重组靶向毒素IL-6(23)-PE40_(KDEL)在毕赤酵母中的表达及其活性

目的利用毕赤酵母表达系统表达IL-6(23)-PE40KDEL重组靶向毒素,并检测其杀伤肿瘤细胞的活性。方法采用PCR技术,将目的基因IL-6(23)-PE40KDEL插入到pPIC9载体中SnaBⅠ与NotⅠ位点,电转化至巴斯德毕赤酵母GS115中,筛选Mut-型重组酵母;甲醇诱导表达,体外细胞试验检测其细胞毒性。结果获得12株Mut-重组酵母,其中8株具有细胞毒性,表达产物占上清液蛋白的9%～12.7%;15"l以上的表达产物在体外对SP2/0、HL-60、HepG2、BGC-832和HCT-116细胞具有高度杀伤活性,对CK、HeLa和NIH/3T3细胞无明显影响。结论IL-6(23)-PE40KDEL重组靶向毒素在毕赤酵母GS115中获得表达,并具有选择杀伤肿瘤细胞的活性。     

HBsAg/GM-CSF融合蛋白的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达HBsAg/GM-CSF融合蛋白。方法利用PCR扩增HBsAg和GM-CSF基因,通过15个氨基酸的连接肽将两个片段连接,获得融合基因S-GM,克隆入酵母穿梭质粒pPIC9K中。将重组质粒9K-S-GM电转化毕赤酵母后,G418筛选,甲醇诱导,HBsAg/GM-CSF融合蛋白表达。经SDS-PAGE检测表达水平,Western blot检测表达产物特异性。结果PCR扩增的片段与预期大小一致,HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中获得了表达。Western blot检测,该融合蛋白同时具有HBsAg和GM-CSF的特异性。结论该融合蛋白的获得为提高乙肝疫苗的免疫原性奠定了科学基础。     

人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的利用酵母表达系统制备人LIGHT-Fc融合蛋白。方法利用基因工程方法构建含人LIGHT胞外段基因和人Ig G4 Fc基因的重组质粒p PIC9K-LIGHT-Fc,经SalⅠ线性化后电转化感受态酵母菌GS115,PCR鉴定重组转化子。将阳性重组转化子经甲醇诱导表达后,RT-PCR法检测目的基因的转录水平,SDS-PAGE及Western blot法进行表达产物的鉴定。结果表达质粒p PIC9K-LIGHT-Fc经酶切及测序鉴定,证明构建正确。10个重组子均为Mut+型阳性转化子,经甲醇诱导后可扩增出特异性目的基因片段。表达的重组LIGHT-Fc融合蛋白相对分子质量约45 000,可与鼠抗人LIGHT多克隆抗体发生特异性结合。结论人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中已成功获得了表达,为进一步开展其生物学功能的研究奠定了基础。     

人脑钠肽与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

目的在毕赤酵母中表达重组人脑钠肽(BNP)与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白,并检测其活性。方法重叠PCR法拼接BNP二联体与HSA基因,插入表达载体pPIC9K,电穿孔法转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定及活性检测。结果融合基因(BNP)2-HSA经测序正确,重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确。诱导72h,融合蛋白表达量最高,可达200mg/ml,且具有良好的反应原性,其活性为rhBNP标准品的1%。结论已在毕赤酵母中成功表达了具有一定生物活性的(BNP)2-HSA融合蛋白,为开发BNP长效药物奠定了基础。     

人溶菌酶-木聚糖酶融合基因在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)-木聚糖酶(Xylanases,XynⅡ)融合基因。方法通过PCR技术将hLY基因与XynⅡ基因连接,中间插入肠激酶识别位点序列;将其克隆至载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-XynⅡ-EKsite-hLY,经SacⅠ线性化后,电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选得到高拷贝转化子,PCR鉴定为阳性的克隆用甲醇进行诱导;表达的融合蛋白经Sephadex G-75凝胶柱层析纯化后,用肠激酶酶切,分别采用改良舒加法和DNS法测定hLY和XynⅡ的活性。结果获得的融合基因序列与理论序列完全一致;重组表达质粒构建正确;融合蛋白的hLY和XynⅡ活性分别为170和158 U/ml,经肠激酶酶切后,hLY的活性为520 U/ml,XynⅡ的活性达244 U/ml。结论已在毕赤酵母中成功表达了XynⅡ-EKsite-hLY融合基因,经肠激酶酶切后的目的蛋白活性均有较大提高。     

