丙型肝炎病毒F蛋白在病毒复制和致病中的作用

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)属于黄病毒科,是有包膜的单正链RNA病毒.HCV基因组约有9 600个碱基,编码的单一开放读码框(Open reading frame,ORF)翻译出约3 000个氨基酸残基的多聚蛋白前体,在宿主细胞及病毒蛋白酶的作用下,剪切成至少10种结构蛋白和非结构蛋白.近...     

HCV 2a J6JFH细胞感染模型的建立及初步应用

目的建立能够自主复制的丙型肝炎病毒(HCV)体外细胞感染模型。方法制备HCV2a FL-J6JFH和阴性对照FL-J6JFH(GND)RNA转录体,分别转染Huh-7.5细胞,荧光定量PCR(FQ-PCR)检测细胞内HCV RNA水平,免疫荧光法(IFA)检测细胞内HCV蛋白的表达。以转染细胞上清液感染Na觙ve Huh-7.5细胞,检测HCV感染性病毒颗粒(HCVcc)的产生。将细胞用不同浓度的IFNα处理,观察所建立的细胞感染模型对IFNα的敏感性。结果转染后第5天,FL-J6JFH转染细胞内HCV RNA为1.2×106GE/μg RNA,第9天下降至最低水平,随后上升,于第13天达到最高值6.5×106GE/μg RNA,此后直至第59天,均保持在106GE/μg RNA左右,而FL-J6JFH(GND)转染细胞内HCV RNA则很快消失。FL-J6JFH转染的细胞内始终可以检测到HCV蛋白表达,而对照细胞内均未检测到。从第5天起,各时间点的FL-J6JFH转染细胞均能产生HCVcc。IFNα能够有效抑制HCVcc感染Huh-7.5细胞,并呈剂量依赖性。结论已成功建立了能持续产生HCVcc的HCV2a型体外细胞感染模型,IFNα能抑制FL-J6JFH HCVcc感染细胞中HCV RNA的复制,为研究HCV的结构与功能提供了实验平台。     

输血后丙型肝炎病毒NS4区抗体的动态化及其诊断意义

利用重组ＮＳ４抗原及合成肽５－１－１抗原分别检测５例输血后丙型肝炎患者的系列血清１３６份，并与ＨＣＶ总抗体及ＨＣＶＲＮＡ检测结果比较，发现抗ＮＳ４抗体的动态经虽然有两种模式。但在哆数情况下为一种模式，即抗体阳转后很少转阴，并且其动态变化基本与总抗体相似。同时发现２例病人抗ＮＳ４抗体阳转时间早于总体因此，推测ＨＣＶ检测试剂中增加ＮＳ４抗原可能对提高ＨＣＶ诊断试剂的灵敏度有一定意义。     

丙型肝炎病毒C区和NS3区嵌合基因的克隆及表达

目的获得丙型肝炎病毒(HCV)C-NS3嵌合抗原,以提高HCV酶联免疫吸附试验诊断试剂的质量。方法应用SOE-PCR(拼接重叠延伸PCR)的方法,构建了HCV的C区和NS3区的嵌合基因,克隆于表达载体pGEX-4T3,并转化于大肠杆菌BL21,经筛选,IPTG诱导HCV的C-NS3嵌合抗原的表达。经SDS-PAGE检测表达水平,Western blot检测抗原特异性。结果SOE-PCR构建的HCV C区和NS3区嵌合基因在BL21中获得表达。经鉴定,其相对分子质量约为75000,并具有高度特异性。结论已获得HCV C-NS3嵌合抗原,为提高HCV酶联免疫吸附试验诊断试剂的质量奠定了基础。     

