河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌的分子分型及系统发育研究

目的 了解河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌污染情况、分子分型特征及耐药情况,分析不同菌株间的系统发育进化关系。方法 采集婴幼儿配方食品227份,按照GB 4789.40—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》方法进行克罗诺杆菌的分离鉴定,并用微量肉汤稀释法和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对分离株进行药敏实验和溯源分析,采用16S rRNA和多位点序列分型(MLST)方法进行种属鉴定和系统发育进化分析。结果 227份婴幼儿配方食品中检出13株克罗诺杆菌,分别属于阪崎克罗诺杆菌、苏黎世克罗诺杆菌和都柏林克罗诺杆菌。13株克罗诺杆菌药敏结果显示头孢唑啉耐药率达到84.6%(11/13),PFGE分型得到7个带型,MLST共分为6个ST型,其中ST1为优势型别,相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型。结论 河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌污染以阪崎克罗诺杆菌为主,种属和基因型具有多样性,系统进化树分析结果显示MLST能够更好地说明种水平之间的亲缘关系。     

婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染调查及分子分型研究

目的了解温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染情况及分子分型特征,分析不同菌株间亲缘相关性。方法参照GB 4789.40—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》方法在食品中分离鉴定克罗诺杆菌。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)方法对克罗诺杆菌进行分型研究。结果 2013—2017年共采集737份婴幼儿食品和配方奶粉,克罗诺杆菌总检出率为6.1%(45/737)。其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高(23.4%,37/158)。45株克罗诺杆菌属于阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)和莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)。其中阪崎克罗诺杆菌最多(73.3%,33/45),其次为丙二酸盐克罗诺杆菌(24.4%,11/45)。MLST共分为25个ST型,其中ST64、ST1、ST40、ST4和ST7为优势型别。45株克罗诺杆菌PFGE分型得到38个带型,未发现有明显的优势分型和聚集现象。PFGE型和MLST型结果分析表明,绝大数具有相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型,而相同MLST型却不一定具有较高的亲缘关系。结论温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌的污染状况较轻,其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高。食品来源的克罗诺杆菌图谱具有高多态性和离散性。     

我国婴儿配方粉来源的克罗诺杆菌脉冲场凝胶电泳分子分型和多位点序列分型研究

目的探讨我国婴儿配方粉污染克罗诺杆菌的主要分子分型特征,分析不同地区间菌株亲缘相关性,为我国克罗诺杆菌引起的疾病溯源提供技术支撑。方法采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)两种方法,对全国19个省/自治区/直辖市婴儿配方粉来源的49株克罗诺杆菌进行分型研究。结果 49株克罗诺杆菌PFGE分型得到38个带型,未发现有明显的优势分型和聚集现象。MLST共获得15个已知序列型(ST型)和2个新ST型,ST4、ST1和ST64为优势型别,分别占菌株总数的20.4%(10/49)、18.4%(9/49)、10.2%(5/49)。PFGE型和MLST型结果分析表明,具有相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型,而相同MLST型却不一定具有较高的亲缘关系。结论我国婴儿配方粉来源的克罗诺杆菌图谱具有高多态性和离散性,据此预测我国婴儿配方粉污染克罗诺杆菌导致婴儿患病以散发为主,出现多人患病的暴发事件几率较低。     

婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的分离鉴定及分型

采集了市场中的220份婴儿配方乳粉,利用生理生化和分子鉴定的方法对采集样品中的克罗诺杆菌进行了分离鉴定,检出10株克罗诺杆菌,污染率为4.55%。利用16S r RNA和omp A基因对克罗诺杆菌进行分型分析,都将10株克罗诺杆菌分为了2个簇,但是不同分型方法各个簇中的菌株不同。结果表明16S r RNA和omp A基因可以用于克罗诺杆菌的分型,但是辨识度不高。     

婴幼儿食品源阪崎克罗诺杆菌的3种分型方法

阪崎克罗诺杆菌污染婴幼儿食品可能导致新生儿和婴幼儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎,对其健康造成严重威胁。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)和肠杆菌间保守重复序列PCR(ERIC-PCR)对分离于婴幼儿配方乳粉、米粉和辅食中的阪崎克罗诺杆菌进行分子分型,计算3种分型方法的辛普森多样性指数(DI)值,评价3种方法的分型效率,以便精确和快速开展阪崎克罗诺杆菌流行病学研究。PFGE、MLST和ERIC-PCR可分别将37株阪崎克罗诺杆菌分为35个PFGE基因型、28个ERIC-PCR型和23个序列(ST)型,分型结果的DI值分别为99.55%,96.40%和98.05%。3种方法对阪崎克罗诺杆菌均具有较高的分型能力,其中PFEG分型能力最高,分型效率最佳。     

