HIV-1 Gag蛋白在重组痘苗病毒中的高效表达及其特性分析

在构建3株人Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV－1）Gag基因重组痘苗病毒的基础上,实现了Gag蛋白的高效表达,3株重组病毒在感染细胞中表达量分别为14．7、6．0和4.5μg／106细胞／20h,接近杆状病毒的表达水平。表达的重组蛋白可形成病毒样粒子（VLP）,并可诱导小鼠产生抗HIV抗体。     

利用中国流行株HIV-1 Gag重组痘苗病毒与核酸疫苗免疫的新程序

目的 将中国流行株ＨＩＶ－１　Ｇａｇ基因在痘苗病毒中表达,以重组痘苗病毒与核酸疫苗混合免疫,进 而研制艾滋病疫苗。方法 将中国流行株ＨＩＶ－１ Ｇａｇ基因片段插入到ｐＪ３８载体启动子下游,经同源重组和血凝素 阴性空斑筛选重组痘苗病毒,经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ检测目的蛋白。以重组痘苗病毒与核酸疫苗进行小鼠免 疫试验,淋巴细胞转化实验,ＣＩＬ,ＣＤ＋４;ＣＤ＋８细胞计数及细胞免疫和体液免疫水平检测。结果 重组痘苗病毒ｖＪ３８ Ｇａｇ具有良好的免疫原性,与２ｒＶＶ－ＤＮＡ混合免疫效果更好。结论 重组痘苗病毒 ｖＪ３８ Ｇａｇ能够表达Ｇａｇ蛋白并诱 导机体产生细胞免疫和体液免疫。     

不同形式脊髓灰质炎病毒颗粒的免疫原性

目的评价不同形式的脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)颗粒的免疫原性。方法采用蔗糖密度梯度超速离心法分别将经56℃加热1.5 h处理和未经加热的PV进行分离纯化,收集相应组分,进行电镜观察及SDS-PAGE分析,并测定各组分的D抗原及蛋白含量。用不同PV颗粒组分分别免疫大鼠,均经腿部肌肉注射,共接种3次,每次间隔21 d,于免疫前和第1、2次免疫后21 d经眼眶采血,末次免疫后21 d经心脏穿刺采血,分离血清,微量细胞病变(CPE)抑制法检测血清中抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PV中和抗体几何平均滴度(GMT)。结果未经加热处理的PV可分离获得EP(蔗糖浓度16%~19%)和FP(蔗糖浓度22%~24.5%)两种病毒颗粒,电镜观察分别为空心颗粒和实心颗粒,EP经SDS-PAGE分析可见VP0、VP1和VP3病毒蛋白条带,FP可见VP1、VP2、VP3和VP4条带;经56℃加热处理的PV可分离获得HP(蔗糖浓度15%~17%)一种病毒颗粒,电镜观察为空心颗粒,SDS-PAGE分析可见VP0、VP1、VP2、VP3病毒蛋白条带。EP、FP免疫大鼠后,均可诱导产生针对PV的中和抗体,但EP诱导产生的中和抗体GMT低于FP;HP不能诱导产生中和抗体。结论未经加热的PV可分离获得EP和FP两种病毒颗粒,均具有免疫原性;经加热处理的PV仅分离获得HP一种病毒颗粒,不具有免疫原性。     

呈现埃博拉病毒包膜糖蛋白抗原表位重组病毒样颗粒的构建

目的构建呈现埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)包膜糖蛋白(glycoprotein,GP)抗原表位的病毒样颗粒(viruslike particles,VLPs)。方法通过EBOV GP抗原性预测,并结合其功能结构域分析获得潜在的B细胞表位,经基因重组将该抗原表位插入至乙肝核心抗原(HBcAg)的优势表位区域,SDS-PAGE法分析重组HBcAg抗原表位嵌合蛋白的表达。重组菌体破碎上清经硫酸铵沉淀和蔗糖密度梯度离心纯化后,通过电镜观察VLPs形态。将VLPs与Alum佐剂按1∶1的比例混合,经背部皮下免疫小鼠。ELISA及Western blot法检测小鼠血清的特异性。结果重组HBcAg抗原表位嵌合蛋白的相对分子质量约19 300,纯化后蛋白浓度为1.244 mg/ml,镜下可见其以VLPs形式存在。VLPs免疫小鼠血清可与GP发生特异性免疫反应。结论成功构建了呈现EBOV GP抗原表位的VLPs,其可有效诱导小鼠产生特异性免疫应答。本实验为EBOV基因重组疫苗的研究及特异性抗体的制备奠定了基础。     

