双歧汗菌检测与鉴定技术进展

简述了双歧杆菌的特性、双歧制品种类、保健功效及双歧杆菌微生态调节剂在近年来的发展,重点论述了近几年双歧杆菌检测和鉴定技术发展;采用分子生物学方法对双歧杆菌进行鉴定,该方法将成为快速、可靠的鉴定方法;指出基本生理生化反应,鉴别培养基,选择结合分子生物学方法可对双歧杆菌进行属、种、株水平鉴定,为尽快制定双歧制品检测国标及双歧制品产业发展提供可靠依据.     

双歧杆菌检测与鉴定技术进展

简述了双歧杆菌的特性、双歧制品种类、保健功效及双歧杆菌微生态调节剂在近年来的发展，重点论述了近几年双歧杆菌检测和鉴定技术发展；采用分子生物学方法对双歧杆菌进行鉴定，该方法将成为快速、可靠的鉴定方法；指出基本生理生化反应，鉴别培养基，选择结合分子生物学方法可对双歧杆菌进行属、种、株水平鉴定，为尽快制定双歧制品检测国际及双歧制品产业发展提供可靠依据。     

双歧杆菌的检测与鉴定研究进展

总结和回顾了双歧杆菌的常规和分子生物学方面与鉴定方面的研究进展,重点介绍了分子生物学在双歧杆菌检测和鉴定方面的应用,如各种特异性核酸前体或探针直接检测技术、分子标记技术、PCR相关技术等。对各种技术的优缺点进行了比较,并展望了各种检测技术的发展前景。     

荧光定量PCR法计数农家干酪中动物双歧杆菌乳酸亚种

分别利用荧光定量PCR及平板菌落计数法计数农家干酪中双歧杆菌的菌体数,通过对结果的比较分析,建立一种适用于快速、敏感、特异的检测干酪中双歧杆菌活菌数的方法。利用传统工艺制备双歧杆菌农家干酪,在其贮存期间分别采用荧光定量PCR及平板菌落计数法计数干酪中双歧杆菌的数量。其中,在利用荧光定量PCR法检测时,对影响PCR定量准确的因素进行系统研究,包括设计双歧杆菌引物,并对引物特异性进行评价、考察,从干酪基质中提取DNA的数量和质量,建立标准曲线。引物特异性验证结果表明,引物专一性强。采用试剂盒法从干酪样品中提取DNA的纯度较好,OD_(260)/OD_(280)均在1.75~1.82之间。除贮存第1天外,荧光定量PCR法计数结果比平板计数法高0.39%~2.25%,未见显著差异。荧光定量PCR具有灵敏、特异、简便和快速的特点,可用于干酪中双歧杆菌的定量检测。     

食品检验中乳酸菌鉴定方法的探讨

目的评价GB 4789《食品安全国家标准食品微生物学检验》中乳酸菌的鉴定方法。方法选择5种双歧杆菌、4种乳酸杆菌和1种链球菌共10株乳酸菌,分别采用GB 4789标准中的方法、API生化鉴定系统、16S rRNA基因序列分析法和RiboPrinter全自动基因指纹图谱分析法进行鉴定。结果 GB 4789对乳酸杆菌和嗜热链球菌鉴定效果较好,对双歧杆菌的鉴定能力较弱;API鉴定乳酸菌一般至"属"水平;16S rRNA序列分析和RiboPrinter系统可鉴定乳酸菌至"种"水平,婴儿双歧杆菌的鉴定结果为长双歧杆菌婴儿亚种。结论建议GB 4789标准中增加分子生物学方法作为乳酸菌鉴定方法的补充,同时建议及时更新标准中菌株的分类和名称。     

