仿刺参肠道可培养微生物多样性研究

为了解大连地区仿刺参肠道可培养微生物种群的多样性信息,用2216、TCBS和葡萄糖琼脂培养基从大连地区冬、春两季的仿刺参肠道中共分离得到141株细菌,通过16SrDNA-RFLP分析后,得到17个不同的类群。从各个类群中随机选取代表菌株进行16SrDNA序列测定和系统发育分析,结果表明,大连地区仿刺参肠道细菌主要包括假单胞菌属（Pseudomonas）,弧菌属（Vibrio）,芽孢杆菌属（Bacillus）,希瓦氏菌属（Shewanella）,交替假单胞菌属（Pseudoalteromonas）,不动杆菌属（Acinetobacter）,气球菌属（Aerococcus）,发光菌属（Photobacterium）,葡萄球菌菌属（Staphylococcus）和Kushneria菌属共10个菌属。说明大连地区仿刺参肠道可培养微生物具有一定的多样性。      

仿刺参肠道多糖的纯化及理化分析

目的：对仿刺参肠道多糖进行纯化,并对纯化产物进行理化分析。方法：使用葡聚糖凝胶(G-100)层析柱分离出两种仿刺参肠道多糖,选取其中多糖A进行研究。使用葡聚糖凝胶(G-100)柱层析法和琼脂糖凝胶电泳法进行纯度检测,葡聚糖凝胶(G-200)柱层析测定分子质量,高效液相色谱法确定其单糖组分,并结合红外吸收光谱法与核磁共振对其结构进行初步检测。结果：实验所得纯化产物多糖A为均一组分,主要含有氨基糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐和岩藻糖3种单糖,并含有少量的氨基葡萄糖、半乳糖。其中岩藻糖有α和β两种构型,以α-岩藻糖硫酸酯残基、β-岩藻糖硫酸酯残基形式存在。分子质量约为18.8×104D。结论：该纯化产物多糖A为一种酸性多糖,推测其为硫酸软骨素类。     

仿刺参相关微生物对致病灿烂弧菌的拮抗及机理研究

从健康的仿刺参体表以及肠道中分离得到37株细菌,以仿刺参"腐皮综合症"致病菌灿烂弧菌(Vibriosplendidus)为指示菌,采用十字交叉划线法和纸片法进行体外拮抗试验,两种方法筛选出对灿烂弧菌(Vibriosplendidus)有拮抗作用的菌株分别为20种和8种。选择对灿烂弧菌有较强拮抗作用的7种菌株进行拮抗机理研究。研究表明:7株菌均是通过营养物质和生存空间竞争及产生有抑菌活性的胞外产物两种方式协同抑菌。其中,编号为CG-6-1的Pseudoalteromonas sp.主要分泌蛋白类等和比较大的极性分子,其胞外产物经过硫酸铵沉淀,在80%饱和度时抑菌活性最高,因此推断其产生的抑菌物质是蛋白类物质。     

仿刺参雌性生殖腺皂苷的免疫增强活性研究

目的：以仿刺参雌性生殖腺皂苷(gonad saponins from female of Apostichopus japonicus,AGS)为研究对象,探究其免疫增强活性。方法：通过对巨噬细胞吞噬能力和细胞因子的测定,研究AGS的体外免疫调节活性;通过对免疫低下小鼠胸腺、脾脏指数,碳廓清指数与吞噬指数,腹腔巨噬细胞增殖活性,脾细胞增殖活性,自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)活力,T淋巴细胞亚群水平及小鼠血清细胞因子的测定,分析AGS在小鼠体内的免疫调节活性。结果：体外实验表明,AGS能提高小鼠体外巨噬细胞吞噬能力,促进TNF-α、IL-6、IFN-γ的分泌,且各组与正常组相比差异显著(P<0.05);体内实验表明,与模型组相比,中剂量组和高剂量组AGS均能显著提高小鼠胸腺、脾脏指数、碳廓清指数和吞噬指数(P<0.05),显著增强腹腔巨噬细胞和脾细胞增殖活性(P<0.05),显著增强NK细胞的活性(P<0.05),显著提高CD4⁺/CD8⁺水平(P<0.05),显著促进TNF...     

