消旋氧氟沙星抗体制备及其手性识别特性研究

采用活泼酯法（A）和直接EDC（1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亚胺盐酸盐）法（D）,合成两种包被抗原（OFL-A-OVA和OFL-D-OVA）和两种免疫抗原（OFL-A-BSA和OFL-D-BSA）,然后分别用两种免疫抗原免疫小鼠获得与其对应的多克隆抗体,建立消旋氧氟沙星残留免疫检测方法。研究结果表明:紫外扫描图谱证明四种抗原均合成成功,OFL-A-BSA、OFL-D-BSA、OFL-A-OVA和OFL-D-OVA的偶联比分别为19.67、3.03、1.93和0.99。消旋氧氟沙星的间接竞争ELISA法的线性检测范围为16.35～444.10ng/mL,IC50为5.42ng/mL,最低检测限为6.23ng/mL。消旋氧氟沙星抗体与恩诺沙星、环丙沙星、加替沙星等其他同类药物的交叉反应率较低,表明消旋氧氟沙星抗体具有较高的特异性,且消旋氧氟沙星抗体对左旋氧氟沙星和右旋氧氟沙星的识别并非对等,对左旋的识别能力较大,左旋氧氟沙星对抗体的产生起主要作用。      

沙丁胺醇多克隆抗体的制备与鉴定

为了对沙丁胺醇进行酶联免疫吸附法(ELISA)测定,通过四种方法制备沙丁胺醇衍生物,分别将其与牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,制备人工完全抗原,采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度并计算偶联比,用所制备的四种免疫原免疫新西兰白兔获得抗沙丁胺醇(SAL)抗体,每一种抗体都用四种包被抗原进行配对筛选,据此得到最佳的抗体-包被抗原的组合,对筛选出的抗体用正辛酸-硫酸铵法进行纯化,采用间接ELISA法测定多克隆抗体(pAb)的效价并进行特异性鉴定。结果表明:成功偶联了完全抗原,四种免疫原的偶联比分别为9:1、6:1、6:1、12:1,得到最佳的抗体-包被抗原的组合,筛选出的抗体效价达到1:64000,此抗体对克伦特罗和特布他林的交叉反应率分别为144%和169%,对其他类似物几乎没有交叉反应。本研究为沙丁胺醇、克伦特罗和特布他林多残留酶联免疫检测法的建立奠定了基础。     

丙烯酰胺多克隆抗体的制备

通过活化酯法制备了三种丙烯酰胺人工抗原并进行动物免疫,得到高效价抗体,经测定三种抗血清效价分别为1∶32000、1∶40000、1∶80000.比较三种人工抗原,使用对巯基苯甲酸衍生方法获得的抗体对衍生产物表现了很高的特异性,经测定针对1μg/mL衍生产物的抑制率达到80.7％,而针对丙烯酰胺及对巯基苯甲酸均无交叉反应.本研究为建立快速检测食品中丙烯酰胺残留的ELISA方法奠定基础.     

新霉素酶联免疫检测方法的研究——新霉素抗体的制备

以碳化二亚胺作为偶联剂,分别将新霉素(Neomycin,NEO)和牛血清白蛋白(Bovine serum albu-min,BSA)、血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)进行偶联,得到偶联产物BSA-NEO和KLH-NEO。对BSA、KLH、NEO及其偶联产物BSA-NEO、KLH-NEO进行红外光谱分析,结果显示偶联产物的红外光谱中同时存在载体蛋白和NEO的特征吸收峰,初步证明偶联成功;将偶联产物BSA-NEO和KLH-NEO作为新霉素免疫抗原,分别免疫新西兰大白兔,成功获取新霉素抗血清,间接ELISA法测得抗血清效价可达1.28×105以上。     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。     

甲基苯丙胺人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

利用化学法合成甲基苯丙胺人工抗原,将此抗原免疫新西兰大白兔制备抗甲基苯丙胺多克隆抗体,利用EDC法将甲基苯丙胺人工抗原与蛋白质载体BSA偶联,经蛋白质电泳以及紫外扫描检测,证明甲基苯丙胺人工抗原合成成功.用间接酶联免疫检测法检测,证明制备得到了高效价的甲基苯丙胺多克隆抗体血清,且与甲基苯丙胺人工抗原具有高特异性反应,可用于甲基苯丙胺免疫学检测方法的研究。     