丙型肝炎病毒感染对内皮细胞趋化因子配体1表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染对肝细胞及血管内皮细胞趋化因子配体1[chemokine(C-X3-C motif)ligand 1,CX3CL1]表达的影响。方法分别以0.5 MOI感染性HCV病毒颗粒(cell-culture-derived infectious HCV,HCVcc)感染Huh7细胞48 h、以不同剂量(0.1、0.2、0.5、1μg)的HCV RNA转染HepG2细胞48 h、以0.5和1.0 MOI HCVcc感染过表达人CD81的HepG2细胞48 h后,抽提各步细胞总RNA,采用Real-time PCR法检测HCV感染肝细胞对胞内CX3CL1 mRNA表达的影响。分别以1.0 MOI HCVcc刺激HUVEC 48 h、以0.1、0.2、0.4、1.0 MOI HCVcc刺激人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMEC)48 h、以0.5 MOI HCVcc刺激Huh7和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)共培养细胞体系48 h,抽提各步细胞总RNA,采用Real-time PCR法检测HCVcc刺激内皮细胞对胞内CX3CL1表达的影响。结果与未感染细胞对照相比,0.5 MOI HCVcc感染的Huh7细胞中CX3CL1 mRNA水平上调2倍多(P0.05),随着HCV RNA转染HepG2细胞剂量的增加,CX3CL1 mRNA水平随之升高,组间差异有统计学意义(P0.05),0.5和1.0 MOI HCVcc感染过表达CD81的HepG2细胞,胞内CX3CL1 mRNA水平分别上调7.56和13.91倍(P0.05)。与未刺激细胞对照相比,HCVcc刺激HUVEC可引起胞内CX3CL1的mRNA水平上调5倍多(P0.05);与HCVcc未刺激的共培养组相比,与HCVcc感染的Huh7细胞共培养的HUVEC胞内CX3CL1 mRNA水平上调约13倍,HUVEC受HCVcc刺激后,CX3CL1 mRNA水平的上调幅度高于HUVEC单独培养组(P均0.05);与未刺激细胞对照相比,0.1、0.2、0.4和1.0 MOI HCVcc刺激HBMEC可引起胞内CX3CL1 mRNA水平上调1.71、2.37、2.85和3.05倍(P0.05)。结论 HCV感染可引起肝细胞和血管内皮细胞CX3CL1表达上调,HCVcc感染肝细胞释放的细胞因子也是促进内皮细胞CX3CL1表达上调的刺激物,为HCV感染引起肝外疾病产生的机制提供了参考。     

丙型肝炎病毒NS5B全长基因及截短形式基因的克隆、表达及鉴定

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-FL、NS5B-C21和NS5B-C51重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达及鉴定。方法利用PCR技术扩增3种长度的NS5B基因,经BamHI和XhoI双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,并进行纯化及鉴定。结果所构建的3种重组质粒pET-28a(+)-NS5B-FL、pET-28a(+)-NS5B-C21和pET-28a(+)-NS5B-C51,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经PCR及酶切鉴定,均能扩增或酶切出相应大小的目的基因片段,表达的6His-NS5B-FL融合蛋白主要以包涵体形式存在,而表达的6His-NS5B-C21和6His-NS5B-C51融合蛋白的可溶性明显增加。纯化的6His-NS5B-C21蛋白未发生降解,6His-NS5B-FL和6His-NS5B-C51蛋白发生了部分降解。纯化后的3种蛋白均能与丙肝患者血清发生反应。结论已成功构建了3种NS5B基因的重组表达载体,并获得了目的蛋白表达,为进一步抗HCV药物的筛选奠定基础。     

丙型肝炎病毒NS3基因疫苗质粒的构建、表达及其体液免疫应答

目的构建基于Ii分子的丙型肝炎病毒(HCV)内源性靶向基因疫苗质粒,并检测其在真核细胞中的表达及免疫小鼠诱导的体液免疫应答。方法通过3轮PCR,以HCV-NS3的Th1表位(1248～1261aa)取代Ii链CLIP片段编码基因,构建基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗质粒,转染COS-7细胞,RT-PCR法检测其在mRNA水平的表达;用内源性靶向基因疫苗pHCV-NS3-Th1和非靶向基因疫苗pHCV-NS3经股四头肌肌肉免疫BALB/c小鼠,以生理盐水、pCI-neo和pCI-neo-Ii作为对照,检测小鼠的体液免疫应答水平。结果转染细胞中,内源性靶向基因疫苗质粒在mRNA水平获得表达;对BALB/c小鼠的免疫结果显示,只有pHCV-NS3组小鼠可以检测到针对HCV-NS3的特异性抗体,抗体滴度可达1:1024。结论已成功构建了基于Ii分子的HCV内源性靶向基因疫苗质粒,其能够在真核细胞中表达,但不能刺激小鼠产生HCV-NS3特异性抗体。     

丙型肝炎病毒E2抗原基因的克隆、表达及纯化

目的　为了获得大量重组HCVE2蛋白 ,以研究E2抗体潜在的保护作用。方法　利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出 931bp的E2基因片段 ,经EcoRI和Sall双酶切后连接到pET 2 8a表达载体上 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)菌株 ,得到重组质粒PET -E2 ,工程菌经IPTG诱导培养 ,明显表达出HCVE2蛋白 ,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化 ,用ELISA方法检测生物学活性。结果　表达产物主要以包涵体形式存在 ,表达量达菌体蛋白的 18%以上 ,目的蛋白具有良好的反应原性。结论　HCVE2基因的克隆与表达为进一步开展HCVE2蛋白和疫苗研究奠定了基础     