市售婴幼儿米粉中克罗诺杆菌的分子分型和耐药分析

为了解婴幼儿配方米粉中克罗诺杆菌的污染情况、分子分型特征及耐药性情况,采集广西区内市售6个厂家和品牌不同配方的婴幼儿米粉进行克罗诺杆菌分离及fusA基因的扩增、测序和MLST数据库比对分析。并应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对菌株进行分型鉴定及微量肉汤稀释法测定分离株对8种常见抗生素的最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentrations,MICs）。采集的268份婴幼儿米粉共分离到32株克罗诺杆菌,检出率为11.94%,菌株鉴定结果显示32株分离株包括22株C.sakazakii、6株C.malonaticus、3株C.dublinensis和1株C.muytjensii。不同添加成分的婴幼儿配方米粉污染情况差异明显,其中添加淮莲和果蔬的米粉污染率最高为17.78%和15.38%。PFGE分析显示32个菌株共分成32种不同的分子型,相似度为61.20%~92.30%,所有分离株对环丙沙星、庆大霉素和头孢噻肟都敏感,部分菌株（6.25%~43.75%）对氯霉素、四环素、甲氧苄啶/磺胺甲基异恶唑、头孢西丁和萘啶酸表现为中等敏感,有2个菌株对氯霉素表现为抗性。结果表明市售婴幼儿配方米粉中存在一定的克罗诺杆菌污染,尤其是添加营养成分的米粉。婴幼儿配方米粉中克罗诺杆菌污染来源广泛,部分菌株对一些抗菌药表现为中等敏感甚至是抗性,提示克罗诺杆菌对抗菌药的敏感性呈现减弱的趋势。     

婴幼儿配方米粉克罗诺杆菌污染调查与分析

目的:了解广西区内市售婴幼儿配方米粉中克罗诺杆菌污染情况,并对添加的配方原料与受污染情况相关性进行初步分析,为生产企业改良生产流程提供依据。方法:采集广西区内市售不同添加成分的婴幼儿配方米粉125份,进行克罗诺杆菌分离鉴定。通过PCR方法对分离菌株fus A基因进行扩增并测序,在克罗诺菌多位点序列分型数据库比对分析,鉴定细菌种类。结果:在受检样品中克罗诺杆菌检出率为16.00%(20/125)。不同添加成分的污染率不同,从高到低分别为淮山(淮莲)配方米粉污染26.09%(12/46)、蔬果类配方米粉15.00%(3/20)、高蛋白配方米粉8.82%(3/34)、营养米粉(无添加)8.00%(2/25)。MLST比对表明分离的20株克罗诺杆菌中包括14株C.sakazakii、3株C.malonaticus,2株C.dublinensis和1株C.muytjensii。结论:广西区市售婴幼儿配方米粉受克罗诺杆菌污染较为严重,且污染与配方原料添加的种类有关,污染的主要菌种为C.sakazakii。     

阪崎克罗诺杆菌的ITS序列分析

以分离自不同来源(不同地区乳制品及某一企业婴儿配方乳粉加工生产环境)、经API20E鉴定为阪崎克罗诺杆菌的37株分离株为研究对象,采用ITS序列对其进行鉴定分析。结果表明,ITS序列分析在阪崎克罗诺杆菌鉴定中具有一定的优越性,且研究发现,ITS序列中含有两种功能基因tRNAgul和tRNAile+ala,这为今后阪崎克罗诺杆菌的鉴定及ITS基因的进一步分析提供了可供参考的理论依据。     

常用消毒剂对不同材料表面克罗诺杆菌的影响

以5株分离自婴儿配方乳粉及其加工环境中的克罗诺杆菌为研究对象,研究常用消毒剂对不锈钢、聚四氟乙烯和玻璃这3种材料表面克罗诺杆菌的影响。结果表明:当3种消毒剂处于一定浓度时,不锈钢表面残存活菌数量明显多于玻璃表面残存活菌数量且存在显著性差异。当过氧乙酸和过氧化氢的质量浓度为分别为3 g/L和35 g/L,二氧化氯为3 g/L时,在3种料上均未检测出克罗诺杆菌。本研究为婴儿配方乳粉生产及储存过程中克罗诺杆菌的防控提供理论依据,有助于选择合适材质减少克罗诺杆菌对婴儿配方乳粉污染的可能。     

