T-2毒素人工抗原的制备

在蒸气浴条件下,T-2毒素与琥珀酸酐(HS)反应合成了T-2HS,薄层层析显示,目标半抗原合成成功;然后通过碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原,采用紫外扫描及SDS-PAGE鉴定。结果显示,T-2HS能与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)结合生成T-2毒素抗原。紫外扫描分析表明,T-2毒素与牛血清白蛋白的偶联比为6.66∶1、与卵清蛋白的偶联比为10.11∶1,表明此完全抗原能够用于免疫动物。为进一步制备T-2毒素抗体奠定了基础。     

苯胺嘧啶类杀菌剂嘧霉胺人工抗原的合成与鉴定

[目的]合成嘧霉胺完全抗原并加以鉴定。[方法]对嘧霉胺的结构进行设计,合成N-(4,6-二甲基嘧啶基-2-基)-1,4-苯二胺,通过与琥珀酸酐合成引入羧基得到嘧霉胺的半抗原。用混合酸酐法将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原,用活泼酯法将半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联制备包被原。[结果]半抗原的结构经~1H NMR以及HPLC-MS确证。经紫外光谱分析,计算得出半抗原与牛血清白蛋白和卵清蛋白的结合比分别为14∶1和8∶1。[结论]通过嘧霉胺半抗原的合理设计,建立快速有效的嘧霉胺ELISA检测方法。     

泰乐菌素单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

目的制备泰乐菌素(Tylosin)单克隆抗体,并建立泰乐菌素竞争ELISA检测方法。方法用羰基二咪唑将半抗原泰乐菌素分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备泰乐菌素免疫抗原Tylosin-BSA和检测抗原Tylosin-OVA,用紫外光谱扫描检测Tylosin-BSA偶联物,辣根过氧化物酶标记Tylosin-OVA偶联物。采用杂交瘤技术,制备特异性抗泰乐菌素单克隆抗体,建立泰乐菌素竞争ELISA检测方法。结果筛选出2株稳定分泌抗泰乐菌素单抗的杂交瘤细胞株3E4和2G10,2G10分泌的单抗腹水效价为6×10-4,抗体类型为IgG1型,轻链为κ链,在酸、碱及热条件下均较稳定。选择该单抗建立了泰乐菌素竞争ELISA检测方法。该方法灵敏度达50ng/ml,标准曲线线性关系良好(r=0.9827),且特异性、稳定性较好,准确性、精密性较高。结论已成功制备了泰乐菌素单克隆抗体,并建立了竞争ELISA检测方法,可用于动物源性食品中残留泰乐菌素含量的检测。     

氰戊菊酯免疫分析关键试剂人工抗原的合成与应用效果

以氰戊菊酸、间苯氧基苯甲醛为原料,利用酰氯与伯胺的活泼反应,合成了一种含有3个碳原子长度连接臂的氰戊菊酯半抗原,并通过核磁共振鉴定;用活泼酯法将合成的氰戊菊酯半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原和检测抗原,紫外-可见连续光谱扫描结果显示,所制备的人工抗原的图谱具有载体蛋白和半抗原的特征峰叠加现象,表明偶联成功;人工抗原的免疫结果显示,以BSA偶联物免疫小鼠后获得抗血清效价分别为160 000、140 000和110 000,间接竞争ELISA(酶联免疫吸附分析)测定抗体IC50(半数抑制浓度)值为35.1 μg/L,与其他供试农药的交叉反应率均＜1%,为氰戊菊酯抗体研制及免疫分析检测技术研究提供了关键试剂.     

利福霉素单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

目的制备利福霉素单克隆抗体,并建立利福霉素竞争ELISA检测方法。方法通过利福霉素与载体蛋白(BSA、OVA)偶联,制备免疫原和检测抗原,用杂交瘤技术制备单克隆抗体,建立利福霉素竞争ELISA检测方法。结果筛选出5株能稳定分泌抗利福霉素单抗的杂交瘤细胞株,均分泌IgG抗体,其中2H1、5H5、3F12和2C8株的轻链是κ链,3A2株的轻链是λ链;5株单抗为同一位阻群;在碱性条件下较稳定。建立的利福霉素竞争ELISA检测法灵敏度为6ng/ml,与利福平无交叉反应,稳定性良好。结论已成功制备了利福霉素单克隆抗体,并建立了利福霉素竞争ELISA检测法。     