丙型肝炎病毒非结构区NS5基因片段的克隆和表达

从抗 HCV和HCVRNA均为阳性的病人血清中 ,采用RT PCR技术扩增得到HCVNS5基因片段。用含此基因片段的重组质粒pET 2 8a转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后可高效表达NS5蛋白。该蛋白可用固定化金属离子螯合层析法 (IMAC)纯化。经Westernblot和ELISA检测结果表明 ,纯化的NS5蛋白可与丙型肝炎患者血清发生特异反应 ,在HCV感染的诊断中可能具有良好的应用前景。     

生物素标记UTP及温度值对HCV细胞外聚合酶分子复制模型的影响

目的　研究建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的生物素标记UTP浓度及温度值 ,为筛选药物创造条件。方法　使用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR ,从我国HCVRNA阳性病人血清中扩增出HCVNS5bRNA聚合酶全长基因序列 ,构建原核表达载体pET 30a NS5b。在多个载体中选取pET 30a作为表达载体 ,选择诱导表达条件。利用Ni2十 金属离子螯和亲和层析将其纯化 ,对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究。利用 96孔DNA BAND培养板 ,建立生物素标记检测HCVNS5b聚合酶活性的模型。结果　测序及读码框架分析结果表明 ,已得到相关HCVNS5bRNA聚合酶全基因序列。在最佳表达条件下 ,诱导表达的融合蛋白 (相对分子质量6 5 0 0 0 ) ,纯度大于 92 .83%HCV聚合酶活性集团完整。建立了细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的最佳生物素标记UTP浓度及温度值。结论　HCV聚合酶得到高效表达和有效纯化 ,以及HCV聚合酶作用模板及温度的最佳条件分别为 0 .5mmol/L及 37℃。     

重组丙型肝炎病毒腺病毒载体疫苗rAd/E2的构建及鉴定

目的构建含丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)E2基因的复制缺陷型重组腺病毒载体疫苗,并进行鉴定。方法以含HCV(1a亚型)E2基因的质粒pEGFP-HCV/E1E2为模板,PCR扩增E2基因,扩增产物与pGEM-T载体连接,测序正确后双酶切亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2,Pme I酶切线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd/E2,PacⅠ酶切线性化后,脂质体LipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒rAd/E2,在HEK293细胞内扩增,利用报告基因GFP的表达监测病毒包装及感染效率,PCR、RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,并测定各代病毒的滴度。结果测序结果证明HCV E2基因序列正确;重组腺病毒质粒pAd/E2经酶切证明重组成功;PCR、RT-PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒rAd/E2构建正确;第4代重组腺病毒的滴度为7.5×108 pfu/ml。结论已成功构建了重组HCV腺病毒rAd/E2,为丙型肝炎疫苗的研制提供了新的途径。     

稳定表达丙型肝炎病毒HLA-A2限制性多表位基因C1R-AAD细胞克隆的建立

目的建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)HLA-A2限制性多表位基因的C1R-AAD细胞克隆。方法合成人泛素基因(Ub)和HCVHLA-A2限制性多表位基因(Mep),分别克隆入原核表达质粒pRSET-A,构建多表位抗原基因的原核表达质粒pRSET-Ub-Mep。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切质粒pRSET-Ub-Mep,得到复合多表位基因Ub-Mep,亚克隆入真核表达载体pcD-NA3.1(-),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Ub-Mep,转染至C1R-AAD细胞,G418压力筛选后,通过有限稀释法获得稳定表达Ub-Mep融合蛋白的C1R-AAD细胞克隆,采用RT-PCR法检测稳定转染细胞中Ub-Mep基因mRNA的转录;间接免疫荧光法和Westernblot法检测Ub-Mep蛋白在稳定转染细胞中的表达。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Ub-Mep经酶切鉴定证明构建正确;在稳定转染的C1R-AAD细胞中可检测到Ub-MepmRNA和蛋白水平的表达。结论已建立了稳定表达HCVHLA-A2限制性多表位抗原的C1R-AAD细胞克隆,为进一步研究HLA-A2限制性多表位基因诱导的细胞免疫应答建立了靶细胞。     

丙型肝炎病毒全基因重组质粒的构建及其转染细胞系的建立

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)全基因重组质粒,并建立其转染细胞系。方法双酶切质粒JFH1,回收HCVDNA,分别与真核表达载体pIRESneo和逆转录病毒载体pLNCX连接,构建重组质粒pIRESneo-HCV和pLNCX-HCV。将重组质粒pIRESneo-HCV转染BHK细胞,pLNCX-HCV转染pA317细胞,通过PCR、间接ELISA和免疫荧光试验鉴定转染细胞。结果重组质粒PCR和酶切鉴定证明构建正确。转染细胞上清经PCR检测均可见目的基因条带;ELISA结果表明,转染细胞冻融上清均可与抗HCV小鼠血清发生强的结合反应;转染细胞均可与抗HCV小鼠血清反应,产生荧光,但荧光不多且斑点不亮。结论已成功构建HCV全基因重组质粒,并建立了可表达HCV蛋白的转染细胞系,为转基因动物模型的建立奠定了基础。     