两种分子分型技术在乳制品克诺罗杆菌污染溯源分析上的比较

对2005-2006年进口婴幼儿配方奶粉等乳制品的原料及产品中分离获得的49株阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii),通过二代测序技术获得其全基因组序列,并比较两种分子分型技术的优缺点。通过二代测序技术获得49个菌株的全基因组序列,通过fusA确定菌株种属,根据多位点序列分型(Multi-locus Sequence Typing, MLST)确定序列型(ST, Sequence type)。再对32株ST13菌株进行单核苷酸多态性位点分析(single nucleotide polymorphism, SNP),并构建进化树。结果 49株阪崎肠杆菌均确认为阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)。49株C.sakazakii由8个ST(Sequence type,序列型)组成。ST13的菌株占分离菌株的绝对优势(65.3%, 32/49)。ST13菌株的SNP结果显示32株菌被分成4个组和5个独立的菌株。表明随着高通量测序技术的不断完善,通过全基因组序列的MLST分型方法完成初步分型,而针对遗传相似性很高的菌株,应用SNP分析深入分型,能对被克罗诺杆菌属(Cronobacter spp.)污染的乳粉进行快速溯源,对全球疫情调查有重要意义。     

学生宿舍和食堂环境中克罗诺杆菌污染状况及分子分型和耐药特征分析

目的 了解徐州市某学校学生宿舍和食堂环境中克罗诺杆菌污染状况、分子分型及耐药特征,为预警食源性克罗诺杆菌病暴发提供参考.方法 采集徐州市某学校学生宿舍和食堂环境样品156份,分离并鉴定克罗诺杆菌,并利用基于O-抗原的血清分型和多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术对分离株进...     

婴儿配方粉中克罗诺杆菌属菌株的分子溯源技术北大核心CSCD

克罗诺杆菌属菌株水平上的快速准确的鉴定和区分对于控制由该属引起的食源性疾病的监控、预防和控制具有十分重要的意义。同时,对于分子流行病学的研究也是至关重要的。越来越多的基因分型方法已经被用于克罗诺杆菌属内菌株的分子分型。为了切断克罗诺杆菌属菌株的传播途径和快速确定感染源,本综述主要针对目前克罗诺杆菌属菌株的分子分型方法进行了较为详细的探讨。简要介绍了克罗诺杆菌属分子分型方法的最新研究进展,以便发生乳粉污染克罗诺杆菌属菌株时能够快速溯源,防止食物中毒事件的进一步蔓延。     

婴儿配方粉中克罗诺杆菌属菌株的分子溯源技术

克罗诺杆菌属菌株水平上的快速准确的鉴定和区分对于控制由该属引起的食源性疾病的监控、预防和控制具有十分重要的意义。同时,对于分子流行病学的研究也是至关重要的。越来越多的基因分型方法已经被用于克罗诺杆菌属内菌株的分子分型。为了切断克罗诺杆菌属菌株的传播途径和快速确定感染源,本综述主要针对目前克罗诺杆菌属菌株的分子分型方法进行了较为详细的探讨。简要介绍了克罗诺杆菌属分子分型方法的最新研究进展,以便发生乳粉污染克罗诺杆菌属菌株时能够快速溯源,防止食物中毒事件的进一步蔓延。     

多位点序列分析方法在克罗诺杆菌属菌株溯源分析上的应用

克罗诺杆菌(Cronobacter)是一种急性细菌病原体,最初因与新生儿重症监护室爆发的几起致死性疾病(脑膜炎,坏死性小肠结肠炎)相关而受到人们广泛关注。目前Cronobacter PubMLST基因组和序列定义数据库(http://pubmlst.org/cronobacter/)中已包含超过2400多株克罗诺杆菌分离菌株的序列信息,阪崎克罗诺杆菌1 774株,丙二酸盐阳性克罗诺杆菌295株是其中的优势菌种,这些菌株共分离自40多个国家和地区。通过将7个位点的多位点序列分型(7-loci multilocus sequence typing,7-loci MLST)方案应用于2438株克诺罗菌株,共揭示了591种可定义的序列型(sequence type,ST),其中ST4(334株)、ST1(280株)、ST7(78株)和ST13(67株)为主要序列型。7-loci MLST对于克罗诺杆菌的致病型分型鉴定有很大帮助,但由于MLST所针对的七个基因位点在基因组总量中占比较小,导致同一ST型中包含地理来源,分离时间,宿主等不相关的菌株,而对菌株溯源结果适得其反。为了解决这一问题,本研究进一步采用基于直系同源基因簇的多位点序列分析方法(Clusters of Orthologous Genes MLST, cogMLST(1865-loci)),对PubMLST中240株已完成全基因组测序的菌株,包括阪崎克罗诺杆菌ST1(67株),ST4(95株),ST13(43株)和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌ST7(35株)进行了全基因组序列分析。结果显示,cogMLST可对ST型相同,但无相关性的菌株进行进一步分型,且不同聚类与菌株分离国家及来源之间存在一定相关性。这或许对于相同ST克罗诺杆菌属菌株的全球溯源分析及食源性疾病监测有较大帮助。     