双歧杆菌的分子生物学鉴定方法的比较

利用实验室设计的双歧杆菌特异性引物,采用降落聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的方法对供试菌株的16S r DNA进行扩增,比较细菌分别通用引物和双歧杆菌特异性引物对双歧杆菌属不同菌株及参考菌株扩增效果的影响。实验结果表明,细菌通用引物对不同双歧杆菌进行扩增,扩增出来的条带不清晰,而用双歧杆菌特异性引物进行扩增,扩增出来的条带清晰。因此,该方法可以准确地鉴定双歧杆菌,为双岐杆菌的鉴定提供了理论依据。     

以分子生物学技术鉴定酿酒微生物

首先介绍了以分子生物学的前沿技术聚合酶链式反应(PCR)结合凝胶电泳对酿酒微生物菌种进行鉴定的原理和方法,然后综述了分子生物学在鉴定微生物上的应用,最后展望了其发展趋势,指出分子生物学技术将是酿酒微生物鉴定的重点发展方向。     

乳制品中活双歧杆菌检测试剂盒的研制及应用

在EMAReal-Time PCR检测方法的基础上,组装检测乳制品中活双歧杆菌的荧光定量PCR试剂盒。建立了EMAReal-Time PCR检测乳制品中活双歧杆菌的标准曲线。组装出检测乳制品中活双歧杆菌的荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒批内及批间变异系数(CV)均小于5%;对乳制品中常见乳酸菌无交叉反应;最低检测限为2×104CFU/mL。该试剂盒在-20℃下,至少可保存6个月,4℃可保存3个月。分别采用研究所获得的试剂盒和平板菌落计数法检测12份市售酸乳中的活双歧杆菌的数量,2种检测方法计数结果差异不显著(P>0.05)。该方法所建立的标准曲线相关系数大于98%。所研制的试剂盒重复性较好、特异性较强、灵敏度较高,可以准确地定量检测乳制品中的活双歧杆菌。     

基于FemAB基因特异引物的动物双歧杆菌PCR检测方法的建立

分离和鉴定了两株双歧杆菌,通过16SrDNA通用引物扩增条带测序和非特异引物随机扩增法扩增条带测序推测其为动物双歧杆菌。随后使用以编码肽聚糖肽桥形成蛋白(Peptidoglycan bridge formation protein)FemAB基因为目的扩增片段设计的特异引物进行了扩增鉴定。结果表明,此特异引物对这两株动物双歧杆菌菌株扩增结果为阳性,其他对照菌株扩增结果为阴性,且扩增条带测序结果与预计一致。FemAB基因在PCR特异扩增法鉴定细菌种属中具有较好的分辨能力,并使用其建立了动物双歧杆菌PCR检测方法。本研究旨为应用FamAB基因鉴定细菌种属以及双歧杆菌属微生物的鉴定提供了数据参考。     

发酵乳活性双歧杆菌种类快速识别及定量研究

本文建立了发酵乳制品中双歧杆菌种类和数量快速测定方法。以发酵乳中双歧杆菌为靶标,采用PCR-DGGE技术快速识别双歧杆菌种类;采用Real-Tine PCR手段测定双歧杆菌数量。研究结果表明,PCR-DGGE能准确、快速鉴别双歧杆菌种类,检出限为105 CFU/g;Real-Tine PCR能准确、快速定量双歧杆菌,检出限为104 CFU/g。该方法可用于发酵乳中双歧杆菌的快速识别和定量。     

猪源双歧杆菌的分离纯化及初步鉴定

本研究选用双歧杆菌增殖培养基，从13d龄和30d龄未断奶健康仔猪肠道和粪便中分离纯化出双歧杆菌，进行了各种生理生化鉴定实验，对其进行了初步鉴定。     

实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌

根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区序设计特异性引物和探针,建立一种鉴定食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。对方法的特异性、灵敏度、重复性和体系抗干扰能力进行验证,最后采用该方法对市售25份标示含双歧杆菌样品进行检测。结果表明:该检测方法可特异性检测双歧杆菌属细菌,对近缘的乳杆菌属、链球菌属及食品中常见菌群包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等均无扩增。双歧杆菌DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg,相对灵敏度可达到10~4 CFU/m L。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。同时进行了杂菌干扰检测实验,在培养物水平和纯基因组DNA水平上将青春双歧杆菌ATCC15703与大肠杆菌ATCC25922混合进行检测,检出Ct值较纯菌检测时无显著影响,表明建立的荧光PCR方法抗干扰能力良好。对25份市售实际样品进行测试,有5份标识含有“双歧杆菌”的样品未检测出双歧杆菌成分。本研究所建立的实时荧光PCR法能准确、快速检测食品中双歧杆菌属细菌。     