仰韶陶融型白酒大曲可培养微生物多样性研究

研究陶融型白酒大曲可培养微生物的多样性。采用组织培养方法分离陶融型白酒大曲的微生物,提取分离菌株DNA,用酵母通用引物NL1/NL4、细菌通用引物799F/1492R和真菌通用引物ITS1/ITS4对酵母26S rRNA、细菌16S rRNA、霉菌28S rRNA序列扩增,提交测序分析,构建系统发育树。仰韶陶融型白酒大曲酒曲中共分离到酵母213株、细菌386株、霉菌73株,酵母归分为72株形态种,细菌归分为77株形态种,霉菌归分为7株形态种,根据测序结果不同,陶融型白酒大曲微生物被分为21个分类单元。仰韶陶融型白酒大曲可培养微生物具有多样性特征,为其发酵及开发利用提供理论参考。     

仿刺参肠道组织酶解工艺优化及肽段分析

以仿刺参肠道组织为原料,优化酶解工艺条件,研究梯级肽对小鼠原代巨噬细胞过氧化氢损伤的保护作用。采用单因素试验及响应面试验分析法对酶解工艺条件进行优化,利用超滤法获取不同截留分子质量的肽段,采用噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法检测细胞活力。结果表明：通过响应面优化得最佳条件为：酶解温度50.10 ℃、酶解时间2.84 h、加酶量2.639万 U时水解度可达41.82%。通过超滤制备,分别得到分子质量小于650、650～1 000 u与1 000～10 000 u肽段,各肽段均能显著提高过氧化氢损伤细胞的细胞活力值,所获肽段对过氧化氢损伤巨噬细胞具有显著保护作用,其中小于650 u肽段更佳。     

实时荧光聚合酶链式反应技术快速鉴定仿刺参

基于仿刺参线粒体COX1基因、NAD4基因分别设计特异性检测引物和探针,采用TaqMan探针实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术进行仿刺参的特异性鉴定检测。对21 种海参样品进行实时荧光PCR检测的特异性检验,并对每个样品做3 个平行实验,计算Ct平均值、标准偏差及变异系数,评估检测方法的重复性。结果表明：所设计的引物和探针可以特异性的鉴别仿刺参,方法的变异系数均小于2%,表明本研究设计的引物和探针具有良好的重复性。本研究所建立的快速检测仿刺参的方法快速、简便,既克服了传统海参鉴别方法的局限性,同时又结合了荧光PCR技术高效率、低污染的优点,为仿刺参真伪鉴别研究提供了有价值的参考意见。     

青稞酒大曲微生物的分离鉴定及可培养微生物变化规律分析

采用传统微生物分离技术结合PCR测序,分析青稞酒大曲中的微生物数量关系和多样性组成.从青稞酒制曲及储存期样本中分离出酵母菌37株,细菌22株,霉菌13株,经鉴定为Saccharomycop-sis fibuligera、Wickerhamomyces anomalus、Bacillus subtilis、Staphyl...     

仿刺参酶解液抑制黄嘌呤氧化酶活性的研究

目的:为了充分利用仿刺参这一海洋资源,开发其活性成分,研究了仿刺参的最优酶解条件并探讨仿刺参通过抑制黄嘌呤氧化酶活性对大鼠高尿酸血症的预防效果。方法:以水解度为指标,通过单因素试验对酶解温度、酶解时间、加酶量等酶解工艺参数进行研究,采用响应面法优化酶解工艺。以酵母膏淀粉混合液配合氧嗪酸钾构建大鼠高尿酸血症模型。分别灌胃造模后的SD大鼠,30 d后,测定大鼠的脏器系数及血清中XOD活力,UA和BUN含量。利用基因芯片技术比较不同组别间基因的表达水平。同时利用RT-qPCR技术验证基因芯片结果。结果:选用复合蛋白酶,酶解温度55℃,酶解时间136 min,加酶量1.97%,水解度最高。仿刺参酶解液能显著改善大鼠的脏器系数,降低大鼠血清中的UA和BUN含量,降低XOD活性,抑制黄嘌呤氧化酶的活性,降低尿酸的合成产生。与模型组的差异表达比较,试验组基因表达水平有显著改变,其中表达上调的基因36个,表达下调的143个。结论:仿刺参营养丰富,可以抑制黄嘌呤氧化酶的活性,具有抗高尿酸血症的作用,是一种预防痛风的食品。     

处理方法对仿刺参体壁蛋白纤维超微结构的影响

目的:探讨不同处理方法对仿刺参体壁蛋白纤维超微结构的影响。方法:测定仿刺参的基本营养成分;利用差示热量扫描仪(DSC)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)和扫描电镜对仿刺参的热反应变化过程、红外吸收光谱和超微结构进行分析。结果:仿刺参是一种高蛋白、低脂肪,营养价值极高的滋补品。DSC测试表明仿刺参的热收缩温度为51.4℃。红外光谱显示,仿刺参体壁具有胶原蛋白的特征吸收峰。电镜扫描显示,新鲜仿刺参纤维纤细,分布均匀,结构整齐有序。酸处理的纤维变粗、无序,结构变得致密;碱处理的纤维弯曲缠绕,纤维间空隙变大,整个形态发生明显变化;盐处理的纤维变化不明显,有少量纤维吸水膨胀溶解;酶处理的纤维随着作用时间的延长,呈现溶胀、断裂、局部聚集。     