烟嘧磺隆人工抗原的合成与鼠源多克隆抗体的制备

为了制备烟嘧磺隆的多克隆抗体、建立烟嘧磺隆残留的免疫分析方法,以2-氨基磺酰基-N,N-二甲基烟酰胺(ASDM)和琥珀酸酐为原料合成半抗原,采用活泼酯法制备人工抗原并免疫小鼠。结果表明:经紫外可见吸收光谱扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,人工抗原合成成功,半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)的偶联比分别为10.5∶1和26.9∶1。5次免疫后小鼠抗血清的效价均达到1∶16 000以上,以ASDM-BSA为免疫原的小鼠产生了抑制烟嘧磺隆的多克隆抗体,建立的间接竞争ELISA方法对烟嘧磺隆的检测范围是1ng·mL-1~10μg·mL-1。为进一步建立更为高效、灵敏和方便的烟嘧磺隆ELISA检测方法提供了参考。     

呋喃妥因代谢物AHD单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备呋喃妥因代谢物AHD单克隆抗体,并进行鉴定。方法利用对羧基苯甲醛合成1-氨基乙内酰胺脲(AHD)的衍生物1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟(4-CPAHD),通过活性脂法将4-CPAHD与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,获得免疫抗原4-CPAHD-BSA和包被抗原4-CPAHD-OVA,采用紫外分光光度法检测偶联是否成功。将人工合成抗原4-CPAHD-BSA免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选能稳定产生抗体的细胞株;通过间接ELISA法检测该细胞株分泌的单克隆抗体的效价、邻硝基-PAHD(2-NPAHD)对单克隆抗体的半数抑制浓度(IC50),并分析抗体的特异性。结果偶联后4-CPAHD-BSA的最大吸收峰有较明显的偏移,表明4-CPAHD与BSA偶联成功,平均偶联比为17.4∶1。制备的单克隆抗体的效价为1∶64 000,2-NPAHD对单克隆抗体的IC50为1.45μg/L,单克隆抗体与同类抗生素及其代谢物无交叉反应。结论制备的AHD单克隆抗体各项指标均较好,为呋喃妥因代谢物免疫检测试剂的研发奠定了基础。     

黄曲霉毒素G族人工抗原的合成与免疫效果研究

以黄曲霉毒素(Aflatoxin G1,AFG1)的半缩醛(Aflatoxin G2a,AFG2a)为中间物,通过还原烷基法,使黄曲霉毒素G1在8、9羟基上与牛血清白蛋白(BSA)实现偶联,得到偶联物。对偶联物进行紫外全波长扫描显示,其特征吸收峰与BSA和AFG1的特征吸收峰有明显差异。经完全透析后检测偶联物与BSA荧光强度差异,均表明BSA与黄曲霉毒素G1偶联,AFG1-BSA物质的量结合比为3.2∶1。以合成人工抗原免疫小鼠,用间接非竞争ELISA测得抗血清中抗体的效价可达1∶128 000,间接竞争ELISA测定抗体IC50为14.7 ng/mL。为下一步研制黄曲霉毒素G族单克隆抗体提供了关键试剂,为研究建立黄曲霉毒素G族免疫速测技术奠定了基础。     

抗黄曲霉毒素B1重链IgG2b亚型单克隆抗体的制备及应用

目的制备抗黄曲霉毒素B1(AFB1)的重链IgG2b亚型单克隆抗体,并建立黄曲霉毒素B1的间接竞争ELISA检测方法。方法采用AFB1-BSA偶联物为免疫抗原,AFB1-STI偶联物为检测抗原,利用间接竞争ELISA筛选分泌抗AFB1单抗的细胞株,并对抗体进行鉴定。结果筛选到1株能分泌特异性抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其染色体数目为(90±10)条;所分泌的单抗亚类重链为IgG2b,轻链为λ;间接ELISA检测该株杂交瘤细胞分泌上清效价在1∶12800～1∶25600,纯化腹水效价为1∶105～1∶106。传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;建立的间接竞争ELISA检测方法的最低检出限为0.001ng/ml,校正曲线的线性范围为0.005～5ng/ml,IC50为0.01ng/ml;与AFB1的结构类似物AFM1和化学结构有差异的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的交叉反应率分别为1.4%和<1%。结论所制备的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体具有高度特异性和稳定性,可应用于间接竞争ELISA检测方法。     

抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

目的建立抗β-淀粉样蛋白(Aβ)单克隆抗体杂交瘤细胞系,并鉴定Aβ单抗的免疫学特性,以便用于阿尔茨海默病(AD)的防治研究。方法用戊二醛法将半抗原Aβ1-42偶联于载体蛋白BSA,形成结合抗原BSA-Aβ。用常规腹腔注射法和微量足垫注射法分别免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立分泌Aβ单抗的细胞株,体内诱生腹水法制备Aβ单抗。硫酸铵盐析法提纯,常规免疫学法检测鉴定Aβ单抗的免疫学特性。结果筛选出A-B7、A-D11、A-E93株高特异性杂交瘤细胞株,亚型均为IgM型,单抗的ELISA间接效价分别为2×10-5、2×10-5和1×10-5。杂交瘤细胞染色体数目在80~90之间,纯化后单抗腹水蛋白回收率在20%左右。结论已成功建立了分泌抗Aβ单抗的细胞系,并制备出半抗原Aβ的单抗,可用于AD的进一步研究。     