克罗诺杆菌分型技术研究进展

克罗诺杆菌原名阪崎肠杆菌,是婴儿配方乳粉中主要的致病菌之一,能感染新生儿,并导致严重的坏死性小肠结肠炎、菌血症和脑膜炎等疾病,致死率高达40%~80%。本文综述了克罗诺杆菌常见的表型分型和分子分型方法,包括生化分型、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分型、血清型分型、脉冲场凝胶电泳分型、多位点序列分型、随机多态性扩增DNA基因分型、核糖体分型、特殊基因分型和全基因组分型,以期增加人们对克罗诺杆菌分型方法的认识,为全面揭示克罗诺杆菌的表型特征和遗传多样性提供方法和依据。     

部分茶饮料原辅料中优势菌-克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)的分离和鉴定

克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)是新兴的条件致病菌,主要通过污染的婴儿配方奶粉引起2岁以下婴幼儿严重疾病甚至死亡.在对茶饮料原辅料192份样品进行细菌总数测定和优势菌16S rDNA序列分析时,发现2批次绿茶和l批次果葡糖浆中优势菌疑似条件致病菌-克罗诺杆菌,而且其数量较高(4.0× 102cfu/g～104cfu/g).进而通过rpoB序列分析,将4个分离株鉴定为阪崎克罗诺杆菌Cronobacter sakazakii(原阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii).结果表明在常见的食品原料-果葡糖浆和绿茶中存在克罗诺杆菌的污染,rpoB分型方法在对克罗诺杆菌属细菌的鉴定到种上表现出高度特异性,灵敏而准确.     

食品中克罗诺杆菌的分离和鉴定

利用国标方法对食品(蔬菜,熟食和豆制品)进行了克罗诺杆菌的污染情况调查及其分离菌株的鉴定;利用fus A基因对分离的克罗诺杆菌进行了遗传多样性分析,将克罗诺杆菌属的分离株鉴定到种的水平。主要取得了以下结论和认识:139份食品(蔬菜23份,熟食14份和豆制品2份)中有14份样品检出了克罗诺杆菌,检出率为35.9%。蔬菜类检出8份(34.8%),熟食制品检出4份(28.6%),2份豆制品都检出(100.0%);2对14株克罗诺杆菌分离株进行基于fus A基因的系统进行分析,结果显示这些分离株包括C.Sakazakii和C.malonaticus 2个种,其中C.sakazakii有9株,C.malonaticus有5株。     

婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

目的：建立一种检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的解旋酶恒温基因扩增方法。方法：根据阪崎克罗诺杆菌ITS基因设计特异性引物,优化解旋酶恒温基因扩增法反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,人工添加阪崎克罗诺杆菌确定检出限,多种致病菌在建立的解旋酶恒温基因扩增体系中扩增验证特异性,电泳检测扩增产物。结果：解旋酶恒温基因扩增法检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌得到与设计序列长度一致的100 bp基因片段,检出限为10 CFU/g,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的终浓度分别为0.1、5.0 μg。结论：解旋酶恒温基因扩增法用于检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的特异性强、灵敏度高、耗时短,为婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供了新的方法。     

即食食品中阪崎克罗诺杆菌的分离鉴定及分子分型

为了解即食食品中污染阪崎克罗诺杆菌的流行情况,分析我国阪崎克罗诺杆菌主要流行菌株,对即食食品中分离的10株阪崎克罗诺杆菌进行基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、VITEK 2、16s rDNA鉴定,采用多位点序列分型(MLST)方法对分离菌株进行分型,并对PubMLST数据库中322株中国分...     

食品香辛料和调味品中克罗诺杆菌的分离与鉴定

利用生理生化鉴定方法和分子生物学方法对从湖南、湖北、江苏和上海等地的8个地区采集的64份干制食品香辛料和调味品样品进行了克罗诺杆菌分离与鉴定,结果从19份样品中检出了克罗诺杆菌,污染率为29.7%,其中检出率较高的样品为白胡椒粉、花椒粉和红辣椒粉,污染率分别为62.5%、50.0%和33.3%。本研究从采样的7个地区的样品中检出了克罗诺杆菌,其中检出率最高的地区为湖南永州,其次为上海市和湖北赤壁,检出率分别为50.0%、37.5%和33.3%。利用基于fus A基因序列分析的方法对克罗诺杆菌分离株进行了种的水平的鉴定,结果将本研究分离得到的克罗诺杆菌鉴定为5个种,其中9株(47.4%)被鉴定为阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii),4株(21.0%)为苏黎世克罗诺杆菌(C.turicensis),3株(15.8%)为都柏林克罗诺杆菌(C.dublinensis),2株(10.5%)为丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(C.malonaticus),1株(5.3%)为尤尼沃斯克罗诺杆菌(C.universalis)。研究结果表明市售干制食品香辛料和调味品中存在克罗诺杆菌的污染,应该加强对该类食品中克罗诺杆菌的流行病学监测。