重组传染性法氏囊病病毒VP2/VP243基因表达及保护性和免疫原性

目的在重组鸡痘病毒中表达传染性法氏囊病毒 VP2/VP243基因,并研究表达产物的保护性和免 疫原性。方法以 FPV 282E_4株 TK基因为侧翼,分别将鸡法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV) VP2 和VP243目的基因克隆到牛痘病毒A型包涵体(ATI)和痘苗病毒P7.5复合型启动子下游,构建成2个重组表达质 粒,命名为pUTALacVP和pUTA LacVPO。用这2个质粒转染CEF细胞,用X-gal染色法筛选出2株重组病毒vUTA lacVP2和 vUTALacVP0。用这 2株病毒免疫 1周龄 SPF鸡,以常规疫苗为对照。结果 ELISA、SDS-PAGE和 Western blot表明表达产物可与IBDV特异性多克隆抗体反应,并诱导鸡保护性抗体。在使用vvIBDV攻击前,对照组抗体水 平显著高于实验组。但攻击5 d后,实验组抗体水平明显升高。结论vUTALacVP2和 VPO在 CEF细胞中实现了高 效表达,但重组疫苗的保护率低于常规疫苗。     

基于中和表位的GⅡ.4型重组诺如病毒VP1蛋白病毒样颗粒抗原含量检测方法的建立及验证

目的建立基于中和表位的GⅡ. 4型重组诺如病毒(Norovirus,NoV)VP1蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)抗原含量检测方法,并进行验证,以用于重组NoV疫苗质量控制。方法应用ELISA和HBGA-VLP阻断试验筛选中和性单克隆抗体,并筛选配对抗体,分别作为包被抗体和检测抗体,建立GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。确定方法的线性检测范围,并对方法的专属性、准确性和精密性进行验证。结果27株GⅡ. 4 VLP特异性ELISA检测阳性的杂交瘤细胞克隆中,有12株GⅡ. 4型阻断抗体检测呈阳性,选择具有GⅡ. 4型阻断活性的特异性单抗2H7-C5和2E6-B3作为双抗夹心抗体对,用于建立GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。该方法的线性测定范围为15. 63～250 ng/mL,标准曲线R2均 0. 98;准确性验证的加标回收率在72. 23%～134. 03%之间;重复性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为7. 06%,中间精密性验证的RSD分别为8. 04%和9. 14%。结论建立了基于中和表位的GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP抗原含量检测方法,该方法专属性、准确性、精密性良好,可用于GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP定量检测,为GⅡ. 4抗原相关疫苗研发中质量控制和检定提供了技术支持。     

抗博尔纳病病毒磷蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)重组磷蛋白(p24)多克隆抗体,并对其进行鉴定,为BDV血清免疫学检测方法的建立奠定基础。方法用本课题组前期制备的重组BDVp24蛋白经背腿部多点皮下注射免疫新西兰大白兔,共免疫4次,末次免疫后第7天采血,分离血清,采用抗原亲和纯化法纯化抗血清,ELISA法测定抗血清效价;Western blot和免疫荧光鉴定其特异性。结果制备的抗BDV p24多克隆抗体的纯度为98%,ELISA效价达1∶128 000,该抗体与重组p24蛋白和BDV感染OL细胞表达的p24蛋白均能发生特异性反应。结论成功制备了灵敏性和特异性良好的抗BDV p24多克隆抗体,为研发相关的诊断试剂和研究该病毒的感染发病机制奠定了基础。     

抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒单克隆抗体的制备

目的制备抗脊髓灰质炎病毒单克隆抗体,为ELISA检测方法的建立奠定基础。方法将Ⅰ型脊髓灰质炎减毒疫苗原液和灭活疫苗原液经超滤、超离纯化,以纯化的减毒脊髓灰质炎病毒D抗原免疫BALB/c小鼠,得到的脾细胞与SP2/0-A14小鼠骨髓瘤细胞融合,以纯化的灭活脊髓灰质炎病毒D抗原建立间接ELISA法,筛选分泌特异性单抗的阳性细胞株,诱生小鼠腹水,通过正辛酸-硫酸铵法纯化抗体,并进行各项鉴定。结果获得两株稳定分泌抗脊髓灰质炎病毒单抗的细胞株7G5及5E4。纯化的7G5和5E4株单抗分别可与脊髓灰质炎病毒D抗原的VP2、VP3衣壳蛋白结合;在不同温度下放置均比较稳定;pH4不利于7G5株单抗的保存;5E4株单抗的相对亲和力大于7G5株;7G5株单抗的亚类为IgM,5E4株单抗的亚类为IgG2a;两株单抗可识别相似表位;7G5株和5E4株单抗的中和效价分别为1:64和1:128。结论已成功制备了两株分泌抗脊髓灰质炎病毒的单抗。     