刺参体内铝的富集和消除规律研究

目的研究铝在刺参体内的富集和消除规律。方法选取体重为(50±10) g的刺参暴露于铝浓度分别为50、150、300μg/L的海水中进行富集实验,分别在第0、1、3、5、7、10、15、21、30 d取样检测分析。富集实验结束后,放入自然海水中开始消除实验,分别在第1、3、7、14、21、35、45 d取样检测分析。结果3个实验组刺参体壁中铝的蓄积量范围为10.0～18.2mg/kg、富集系数范围为53.2～160、最终消除率范围为67.0%～78.6%;纵肌中铝的蓄积量范围为32.2～60.0mg/kg、富集系数范围为189～582、最终消除率范围为84.7%～88.2%;呼吸树中铝的蓄积量范围为69.2～120mg/kg、富集系数范围为365～1143、最终消除率范围为77.9%～86.4%;消化道中铝的蓄积量范围为78.7～275mg/kg、富集系数范围为865～1275、最终消除率范围为74.8%～86.1%。结论刺参各组织铝蓄积量、富集系数随暴露时间的延长而增大,各组织对铝蓄积量和富集系数大小顺序均为消化道呼吸树纵肌体壁,消化道和呼吸树是刺参富集铝的主要器官。刺参纵肌、呼吸树和消化道对铝的蓄积量、富集系数均随暴露浓度的增大而增大,体壁对铝的蓄积量也随暴露浓度的增大而增大,但体壁对铝的富集系数随暴露浓度的增大而减小。消除实验期间,刺参体壁、纵肌、呼吸树和消化道中铝残留量随消除时间的延长而降低,呈现前期消除较快,后期逐渐平稳的趋势;消除实验结束,3个浓度组刺参中铝的最终残留量与对照组相差不大。     

仿刺参共附生真菌Aspergillus terreus来源的聚酮类化合物的研究

海参是海洋中重要的食物和药物资源,含有丰富的活性物质。海参共附生微生物非常丰富。为了从海参共附生微生物获得具有强生物活性的物质,对山东芝罘岛海域的仿刺参来源的共附生真菌Aspergillus terreus利用分子生物学手段进行了种属鉴定,并利用固体基进行培养,对其次级代谢产物进行了研究。通过薄层层析、柱层析、高效液相色谱对其化学成分进行了分离和纯化,综合核磁波谱、质谱对其进行结构鉴定。从该菌中获得dihydrogeodin(1)、Territrems A(2)、Territrems B(3)、2,4-二羟基苯乙酮(4)、questin(5)和emodin(6)六种物质。利用人口腔上皮癌细胞株(KB)和多药耐药性的细胞株(KBv200)对1,5和6进行了细胞毒活性测试。本研究首次对化合物1进行了完整的谱图解析,并首次发现海洋环境来源的微生物可以代谢化合物dihydrogeodin(1),以及具有强抑制乙酰胆碱酶活性Territrems(3),而这些物质是海参本体不能够产生的,为开发具有预防和治疗帕金森病相关的功能食品提供了新来源。     

木瓜蛋白酶提取刺参消化道多糖

采用酶解法提取仿刺参消化道多糖并进行初步性质测定。方法：通过木瓜蛋白酶酶解获得粗多糖,并综合考虑酶解时间、温度、加酶量的影响,获得优化的酶解条件;采用三氯醋酸法除蛋白,Sephacryl S-400 凝胶柱层析进行纯化,并测定其相对分子质量和硫酸基含量。结果：酶解最佳条件为加酶量10400U/g,酶解温度55℃,酶解时间6h,多糖得率8.11‰;纯化多糖为组分单一的酸性多糖,分子质量约25kD,硫酸基含量约为9.29%。     