Impact of Chronic Hepatitis C Virus Genotype 1b Infection on Triglyceride Concentration in Serum Lipoprotein Fractions

Reduced low-density lipoprotein (LDL) cholesterol level is a characteristic feature of dyslipidemia in chronic hepatitis C virus (HCV) infection. However, abnormality in serum triglyceride (TG) has not been fully investigated. To clarify the impact of HCV genotype 1b (G1b) infection and advanced fibrosis on serum TG profiles, TG concentrations in lipoprotein fractions were examined in fasting sera from 185 subjects with active or cleared HCV infection by high-performance liquid chromatography. Serum lipoproteins were fractionated into four classes: chylomicron, very low-density lipoprotein (VLDL), LDL, and high-density lipoprotein (HDL). Then, the significance of HCV G1b infection on TG levels in each lipoprotein fraction was determined using multiple regression models. We found that active HCV G1b infection was positively associated with high HDL-TG levels and low VLDL-TG levels, independent of other factors included in the regression model. In VLDL sub-fractions, active HCV infection was only found to be associated with low levels of large VLDL-TG. Similarly, advanced liver fibrosis in chronic HCV G1b infection was associated with high levels of LDL-TG, HDL-TG, and small VLDL-TG, independent of other clinical factors. These findings indicate that active HCV G1b infection and advanced fibrosis are closely associated with abnormal serum TG profiles.     

甲型肝炎病毒(L-A-1株)基因型分析

目的 分析甲肝病毒基因型,为确定我国甲肝的分子流行病学及疫苗的安全性和免疫原性奠定基础。方法 采用抗原捕获聚合酶链反应（AC/PCR）,依据国际上甲肝病毒分型标准,扩增VP1/2A结合处的168个核苦酸（nt2909～3264）。结果 经生物信息学软件分析,得出L-A-1株病毒属于甲肝病毒基因IB亚型。结论 在我国有IA和IB两个亚型甲肝病毒流行。     

丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构建及其免疫原性

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm,用该重组质粒免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性。方法用BamHⅠ和HindⅢ双酶切含有HCVC区、E2区模拟表位和NS3~NS5区细胞表位串联基因的原核表达载体pQE30-CtEm,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),脂质体瞬时转染CHO细胞,并检测其表达。以100μg重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测其体液免疫和细胞免疫效果。结果所构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm在CHO细胞中能获得有效表达。该质粒免疫小鼠后可诱导高水平的抗体,特异性淋巴细胞增殖反应、IFN-γ水平及CTL活性均明显高于空载体和生理盐水对照组。结论已成功构建HCV多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm,免疫小鼠后可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答。     

Effect of Hepatitis C Virus Genotype 1b Core and NS5A Mutations on Response to Peginterferon Plus Ribavirin Combination Therapy

We examined whether hepatitis C virus (HCV) genotype 1b core- and NS5A-region mutations are associated with response to peginterferon α-2b plus ribavirin combination therapy. A total of 103 patients with high HCV genotype 1b viral loads (≥100 KIU/mL) were treated with the combination therapy. Pretreatment mutations in the core region and interferon sensitivity determining region (ISDR) in the NS5A region were analyzed. In univariate analysis, arginine and leucine at positions 70 and 91 in the core region, defined as double wild (DW)-type, were associated with early virologic response (p = 0.002), sustained virologic response (SVR) (p = 0.004), and non-response (p = 0.005). Non-threonine at position 110 was associated with SVR (p = 0.004). Multivariate analysis showed the following pretreatment predictors of SVR: hemoglobin level ≥ 14 g/dL (odds ratio (OR) 6.2, p = 0.04); platelet count ≥ 14 × 10⁴/mm³ (OR 5.2, p = 0.04); aspartate aminotransferase (AST)/alanine aminotransferase (ALT) ratio < 0.9 (OR 6.17, p = 0.009); DW-type (OR 6.8, p = 0.02); non-threonine at position 110 (OR 14.5, p = 0.03); and ≥2 mutations in the ISDR (OR 12.3, p = 0.02). Patients with non-DW-type, non-threonine at position 110, and <2 ISDR mutations showed significantly lower SVR rates than others (11/45 (24.4%) vs. 27/37 (73.0%), respectively; p < 0.001). SVR can be predicted through core and NS5A region mutations and host factors like hemoglobin, platelet count, and AST/ALT ratio in HCV genotype 1b-infected patients treated with peginterferon and ribavirin combination therapy.