Characterization and comparison of fumonisin b(1)-protein conjugates by six methods

In order to generate an antibody against a small hapten molecule, the hapten is cross-linked with carrier protein to make it immunogenic. In this study, the hapten (Fumonisin B(1), FB(1)) was coupled to ovalbumin (OVA) and bovine serum albumin (BSA), respectively by a short cross-linker reagent (glutaraldehyde, GA). To develop a technique for detecting the conjugation, the hapten-protein conjugates (FB(1)-OVA and FB(1)-BSA) were characterized thoroughly by ultraviolet (UV) spectroscopy, Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy, gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), respectively. The molecular weights of FB(1)-BSA and FB(1)-OVA were 74,355.301 Da and 48,009.212 Da, respectively determined by the method of MALDI-TOF-MS. The molecular coupling ratios were 11 and 5 in FB(1)-BSA and FB(1)-OVA, respectively. In this experiment, MALDI-TOF-MS was selected as the most efficient method to evaluate the cross-linking effect and calculate the molecular coupling ratio.     

咪唑乙烟酸人工抗原的合成与鉴定

[目的]合成咪唑乙烟酸完全抗原并加以鉴定。[方法]以除草剂咪唑乙烟酸原药、草酰氯以及六氨基己酸等为起始原料,通过亲核取代、水解等反应合成了咪唑乙烟酸的半抗原。用碳二亚胺法将半抗原与牛血清白蛋白偶联制备免疫原,用混合酸酐法将半抗原与鸡卵清蛋白偶联制备包被原。[结果]半抗原的结构经IR、UV、1H NMR以及HPLC-MS确证。经紫外光谱分析,计算得出半抗原与牛血清白蛋白和鸡卵清蛋白的结合比为18∶1和7∶1。[结论]紫外光谱分析证实咪唑乙烟酸抗原合成成功,该抗原可用于咪唑乙烟酸多克隆抗体和ELISA检测试剂盒的研制。     

镉离子多克隆抗体ELISA竞争法的初步建立

目的制备抗镉离子螯合物的多克隆抗体,初步建立检测镉离子的ELISA竞争法。方法用双功能螯合剂iEDTA螯合Cd2+后,再与匙血蓝蛋白(KLH)偶联,合成完全抗原(Cd-iEDTA-KLH),免疫BALB/c小鼠,获得多克隆抗体。ELISA法检测其抗血清效价、特异性和灵敏度。结果多克隆抗体效价均大于1∶80000;特异性检测结果显示均产生了抗Cd-iEDTA抗体,与OVA、BSA无交叉反应。抗体除与Hg2+有较强的交叉反应外,同等抑制情况下,Mg2+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+、Zn2+与Cd2+浓度相差约1000倍,交叉反应率很低;ELISA竞争法对镉离子的检测限约为50ng/ml。结论初步建立了镉离子的ELISA竞争法,检测限达到无公害的国家卫生限量标准(100ng/g)。     

抗DNA单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其抗体的鉴定

目的制备抗DNA单克隆抗体,用以建立特异、灵敏、简便的外源性DNA残留量测定方法。方法将小牛胸腺DNA与阳离子化的牛血清白蛋白通过Mannich反应连接成为完全抗原,免疫BALB/c小鼠得到的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,获得稳定分泌抗DNA单抗的杂交瘤细胞株,对抗体进行纯化、浓缩及鉴定。结果得到3株可稳定分泌抗DNA单抗的杂交瘤细胞株,单抗的ELISA间接效价分别为1∶4×103、1∶8×104和1∶1×103;亚型分别为IgM/κ、IgM/λ和IgM/κ;亲和力常数分别为3.96×108、4.04×109和1.26×108L/mol;3株细胞分泌的单抗与ctDNA、DH5αDNA、GS115DNA和H.S.DNA均有较高的结合能力,而对RNA、BSA和酪蛋白结合较弱或不能结合;3株细胞分泌的单抗识别3个不同的抗原表位;可检出4ng/ml以上的DNA。结论成功制备了3株细胞分泌的抗DNA单抗,为外源性DNA残留量免疫测定方法的深入研究奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒血清抗体竞争ELISA检测方法的建立及验证