庆大霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

为研究建立庆大霉素的免疫分析技术,合成庆大霉素人工抗原:采用碳二亚胺法将庆大霉素(gentamicin,GM)偶联到牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)上,分别合成免疫原GM-BSA和包被原GM-OVA。通过紫外扫描和SDS-PAGE垂直电泳鉴定证明人工抗原偶联成功。以GM-BSA为免疫原,采用新的动物免疫方案免疫新西兰大白兔,获得抗庆大霉素抗血清。在本次免疫新方案中,在动物的生命周期内获得了多于普通免疫的血清量,在多抗血清的制备上是一次抗体工程上的尝试。通过间接酶联免疫对抗血清效价和灵敏度进行跟踪检测,结果表明抗血清效价在九免后稳定在1:20000左右,IC50则稳定在3 ng/mL左右。并在八免血清基础上建立了GM间接竞争ELISA法。结果表明,庆大霉素浓度在0.3~243 ng/mL,方法的线性回归方程为y=-0.1009lnx+0.6093和R2=0.9845,方法的检测灵敏度IC50=2.954 ng/mL,最低检测限IC10=0.056 ng/mL。该研究结果为多抗血清制备在量上的突破提供了思路,同时为研制庆大霉素试剂盒提供了良好的基础。     

展青霉素人工抗原及多克隆抗体的研制

采用戊二酸酐法合成展青霉素-半戊二酸（PAT-HG），通过活泼酯法将PAT-HG偶联到牛血清白蛋白，制备了展青霉素免疫抗原（PAT—HG—BSA），免疫3只BALB／c小鼠，经4次免疫后，1号小鼠血清抗展青霉索抗体效价迭1：1600，且小鼠抗展青霉素多克隆抗体与展青霉素检测抗原的结合能被展青霉素阻断。     

链霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

通过研究链霉素(SM)人工抗原的合成和多克隆抗体的制备,建立链霉素残留的免疫分析方法。以氧-缩甲基羟胺肟化链霉素的醛基,引入羧基,再用碳二亚胺法将半抗原与蛋白质载体连接,合成免疫原SM-cBSA。用戊二醛法合成包被原SM-OVA。用紫外扫描、SDS-PAGE分析偶联情况,计算得链霉素与cBSA、OVA的分子偶联比分别为7.6:1与17.7:1。经动物免疫获得效价为1:40000的链霉素多克隆抗体,采用间接竞争ELISA测定IC50为3.32ng/mL,与双氢链霉素的交叉反应率为105.21%,与同类的其他药物均无交叉反应。     

莱克多巴胺的抗原合成鉴定及其抗体的制备纯化

莱克多巴胺属于β-兴奋剂类药物中的苯乙醇类衍生物，具有显著改善动物饲料利用效率，显著提高胴体瘦肉率的生产性能，因为其具有严重的副作用所以H前该类药物在我国和其他国家是被禁用的。本试验通过连接剂butane-1，4-diol diglyciydylether把莱克多巴胺和载体蛋白BSA和OVA偶联成免疫抗原和包被抗原，并采用紫外全波长扫描和SDS-聚丙烯酰胺凝胶的方法对合成的抗原进行了鉴定。通过免疫兔子获得了RCT的多克隆抗体，然后又通过饱和硫铵沉淀和proteinA-Sepharose4B的方法对抗体进行了纯化。纯化的抗体表现出对RCT较高的特异性和灵敏性。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原和多克隆抗体的制备

对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的两种半抗原合成方法进行对比研究,合成半抗原,并采用活化酯法将半抗原与牛血清白蛋白偶联制备得到免疫原,通过特定程序免疫日本大耳白兔获得了多克隆抗体.抗血清效价为1∶32 000,proteinA-sepharose 4B 亲和层析纯化的DON抗体与DON、3-AC-DON(3-乙酰氧基脱氧雪腐镰刀菌烯醇)、15-AC-DON(15-乙酰氧基脱氧雪腐镰刀菌烯醇)、T-2毒素、OTA(赭曲霉A)、ZEN (玉米赤霉烯酮)的交叉反应率分别为:100%、500%、2.50%、0.10%、0.01%、0.01%,表明了所制备DON抗体的高特异性.     

1-芘丁酸人工抗原的制备及鉴定

为制备及鉴定1-芘丁酸（1-pyrenebutyric acid）人工抗原。采用碳化二亚胺（EDC）法将1-芘丁酸与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清白蛋白（OVA）进行偶联,合成人工免疫原PBA-BSA和人工检测抗原PBA-OVA;紫外扫描及SDS-聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示抗原制备成功;鼠源多抗血清的效价均已超过1 000,IC₅₀=14.31 ng/mL;与多环芳烃1-芘甲醇、1-芘甲醛、芘的交叉反应率小于14.40%,与菲、萘、苯并芘、BSA以及OVA交叉反应率均小于0.05%。作者成功制备出了PBA-BSA抗原,并且得到了敏感性良好的鼠源多抗血清,为后期单克隆抗体的制备及免疫学快速检测方法的建立奠定基础。     

玉米赤霉烯酮多克隆抗体的制备及特性分析

合成玉米赤霉烯酮半抗原,应用液相色谱-质谱联用法进行鉴定,并采用活泼酯法将半抗原与载体蛋白OVA或BSA偶联,分别作为免疫原或包被原,并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和紫外扫描法鉴定偶联效果,免疫3只BALB/c小鼠,制备玉米赤霉烯酮多克隆抗体。结果表明:抗血清效价最高达1∶32 000,以此多抗建立的玉米赤霉烯酮间接竞争标准曲线IC50为39.8ng/mL,IC10为0.71ng/mL,多抗与玉米赤霉烯酮类似物β-zearalenol、zear-alanone、α-zearalanol、β-zearalanol交叉反应率分别为4.80%,3.07%,0.96%,0.09%。说明试验成功制备了玉米赤霉烯酮人工抗原及高特异性多克隆抗体。     