响应面法优化刺参(Apostichopus japonicus)中金刚烷胺检测

目的利用响应面分析法优化刺参中金刚烷胺的检测。方法在单因素基础上,确定采用1%乙酸乙腈作为提取溶剂,以1%乙酸乙腈的添加量、超声时间、PSA吸附剂的添加量、C_(18)吸附剂的添加量为影响因素,以金刚烷胺的回收率为响应值,根据Box-Behnken试验设计原理对刺参中金刚烷胺提取条件进行响应面分析,优化前处理条件。结果1%乙酸乙腈为15 mL,超声提取10 min, PSA吸附剂为250 mg时刺参中金刚烷胺的回收率最大。在此优化条件下进行验证性试验,测得金刚烷胺的回收率为118%,与预测值相对误差为9.62%。实际检测刺参样品20个,2个样品检出,分别为4.3、1.6μg/kg。结论该优化前处理方法具有良好的可行性。     

响应面试验优化盐渍仿刺参脱盐工艺

为了提高脱盐速率和减少营养损失,以盐渍仿刺参为原料,采用常压静水脱盐方式,研究了温度、料液比、脱盐时间、换水次数对脱盐效果的影响,通过单因素和响应面法对影响盐渍仿刺参脱盐工艺的主要因素进行分析优化。结果表明:在相同的脱盐温度下,影响盐渍仿刺参脱盐工艺的因素按主次顺序排列为:料液比>脱盐时间>换水次数;确定了盐渍仿刺参脱盐的最佳工艺条件为:脱盐温度25℃,料液比1∶4.3 g/m L,换水次数2,每隔240 min进行换水,在此条件下测得脱盐率可达到85.98%±0.22%,与预测值吻合度好。      

刺参中过氧化物还原酶peroxiredoxin4的抗氧化活性分析

目的 研究刺参中的抗氧化活性物质Peroxiredoxin4。方法 利用生物信息学方法对刺参Peroxiredoxin4一级结构进行分析,克隆并表达重组刺参Peroxiredoxin4蛋白,构建DTT/Fe3+/O2混合功能氧化酶体系,确定重组刺参Peroxiredoxin4蛋白功能。结果 刺参Peroxiredoxin4氨基酸序列含有活性Cys,且活性Cys位于Prx4保守基序FYPLDFTFVCPTEI和HGEVCPAGW中,克隆得到的重组刺参Peroxiredoxin4蛋白能够保护DNA免遭氧化剂损伤。结论 重组刺参Peroxiredoxin4蛋白具有抗氧化生物学活性。     

仿刺参精低分子质量多肽的制备及抗氧化作用

本实验以仿刺参精为原料,制备出多肽并考察其体外和体内抗氧化活性。以清除羟自由基（•OH）能力为指标,考察木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶的5 种酶解方式产生的酶解产物的活性,优化实验用酶。经超滤分级后,测定各级组分的分子质量分布、可溶性蛋白质含量、多肽含量和清除•OH能力。选择清除•OH能力较好的低分子质量多肽组分,测定氨基酸组成,设定低、中、高剂量组（100、200、600 mg/kg（以体质量计,下同））、模型对照组、和空白对照组进行42 d小鼠灌胃实验。实验完成后,检测小鼠血液中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活力、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活力、谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量和蛋白质羰基含量。结果表明,由木瓜蛋白酶水解,经超滤制备的＜1 000 u仿刺参精多肽具有较好的体外清除•OH能力,其半数抑制浓度为6.02 mg/mL,含量占比为58%,氨基酸组成中谷氨酸等酸性氨基酸和酪氨酸等疏水性氨基酸含量丰富。小鼠抗氧化模型实验表明,实验组生长正常,高剂量多肽组小鼠体内SOD活力显著提高（P＜0.05）,GSH的含量提高极显著（P＜0.01）、GSH-Px活力也呈剂量依赖性升高,但未达到差异显著（P＞0.05）。MDA和蛋白质羰基含量得到有效降低,后者达到差异显著（P＜0.05）。研究结果显示：＜1 000 u仿刺参精多肽具有提高小鼠抗氧化能力的效果,可以作为相关功能产品开发的原材料。     

仿刺参卵多糖的分离纯化及体外抗肿瘤活性

目的：探究仿刺参卵多糖的结构及体外抗肿瘤活性。方法：通过酶解醇沉获得仿刺参卵粗多糖（polysaccharides from Apostichopus japonicus spawn,SPS）;通过色谱柱纯化后进行理化性质分析;采用噻唑蓝法研究卵多糖对HeLa、HGC-27细胞的体外增殖抑制作用。结果：获得3 种不同多糖组分SPS-1、SPS-2、SPS-3,对干预的肿瘤细胞均有显著抑制作用。SPS-1抑制作用最强,对HeLa及HGC-27细胞的最高抑制率分别为98.04%、99.4%。结论：从仿刺参卵中分离出3 种多糖组分,均表现出一定的抑制肿瘤细胞增殖活性。