狂犬病病毒4aG株G蛋白基因的克隆及其生物信息学分析

目的克隆狂犬病病毒(Rabies virus,RV)4aG株G蛋白基因,并与其他疫苗毒株G蛋白基因序列进行比较,为我国狂犬病疫苗的研制提供理论依据。方法从RV 4aG株中扩增G蛋白基因,并进行序列测定,利用生物信息学软件绘制系统进化树,预测G蛋白功能位点、二级结构和B细胞抗原表位,并与其他疫苗毒株进行比较。结果克隆的4aG株G蛋白基因序列与GenBank中登录的序列一致。进化树分析显示,4aG株与CVS株的进化关系较远;4aG、4aGV18、CVS、PV及RC-HL毒株跨膜区域在第460～479氨基酸之间,其他毒株在459～478氨基酸之间;PV株有5个糖基化位点,RV-97株有3个糖基化位点,其他毒株均有4个糖基化位点;G蛋白抗原表位位于氨基酸100～300及480～520之间;不同毒株G蛋白抗原位点区域有所不同,与CVS株比较,PV株抗原表位与其最为接近,4aG、4aGV18、CTN-1-31及Flury-HEP株与其抗原表位较为接近。结论4aG株G蛋白功能位点和抗原表位与CVS株相差较大,但其在Vero细胞上传代稳定,可用于制备Vero细胞纯化疫苗。     

输血传播病毒ORF2基因的克隆和原核表达

目的克隆输血传播病毒(TTV)兰州株ORF2的基因,并构建原核表达载体。方法通过巢式PCR,从一份兰州地区无偿献血员血清中扩增TTV病毒的ORF2基因,并克隆到pGEM-T载体中,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆到高效表达质粒pET22b(+)中,构建表达载体ORF2-pET22,在大肠杆菌中诱导表达带有6个组氨酸标签的ORF2融合蛋白。用纯化的重组ORF2蛋白作为抗原,ELISA检测人血清样本中的TTV-IgG抗体。结果ORF2基因与日本TA287株的同源性为99.3%。用TTV-PCR阳性的血清对重组蛋白进行了Western blot,结果在表达蛋白位置处出现了特异性反应条带。以ORF2蛋白为抗原的ELISA检测结果具有较好的准确性。结论已成功克隆了ORF2基因,并在原核细胞中表达。     

Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A-3C基因真核表达质粒。方法采集疫区牛的水疱液及水疱皮,经RT-PCR法扩增出Asia 1型FMDV的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切、连接,获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。经酶切获得P1-2A-3C片段,插入真核表达载体pVAXⅠpCMV启动子下游,构建pVAXⅠ-P1-2A-3C真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,进行IFA检测。结果Asia 1型FMDV真核表达载体pVAX1PⅠ-2A-3C,经酶切鉴定证明构建正确,转染HeLa细胞后,可见明显的黄绿色荧光,表明P1-2A-3C基因得到了表达。结论pVAXⅠ-P1-2A-3C可作为Asia1型FMD核酸疫苗的候选疫苗。     

狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3区缺失转移表达载体的构建及表达

目的构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞系统中高效表达。方法将含狂犬病毒SRV9株糖蛋白(Rgp)cDNA的pGT载体,经双酶切后回收Rgp基因片段,与经双酶切的真核表达载体pIRES1neo连接,得到pIRES1Rgp,再经双酶切后回收2623bp片段,与E3缺失载体pBE3L连接,得到含狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体pBE3LCRgp,再转染MDCK细胞。结果pBE3LCRgp转染的MDCK细胞,经间接ELISA和间接免疫荧光法在其培养上清中均能检出Rgp的高效表达。结论已成功构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞中高效表达。     

小鼠载脂蛋白A-Ⅰ的原核表达及抗血清的制备

目的原核表达小鼠载脂蛋白A-Ⅰ(ApoA-Ⅰ),并制备抗血清。方法应用RT-PCR方法从小鼠肝脏中扩增ApoA-Ⅰ基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Ni2+-NTA柱纯化后,免疫家兔,制备抗血清。结果扩增的ApoA-Ⅰ基因经测序,表明与GenBank中报道的序列(NM_009692)完全相同。重组表达质粒经酶切鉴定,证明构建正确。表达的ApoA-Ⅰ融合蛋白相对分子质量约为32000,表达量占菌体总蛋白的17%。纯化的融合蛋白纯度达90.7%,可与抗His·Tag单抗发生特异性反应。制备的抗血清可识别ApoA-Ⅰ融合蛋白,效价可达1∶105。结论已在大肠杆菌中表达了小鼠ApoA-Ⅰ,并制备了较高效价的抗血清。     