双歧杆菌的分离鉴定与耐氧驯化

本研究从鸡盲肠内容物中分离出单菌落,经菌落菌体形态观察和生理生化鉴定为双歧杆菌.采用逐级增加氧气含量的方法对筛选出的双歧杆菌进行耐氧驯化,以改善双歧杆菌时氧气的耐受力,经过多次驯化,优选出对氧气有一定耐受力、凝乳能力较好,且在贮藏过程中活菌数能够达到保健功能要求的菌株B05.经二次鉴定该菌株保持了双歧杆菌的形态和生理特征.     

双歧杆菌的基因组学与基因工程的新进展

双歧杆菌是人类和动物体内非常重要的益生菌,有关双歧杆菌生理生化特性的研究已比较成熟。随着研究的不断深入,双歧杆菌的分子生物学研究也成为近年来研究的热点。综述了近年来有关双歧杆菌质粒分离、载体构建、基因组测序以及在基因治疗上的应用等研究进展。     

实时荧光定量PCR法测定发酵乳中双歧杆菌

对实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测发酵乳中双歧杆菌的DNA提取方法、PCR扩增效率、标准曲线绘制进行探讨,通过比较分析碱式提取法、玻璃珠破碎法和酶解法3种提取方法对发酵乳中总DNA提取效率、4种不同参考菌株的PCR扩增效率以及单一菌株标准曲线与混合菌株标准曲线的计数结果,建立实时荧光定量PCR快速测定发酵乳制品中双歧杆菌数量方法。结果表明：酶解法提取发酵乳中总DNA效果最好,OD260/280比值基本接近1.80,且提取的质量浓度含量最高;不同菌株的PCR扩增效率不同,其中参考菌株1.2213的Ct值与其他3菌株的Ct值存在显著性差异;根据单一菌株绘制标准曲线与混合菌株绘制标准曲线计数结果无显著性差异,后者计数结果更客观、准确。采用酶解法获取样品中的菌体细胞,基于混合菌液绘制标准曲线,采用实时荧光定量PCR技术确定发酵乳中双歧杆菌种属数量,可快速、准确地测定发酵乳中双歧杆菌的数量。     

双歧杆菌基因组DNA提取及其遗传多态性研究

用自行改良的氯化苄法，从液体培养的双歧杆菌菌中提取基因组DNA，用紫外吸收光谱、琼脂糖凝胶电泳等方法进行鉴定。结果表明，该法提取的基因组DNA分子量高，收获量大，蛋白质污染少，而义快速、高效、经济和实用。以该基因组DNA为模板，用随机引物S256通过AP—PCR扩增出清晰的RAPD谱带，并呈现出一定程度的遗传多态性。讨论了RAPD指纹图谱在双歧杆菌分类鉴定及工业菌株分子标记中潜在的应用价值。     

婴儿粪便长双歧杆菌的分离与多样性分析

本研究旨在分析婴儿粪便长双歧杆菌的多样性,采用改良MRS培养基从哈尔滨地区健康婴儿粪便中分离双歧杆菌,采用生理生化实验结合16S rDNA和热应激蛋白60基因(heat-shock protein 60,hsp60)同源性分析鉴定分离株,利用同源性分析及随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA,RAPD)、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术进一步分析长双歧杆菌多态性。实验从11个婴儿体内分离得到18株厌氧的细菌菌株,经形态学分析、生理生化实验、16S rDNA测序及hsp60测序实验发现,其中7株为长双歧杆菌长亚种,3株为长双歧杆菌婴儿亚种。RAPD和MLST结果表明:7株长双歧杆菌长亚种为6个基因型,3株长双歧杆菌婴儿亚种为2个基因型,上述结果说明不同人源婴儿粪便长双歧杆菌基因型差异较大。     

