,发现GDP-L-Fuc在氮源消耗之后仍然持续积累。同时,GDP-L-Fuc合成途径关键基因的转录水平在氮源耗尽时发生了上调,这表明氮源很可能是GDP-L-Fuc积累的关键因素。最后,在氮源耗尽后添加外源岩藻糖显著提高了GDP-L-Fuc的产量(50%),可达170.51μg/g。这为利用微生物发酵产GDP-L-Fuc奠定了理论基础。     

高产花生四烯酸高山被孢霉的诱变育种研究

通过菌种选育获得具有优良产脂性能的菌株是实现微生物油脂工业化生产的重要前提。利用实验室前期构建的产油丝状真菌快速筛选技术,以前期筛选获得的一株性状优良的高山被孢霉TSM-3为出发菌株,通过常压室温等离子体(ARTP)诱变方法得到能够稳定遗传的高产突变菌株TSM-3-1,其油脂产量和花生四烯酸(AA)产量分别达到5.07 g/L和1.55 g/L,与出发菌株相比分别提高了47.81%和84.52%。将产油丝状真菌快速筛选技术与诱变育种相结合,提高了目标菌株筛选效率并强化了野生型菌株油脂合成能力,为产油丝状真菌菌种选育提供了新颖的研究思路及方法。     

高山被孢霉对5种抗生素的敏感性研究

以固体培养基上菌落数为指标,研究高山被孢霉在5种抗生素(氨苄青霉素、红霉素、潮霉素B、卡那霉素和氯霉素)的不同浓度下的生长情况。结果表明:与空白对照组相比,高山被孢霉对潮霉素B最敏感,当浓度300μg/m L时,致死率为91.7%;对卡那霉素和红霉素较敏感,在400μg/m L卡那霉素中的致死率为73.3%,在400μg/m L红霉素中的致死率达到70%;对氨苄青霉素和氯霉素不敏感,300μg/m L氨苄青霉素、250μg/m L氯霉素不能抑制高山被孢霉生长,致死率只有20%以下。     

高山被孢霉生产ARA发酵条件的优化研究

对ARA产生菌高山被孢霉的培养条件进行了研究,通过摇瓶实验考察了碳源、碳氮比、初始pH值、接种量和微量元素等对ARA的影响。结果发现在培养基中使用葡萄糖为碳源,碳氮比维持在40:1~50:1之间,初始pH6,接种量10%,添加VB1 100 mg/L、VB12 0.5 mg/L、生物素0.5mg/L、泛酸钙120 mg/L和谷氨酸1 g/L是较优配方(优化培养基A)。实验同时对比了使用单一氮源及混合氮源对高山被孢霉发酵产ARA的影响,结果发现使用混合氮源更有利于高山被孢霉发酵产ARA,混合氮源得到的ARA产量是使用单一氮源的2倍,且其含量占总油脂的44.5%,在此基础上获得优化培养基B。     

高山被孢霉发酵生产花生四烯酸发酵条件优化

通过对一株高山被孢霉菌株（Mortierella alpina）发酵生产花生四烯酸（ARA）的摇瓶培养研究,以菌体干质量、出油率和ARA含量为标准,确定了其最佳发酵工艺条件。摇床实验确定的最佳培养条件为摇床转速180 r/min,培养基碳氮比为3.0,发酵温度为26 ℃,pH 值为6.2,发酵周期为5 d。在此发酵条件下,在10 L自动发酵罐进行放大发酵试验,菌体干质量、出油率和ARA含量分别高达45.4 g/L、24.1 g/L和49.6%。     

高产花生四烯酸的高山被孢霉突变株的选育

为获得高产花生四烯酸的高山被孢霉突变株,利用~(60)Co-γ射线对实验室保藏的高山被孢霉M12进行辐照诱变育种。在辐照剂量为1、2和3 kGy时,致死率分别为73.6%、80.6%和93.8%。以生物量、含油率和花生四烯酸产量为综合评价指标,经初筛和复筛,选育出了一株M12-2-2突变株。经摇瓶发酵,该突变株的生物量为30.73 g/L,含油率为40.51%,ARA产量为4.75 g/L,其ARA产量比出发株提高了1.65倍。经十代传接培养后,该突变株的遗传性能稳定。     

高山被孢霉生长和产脂的影响因素分析

为探究影响高山被孢霉生长和产脂的因素,分析不同初始葡萄糖质量浓度、活化次数、接种量、装液量、发酵时间、菌球打碎时间等条件下高山被孢霉生长和产脂特点。结果表明,初始葡萄糖质量浓度、装液量和发酵时间对菌株生长和产脂的影响最为显著,且初始葡萄糖质量浓度与花生四烯酸的产量呈负相关性。根据不同条件下菌株生长和产脂情况,得到高山被孢霉最佳培养条件为:菌株活化3次,用高速分散机8 000 r/min打碎20 s至均匀状态,按2%～3%(体积分数)接种量接入初始葡萄糖质量浓度为50 g/L、装液量为20%(体积分数)的发酵培养基中,200 r/min、28℃培养8. 5 d。     