人甲状旁腺素在甲醇毕赤酵母中的分泌表达

选用酵母偏爱的密码子,人工合成长度为282bp的人甲状旁腺素(hPTH)基因,将其克隆于M13载体中,DNA测序验证正确。通过PCR从含有hPTH基因的M13载体获得了该基因,将其插入到含有AOX1启动子和α因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中,构建了重组质粒pPIC9K-hPTH,电击法转化甲醇毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株,经G418筛选得到高拷贝转化子,甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明在9 3kDa处有明显的诱导蛋白带,与报道的hPTH的相对分子质量相近;酶联免疫沉淀法(ELISA)检测证明表达的蛋白具有hPTH免疫活性为132ng/L。     

核心蛋白聚糖在毕赤酵母中的表达及活性检测

目的利用巴氏毕赤酵母真核表达系统表达人核心蛋白聚糖DCN,并检测其抗肿瘤活性。方法利用DCN的特异引物,通过RT-PCR扩增人DCN基因,与载体pPIC9K连接,将序列正确的重组体扩增后,酶切线性化,通过醋酸锂法转化酵母菌HIS-/GS115,G418筛选阳性克隆,用含1%甲醇的BMMY培养基诱导表达,并观察纯化的表达产物对人肝母细胞瘤细胞(HepG2)增殖的影响。结果表达产物作用于HepG2细胞后,与对照组相比,细胞增殖数量及速度均显著降低。随着表达产物浓度的升高及作用时间的延长,抑制作用也增强,并表现出浓度和时间依赖性关系。细胞形态学观察表明DCN对HepG2生长有明显抑制作用。结论已成功构建了pPIC9K-DCN真核表达载体,并表达了有活性的蛋白产物。     

人胰岛素前体在毕赤酵母中的组成型表达及其活性

目的通过毕赤酵母GAP启动子高效分泌表达人胰岛素前体,并检测重组胰岛素类似物的生物活性。方法经密码子优化并人工合成人胰岛素前体基因IS基因,插入pGAPZaA组成型表达载体中,构建重组表达质粒pGAPZaIS,电转化至感受态毕赤酵母SM1168菌株中,PCR鉴定阳性重组子;高抗性YPD平板筛选高蛋白表达株并优化表达条件;表达产物经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析;用吸附树脂吸附、阳离子交换层析、超滤纯化后,用经TPCK处理的胰蛋白酶切除人工C肽,经阴离子交换层析和醋酸锌沉淀纯化后,进行Tricine-SDS-PAGE分析;将12只链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)致糖尿病模型的小鼠随机分为A组和B组,A组小鼠经腹腔注射含1.8%甘油的注射用水作为对照组,B组小鼠经腹腔注射用胰岛素类似物配制的0.05 mg/ml注射用水剂(含1.8%甘油),10μl/g,空腹6 h后,断尾取血,用血糖仪检测小鼠血糖值。结果重组表达质粒pGAPZa-IS经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;共获得5株高抗性重组菌,其表达产物均可见相对分子质量约6 000的目的蛋白条带,与小鼠抗胰岛素单克隆抗体不发生特异性反应,5号菌72 h表达量最高;C肽切除后,获得了纯胰岛素类似物;模型小鼠在注射胰岛素类似物6 h后,血糖值均明显降低,B组小鼠注射前后血糖值及A、B组间的血糖值差异均有统计学意义(P<0.01)。结论在毕赤酵母中,利用GAP启动子成功高效表达了胰岛素前体,并具有良好的降血糖活性。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

目的克隆猪血清白蛋白(PSA)基因,并在毕赤酵母中分泌表达。方法Trizol法提取新鲜猪肝组织总RNA,经RT-PCR扩增PSA全长cDNA,克隆至酵母分泌型表达载体pPICZaC,构建重组表达质粒pPICZaC-PSA,电转化至毕赤酵母X33,甲醇诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒pPICZaC-PSA经双酶切及测序鉴定正确,表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约69500处可见特异条带,表达量为菌体总蛋白的29.5%,紫外吸收法测定蛋白含量为0.06mg/ml,并可与PSA多抗发生特异性反应。结论已成功克隆了PSA基因,并在毕赤酵母中获得表达。     

一种新型杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

目的在毕赤酵母中表达杂合抗菌肽CA(1-11)CD(12-37)ME(1-18)(ADM),并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱密码子,合成杂合抗菌肽CA(1-11)CD(12-37)ME(1-18)基因,插入pPIC9K载体,构建重组表达质粒pPIC9K-ADM,电转化至毕赤酵母GS115,筛选阳性菌株,甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE检测ADM蛋白的表达,并对其抗菌活性进行初步检测。结果重组表达质粒pPIC9K-ADM经双酶切和测序鉴定证明构建正确;阳性酵母转化子的PCR产物可见目的基因条带;杂合抗菌肽在毕赤酵母GS115中获得分泌表达,可溶性蛋白约占菌体总蛋白的13%;且对E.coli DH5α、E.coliJM109和金黄葡萄球菌具有一定的抗菌活性。结论已在毕赤酵母GS115中表达了具有一定抗菌活性的杂合抗菌肽ADM,为相关新药的研究奠定了基础。     

抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。     

重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A在毕赤酵母中的表达及纯化

目的在毕赤酵母中表达Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A。方法提取Thermomonospora fusca基因组DNA作模板,PCR扩增纤维素酶Cel6A基因,克隆到毕赤酵母表达载体pGAPZαA上,用电击法将线性Cel6A-pGAPZαA核酸片段转化毕赤酵母X-33株,克隆PCR鉴定法筛选阳性转化株,培养传代。选择稳定株,培养3d后取培养液上清,用His-BindQuick Cartridge300提取表达的重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A。结果一步His-Bind Quick Cartridge300层析可提取电泳纯的重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A,SDS-PAGE分析显示相对分子质量约为60000,收率为200mg/L,用羧甲基纤维素法测活性为500U/mg,用滤纸法测活性为1U/mg。结论已在毕赤酵母中成功表达了Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A。     

人纤溶酶原K5基因在毕赤酵母中的表达及其抗肿瘤活性

目的在毕赤酵母中表达人纤溶酶原K5基因,并检测hK5蛋白的抗肿瘤活性。方法根据酵母遗传密码的偏爱性优化设计hK5基因,构建重组表达质粒p819-8α-hK5,经G418加压筛选和甲醇诱导表达,并对摇瓶发酵条件进行优化。表达的hK5蛋白经纯化后,通过荷H22肿瘤昆明小鼠模型检测其抗肿瘤活性。结果筛选到2株高表达hK5蛋白的转化子,摇瓶表达量超过150mg/L,纯化后的蛋白纯度大于95.0%,并能够显著抑制昆明小鼠H22肿瘤的生长。结论hK5基因能够在毕赤酵母中高效分泌表达,且表达的hK5蛋白具有良好的抗肿瘤活性。     

Catesbeiania-1在毕赤酵母中的表达及其体外生物活性

目的在毕赤酵母中表达抗菌肽Catesbeiania-1,并检测其体外生物活性。方法将从牛蛙皮肤上新分离的一条抗菌肽基因Catesbeiania-1克隆至真核表达载体pPICZaA,构建重组真核表达质粒pPICZaA-Catesbeiania-1。在毕赤酵母GS115中表达重组Catesbeiania-1蛋白,并进行体外生物活性测定。结果所构建的重组表达质粒pPICZaA-Catesbeiania-1序列完整,经Tricine-SDS-PAGE分析,表达的重组Catesbeiania-1蛋白相对分子质量约为5800,分泌性蛋白的表达量为36.3mg/ml。重组蛋白对几种常见的革兰阳性菌和阴性菌均具有较好的抑菌活性,无胰蛋白酶水解活性和抑制剂活性,具有很强的抗氧化能力。结论已成功表达了抗菌肽Catesbeiania-1,表达的重组蛋白具有一定的抑菌活性。     

重组DT/bFGF融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化

目的构建重组DT/bFGF融合蛋白表达载体,制备高纯度的DLF融合毒素。方法PCR扩增DT389和bFGF的编码DNA序列,经酶切和连接,克隆至表达载体pET-30a,转化E.coliBL21(DE3),鉴定阳性克隆菌落,经IPTG诱导表达融合蛋白DLF,镍离子螯合层析纯化,用Westernblot分析其抗原性。结果测序表明,插入片段可编码含545个氨基酸残基的融合蛋白DLF。SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白可在大肠杆菌中表达,其表达量约占菌体总蛋白的20%,表达形式主要为包涵体。纯化后纯度达90%以上。Westernblot证实,该融合蛋白同时具有DT和bFGF两种抗原性。结论已成功构建DT/bF-GF表达载体,并获得较纯的DLF融合毒素。     

人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性

目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。     

Pichia酵母表达重组人可溶性TRAIL的纯化与生物活性

目的分离纯化Pichia酵母表达的重组人可溶性TRAIL,并检测其生物活性。方法以Pichia酵母分泌型表达TRAIL,采用硫酸铵沉淀和柱层析纯化可溶性TRAIL蛋白。以SDSPAGE、ESIMS和Westernblot法鉴定其纯度及特异性。以细胞透射电镜、DNALadder和MTT法检测其诱导肿瘤细胞凋亡活性。结果目的蛋白以可溶形式存在,蛋白相对分子质量22000,纯化后纯度95%。Westernblot证实为TRAIL蛋白。电镜、DNALadder和MTT均证实其具有诱导肿瘤细胞凋亡活性。结论Pichia酵母表达rhsTRAIL可用柱层析法纯化,并具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性。