目的建立O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)血清抗体的竞争ELISA检测方法,并进行验证。方法采用O型FMDV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)作为包被抗原,建立用于检测FMDV血清抗体的竞争ELISA方法。对方法的抗原包被浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μg/mL)、抗原包被温度及时间(4℃过夜、37℃1 h、37℃1.5 h、37℃2 h、37℃2.5 h、37℃3 h)、血清稀释度(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释)、HRP-IgG稀释度(1∶10000~1∶20000稀释)、封闭液种类(不封闭、1%BSA封闭、2%BSA封闭、5%脱脂乳封闭)、封闭液作用时间(30、60、90、120 min)、血清与HRP-IgG作用时间(30、60、90、120、150 min)、底物TMB作用时间(10、15、20、25、30 min)进行优化。同时验证方法的交叉反应、特异性及敏感性、精密性。采用建立的方法及O型FMDV抗体液相阻断ELISA检测试剂盒分别检测未知血清背景的138份猪和牛血清,计算两者的符合率。结果方法最适检测条件为:抗原包被浓度0.5μg/mL,抗原包被温度及时间为4℃过夜,血清稀释度为1∶4;HRP-IgG稀释度为1∶18000;封闭液为1%BSA,封闭液作用时间为30 min;HRP-IgG与血清作用时间为30 min;底物作用时间为10 min。21份不同猪病的阳性血清中,除3份O型FMD阳性血清为阳性外,其他血清样品为阴性,该方法无交叉反应;敏感性为90.4%,特异性为95.7%;批内和批间精密性试验变异系数(CV)均<10%。该方法与口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测结果的符合率为97%。结论建立的方法具有良好的特异性及精密性,且操作简便,可用于O型FMDV血清抗体的检测。     

戊型肝炎病毒重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒的制备

目的制备戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒。方法以4型HEV ORF2重组蛋白P179免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行克隆化培养,制备腹水,并对杂交瘤细胞进行染色体计数,鉴定单抗亚类及特异性、并检测稳定性;经SDS-PAGE分析抗体纯度,以兔抗179抗原多抗作为包被抗体,HRP标记P179单抗作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,制备试剂盒,并进行最佳线性范围测定、准确性、精密性和稳定性验证。结果获得4株能稳定分泌抗P179抗原单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3A10、3F8、4E9和5G6,腹水抗体效价分别为1∶10-7、1∶10-6、1∶10-6和1∶10-7,染色体数分别为96、98、101和99条;亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG1和IgG2b;4株单抗连续传代3个月,液氮冻存1年抗体效价未发生变化;制备的试剂盒有良好的线性(R2>0.950 0)、准确性、精密性,试验内变异系数为4.17%～6.26%,回收率在87.9%～114.8%之间,试验间变异系数为5.82%～8.01%,回收率在90.8%～108.9%之间;于37℃及4℃放置3 d,仍具有良好的稳定性。结论成功制备了戊型肝炎病毒P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒,可用于戊型肝炎疫苗生产中定量检测疫苗抗原。     

鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库的构建及筛选

目的构建鼠源性抗EHEC O157∶H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,并从中筛选特异性的抗体。方法用EHEC O157∶H7 Stx2类毒素免疫BALB/c小鼠,取脾分离淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR分别扩增抗体轻、重链(к和Fd)基因,经双酶切依次克隆入噬粒载体pComb3X中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13K07进行超感染,构建抗EHEC O157∶H7 Stx2的Fab噬菌体抗体库。以纯化的Stx2为抗原进行筛选,获得抗EHECO157∶H7Stx2的特异性Fab抗体,Western blot法检测噬菌体抗体与毒素抗原的结合活性,并对所得阳性克隆进行基因序列分析。结果构建了一个库容为1.56×107的Fab抗体库,筛选出3株特异性较强的阳性克隆,其中2个可与Stx2A1亚单位抗原反应,1个可与Stx2B亚单位抗原反应。基因序列分析显示,轻、重链可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠免疫球蛋白可变区氨基酸序列同源性分别为98.5%和99.6%。结论已成功构建了鼠源性抗EHEC O157∶H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,为进一步制备抗EHECO157∶H7Stx2的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

癌-睾丸抗原OY-TES-1多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备癌-睾丸抗原OY-TES-1多克隆抗体,并进行鉴定。方法以大肠杆菌表达的MBP/OY-TES-1融合蛋白作为抗原,免疫新西兰白兔,制备抗血清。经蛋白A凝胶纯化后,采用ELISA法检测抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体的特异性。结果制备的抗血清经ELISA检测,效价不低于1∶128000,纯化后,其效价不低于1∶8000。Western blot显示,抗OY-TES-1多抗可与MBP/OY-TES-1融合蛋白、MBP、OY-TES-1重组蛋白和睾丸组织总蛋白特异性结合;免疫组化检测显示,精子头部呈现阳性反应。结论已成功制备了效价高、特异性强的癌-睾丸抗原OY-TES-1多克隆抗体,为深入研究OY-TES-1的生物学功能提供了工具。