高山被孢霉谷氨酸代谢调控产脂的初步研究

为解析谷氨酸代谢对产油丝状真菌高山被孢霉(Mortierella alpina)脂质合成的影响,该文考察了补加谷氨酸条件下高山被孢霉谷氨酸代谢相关酶的基因转录水平、酶活性水平和总脂产量等指标。结果显示,补加谷氨酸显著影响了高山被孢霉胞内谷氨酸代谢相关基因的转录水平,NADP⁺型谷氨酸脱氢酶和谷氨酸脱羧酶活性的增加为脂肪酸从头合成提供了充足的还原力,这使得细胞总脂含量提升了3 g/L(约占干重比例10%)。该研究为氨基酸介导的微生物脂质合成机制解析提供了参考。     

SSADH基因调控对高山被孢霉脂质合成的影响

高山被孢霉合成油脂能力很强,可合成多种n-3和n-6系列多不饱和脂肪酸(PUFAs)。γ-氨基丁酸(GABA)代谢途径是由谷氨酸经过一系列反应转化至琥珀酸并产生NADPH的过程,同时可为产油真菌生长提供碳源和氮源。通过构建γ-氨基丁酸途径中琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)基因RNA干扰菌株(MA-i SSADH),对MA-i SSADH中的脂肪酸组成、NADPH水平及相关基因转录水平进行分析,研究SSADH与高山被孢霉脂质合成关系。与原养型高山被孢霉(M.alpina)相比,MA-i SSADH中SSADH基因转录水平显著下调,同时脂肪酸总含量下降了20.9%,C18∶1相对含量提高了73.5%,表明SSADH在高山被孢霉脂质合成中起重要作用。尽管MAi SSADH中NADPH绝对含量没有发生显著性变化,但NADPH合成相关基因如苹果酸酶(ME)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)、亚甲基四氢叶酸脱酸酶(MTHFD)基因转录水平均发生了显著变化,表明SSADH对NADPH合成途径产生了重要调控,这可能是其影响脂质合成的原因之一。     

深黄被孢霉和拉曼被孢霉多不饱和脂肪酸代谢的研究

应用气相色谱-质谱联用技术对国内和国外两株γ-亚麻酸(GLA)的主要生产菌(深黄被孢霉和拉曼被孢霉)的脂肪酸成分进行分析,然后从不饱和脂肪酸的代谢途径和菌体的生理特性对两株菌进行比较。从代谢途径看,两株菌的不饱和脂肪酸代谢有一定的差异,其中△6-和△12-脂肪酸脱氢酶均为阻碍两株菌高产GLA的关键所在,再结合两株菌的生理特性,发现拉曼被孢霉较深黄被孢霉更适合工业化生产。     

高山被孢霉产花生四烯酸的发酵和老化工艺

高山被孢霉对于淀粉质原料具有优良的利用能力。采用经淀粉酶液化的玉米粉-豆粕培养基,研究了高山被孢霉在5 L容积机械搅拌罐液态发酵的主要参数,如搅拌转速和通气体积比对于高山被孢霉发酵产花生四烯酸的影响,得到最优的搅拌转速和通气体积比,分别为200 r/min和1∶1。研究发现,采用发酵罐培养5 d的菌丝体,最佳的老化温度和保温时间分别是20℃和5 d。本研究把谷物粗原料成功用于高山被孢霉发酵产花生四烯酸,经发酵罐优化和菌体老化后的花生四烯酸产量达到11.7 g/L,菌体老化可以在保持产量的同时缩短发酵周期,有效降低生产成本,有望实际用于花生四烯酸的工业化生产。     

响应面法优化深黄被孢霉产油突变株的发酵培养基配方

为了优化深黄被孢霉突变株的发酵培养基,在单因素实验基础上,采用响应面法(RSM)对深黄被孢霉产油突变株发酵培养基配方进行优化。结果表明,深黄被孢霉产油突变株最佳发酵培养基配方为:葡萄糖90.29 g/L,酵母膏4.14 g/L,Mg SO40.96 g/L,KH2PO41.99 g/L,p H 6.0。在最佳条件下油脂产量为12.01 g/L,比优化前(6.22 g/L)提高了93.09%。     

高山被孢霉突变株产花生四烯酸培养条件的研究

为了研究高山被孢霉突变株12-2-2产花生四烯酸(ARA)的培养条件,选取温度、p H、摇床转速和培养时间为4个影响因素,以生物量、油脂产量和ARA产量为综合评价指标,进行单因素实验和正交实验。结果表明,影响高山被孢霉突变株12-2-2产ARA的因素主次顺序为:温度﹥培养时间﹥摇床转速﹥p H;最优培养条件为:温度26℃,培养时间7 d,摇床转速160 r/min,p H 8。在最优培养条件下,高山被孢霉突变株12-2-2的生物量为32.31 g/L,油脂产量为12.98 g/L,ARA产量为5.12 g/L。     

不同前体物质的添加对高山被孢霉生长及脂肪酸组分的影响

通过添加植物油及吐温作为高山被孢霉合成油脂的前体物质,分别考察了不同前体物质的添加对菌体的生物量、油脂含量、油脂产量及所得油脂中各脂肪酸组分的影响。实验结果显示:添加植物油作为前体不但可以提高菌体中油脂含量,而且会使油脂中花生四烯酸的产量得到大幅度提高,其中加入菜籽油、亚麻籽油及大豆油为前体时,花生四烯酸的产量分别达到了2 063.2、2 062.8 mg/L及2 192.9 mg/L,比对照组提高了112.72%、112.68%及126.10%;而以吐温80为前体时,虽然菌体的油脂产量有所降低,但油脂中花生四烯酸的产量比对照组提高了79.91%,达到了1 744.9 mg/L。