青年人肠道中双歧杆菌的分离及其在发酵羊乳中的应用

在对湖北省襄阳地区青年人肠道中双歧杆菌进行分离鉴定的基础上,采用电子舌和电子鼻技术对其在羊乳中的发酵特性进行了评价。结果表明:分离出的20株双歧杆菌菌株,共鉴定为Bifidobacterium longum(长双歧杆菌)、B. breve(短双歧杆菌)、B. bifidum(两歧双歧杆菌)、B.pseudocatenulatum(假链状双歧杆菌)、B. adolescentis(青春双歧杆菌)和B. faecale(粪便双歧杆菌)6个种,其中11株为B. longum(长双歧杆菌)。通过电子舌分析发现,不同双歧杆菌制备的发酵羊乳在后味A(涩味的回味)上的差异最大,极差值为24.52。通过高效液相色谱法分析发现,乳酸和乙酸为双歧杆菌制备发酵羊乳中的主要有机酸。通过电子鼻分析发现,传感器W6S、W1W和W5S对不同双歧杆菌菌株制备发酵羊乳响应值差异较大,其变异值分别为35.56%、23.32%和17.20%。通过主成分分析发现,B. longum HBUAS55095和B. longum HBUAS55100具有良好的羊乳发酵特性。由此可见,B. longum(长双歧杆菌)为襄阳地区青年人肠道中双歧杆菌类群的优势种,且不同双歧杆菌制备的发酵羊乳品质差异主要体现在滋味上。     

应用DGGE方法构建健康人粪便乳杆菌标准指纹图谱

从健康人的新鲜粪便样品中分离乳杆菌,鉴定属种后构建一种能够快速鉴定未知属种乳杆菌的标准指纹图谱.首先通过形态学观察及K2O2酶等生理生化试验对所分得菌株进行初步鉴定,然后利用16S rDNA序列同源性分析方法,对所分得菌株进行16S rDNA基因扩增与测序,测序结果与GenBank中该属内茵株的16S rDNA基因序列进行同源性分析,从而准确鉴定所分得菌株.最后,利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法构建标准指纹图谱.结果表明,从健康人新鲜粪便中分离得到8株乳杆茵,经鉴定,其中4株为植物乳杆菌,1株为卷曲乳杆菌,3株为发酵乳杆菌.所得标准指纹图谱中试验菌株大体被分成4类,与16S rDNA基因序列同源性分析结果相吻合.通过传统方法可以从健康成人的新鲜粪便中分离得到乳杆菌,传统方法与分子生物学方法相结合可以将其准确鉴定到种的水平.变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法可以在种的水平上作为快速鉴定乳杆菌的一种有效工具.     

实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌

根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区序设计特异性引物和探针,建立一种鉴定食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。对方法的特异性、灵敏度、重复性和体系抗干扰能力进行验证,最后采用该方法对市售25 份标示含双歧杆菌样品进行检测。结果表明：该检测方法可特异性检测双歧杆菌属细菌,对近缘的乳杆菌属、链球菌属及食品中常见菌群包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等均无扩增。双歧杆菌DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg,相对灵敏度可达到104 CFU/mL。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。同时进行了杂菌干扰检测实验,在培养物水平和纯基因组DNA水平上将青春双歧杆菌ATCC15703与大肠杆菌ATCC25922混合进行检测,检出Ct值较纯菌检测时无显著影响,表明建立的荧光PCR方法抗干扰能力良好。对25 份市售实际样品进行测试,有5 份标识含有“双歧杆菌”的样品未检测出双歧杆菌成分。本研究所建立的实时荧光PCR法能准确、快速检测食品中双歧杆菌属细菌。