高特异性黄曲霉毒素B_1单克隆抗体的制备及特性研究

本研究将黄曲霉毒素B1转化为半缩醛B2a,在硼氢化钠（NaBH4）还原作用下与载体蛋白偶联制备完全抗原。将制备的完全抗原免疫Balb/c小鼠,经4次免疫后取其脾脏与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0细胞融合,采用半固体培养基筛选后鉴定,获得杂交瘤细胞株3A12,抗体的灵敏度可达6.1±0.025ng/mL,抗体与其它黄曲霉毒素B2、G1及G2的交叉反应率依次为7.8%、20.2%及0.6%,与黄曲霉毒素M1交叉反应率小于0.1%。本研究为研发花生等农产品黄曲霉毒素B1特异性免疫分析技术及产品奠定了重要基础。     

小麦球蛋白单克隆和多克隆抗体制备及建立酶联免疫吸附法快速检测技术

目的建立小麦球蛋白的ELISA检测技术,用于蛋白质掺假以及过敏原成分的快速检测。方法从麦胚粉中提取球蛋白,抗原免疫Balb/c小鼠进行4次免疫后,通过脾脏细胞杂交瘤技术及间接ELISA筛选制备单克隆抗体,同时制备兔抗小麦球蛋白的多克隆抗体。通过棋盘滴定法,初步确定单克隆抗体和多克隆抗体的最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA。结果通过免疫和杂交瘤技术获得了抗小麦球蛋白的单克隆抗体,纯化后抗体的效价均达到1:107,通过免疫兔制备的多克隆抗体经纯化后效价在1:2.4×105左右,所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测限为10 ng/m L,与其他物种的蛋白不发生交叉反应。结论本文建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的特异性和灵敏度,为建立乳品中小麦成分掺假及过敏原成分快速检测提供理论依据。     

甲硝唑人工抗原的合成及鼠源多抗的制备

为了获得效价高、特异性好的甲硝唑（metronidazole,MNZ）的小鼠多抗血清,采用琥珀酸酐法将甲硝唑上的羟基改造成羧基,然后通过碳二亚胺法把改造后的甲硝唑分别与牛血清白蛋白（albumin from bovine serum,BSA）和卵清蛋白（ovalbumin,OVA）进行偶联,制备免疫原MNZ-BSA和包被原MNZ-OVA。经紫外扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳初步鉴定偶联成功。将免疫原MNZ-BSA分成20 μg/只和50 μg /只2 个剂量分别免疫8 周龄的BALB/c小鼠。获得了效价高、特异性好的小鼠多抗血清,效价均达到1∶104以上,IC50值为61.39 ng/mL。     

氧氟沙星单克隆抗体的制备及生物条形码检测技术的研究

为了建立快速、高效的免疫检测方法,为小分子药物残留提供新方向。本实验首先采用碳二亚胺法合成氧氟沙星完全抗原,后用免疫原免疫小鼠,将特异性强的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过杂交瘤细胞的多次“筛选-亚克隆”过程,制备氧氟沙星单克隆抗体。其次制备纳米金复合探针、磁性纳米探针,然后建立基于荧光定量PCR的生物条形码检测方法,在最优条件下采用荧光定量PCR生物条形码检测方法来间接测定氧氟沙星残留量。氧氟沙星线性回归方程为y=14.4263Logx+0.09184,R2=0.96。浓度范围在0.1-128 ng/mL时,检出限为0.17 ng/mL。结果表明基于荧光定量PCR生物条形码免疫分析方法检测氧氟沙星的结果可靠,能够应用于实际样品的检测中。     

盐酸可乐定人工抗原的合成及鼠源多抗血清ELISA鉴定

目的：获得敏感性高,特异性强的新型瘦肉精盐酸可乐定（Clonidine hydrochloride,CLO）鼠源多抗血清。方法：以CLO的衍生物盐酸阿可乐定（Apraclonidine hydrochloride,ACLO）为半抗原,采用戊二醛法将ACLO分别与牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）和鸡卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）偶联,合成免疫抗原CLO-BSA和包被抗原CLO-OVA。采用紫外扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其偶联效果后,免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清。利用间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定其免疫学特性。结果：合成的人工抗原免疫效果较好,所获小鼠多抗血清效价均达到1∶12 800以上,其中3号小鼠敏感性最好,半数抑制质量浓度（IC₅₀）为82.75 ng/mL,与其他几种常见的瘦肉精类药物的交叉反应率均小于0.9%,特异性良好。结论：通过戊二醛法成功合成了高免疫原性的CLO人工抗原,并获得敏感性高,特异性强的CLO鼠源多抗血清。