犬干扰素α1基因在大肠埃希菌中的表达及其抗病毒活性的测定

目的在大肠埃希菌中高效表达重组犬干扰素α1(canine interferon alpha1,CaIFNα1)基因,并对其抗病毒活性进行初步研究。方法根据大肠埃希菌密码子的偏嗜性,人工合成犬干扰素α1成熟蛋白编码基因,同时引入大肠埃希菌EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,将改造后合成的CaIFNα1核苷酸序列定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-CaIFNα1,并进行PCR及双酶切鉴定;将鉴定正确的重组表达质粒pET-CaIFNα1转化BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗VSV病毒活性。结果重组表达质粒经PCR及双酶切鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白CaIFNα1相对分子质量约39 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的61.5%,可被鼠抗His单克隆抗体及鼠抗CaIFNα1多克隆抗体特异性识别,在MDCK细胞上呈现较高的抗病毒活性,为2.0×106U/ml。结论已成功改造了CaIFNα1基因,并在大肠埃希菌中实现了高效表达,表达产物具有较高的抗病毒活性。     

稳定表达甲型流感病毒血凝素蛋白的哺乳动物细胞系的建立

目的建立稳定表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的哺乳动物细胞系。方法 PCR扩增流感病毒(A/PR/8/34)全长HA基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合至宿主细胞染色体上。采用Hygromycin B持续压力筛选重组细胞系CHO-HA,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测HA蛋白的表达。重组细胞连续培养10代后,采用PCR和IFA法检测细胞中HA的基因遗传和蛋白表达的稳定性。结果重组表达质粒pDF-HA经双酶切及测序,证实构建正确;通过Hygromycin B抗性及IFA,共筛选出20株高表达HA蛋白的重组细胞株,Western blot结果进一步证实,HA蛋白在重组细胞中获得表达,并被切割成HA1和HA2蛋白;连续培养10代后,PCR与IFA方法分别检测到重组细胞HA基因和蛋白的表达。结论已成功建立了稳定表达甲型流感病毒HA蛋白的哺乳动物细胞系,为针对HA蛋白和流感病毒的免疫学检测以及HA蛋白的功能研究提供了靶细胞。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的串联与原核表达

目的构建C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,并鉴定其表达产物的免疫反应性。方法首先合成C型口蹄疫病毒C-S8C1株VP1基因的3个抗原表位,并克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点酶切后连接,构建出C型VP1双拷贝基因片段(VP1C)。将VP1C基因连接到原核表达载体pET-CKS上,构建重组质粒pETCKS-VP1C,转入BL21菌中进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物,并利用包涵体洗涤法对表达产物进行初步纯化。结果VP1C基因在大肠杆菌中获得表达,产量占沉淀蛋白的45%,且表达产物可以被C型口蹄疫病毒标准血清所识别。VP1C重组蛋白纯度达84.1%。结论已成功构建了C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,所表达的VP1C有良好的免疫反应性,可以作为检测C型口蹄疫病毒的候选基因。     

SARS病毒S2蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究用毕赤酵母菌表达SARS病毒S2蛋白亚单位。方法依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成SARS病毒刺突蛋白S2亚单位的基因(1590bp),再与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-S2,转化毕赤酵母GS115,并经MD和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-S2。经诱导、表达,并对表达产物进行分析、鉴定。结果所构建的重组质粒pPIC9K-S2正确,在毕赤酵母中可高效表达,其表达产物与阳性SARS血清产生特异性反应。结论SARS病毒刺突蛋白S2亚单位可在毕赤酵母中高效表达,产物具有良好的抗原特异性。     

人源溶菌酶基因在杆状病毒系统中的表达

目的在杆状病毒系统中表达人源溶菌酶(Human lysozyme,hLY)基因,为其临床应用和大规模生产奠定基础。方法将人工合成的含信号肽和不含信号肽的溶菌酶基因克隆至重组杆状病毒表达系统的载体中,构建重组穿梭质粒,转染sf9细胞,SDS-PAGE和Western blot验证蛋白的表达,溶菌试验验证表达产物的溶菌酶活性。结果重组克隆质粒PFastBacHTA-signal-lysozyme和PFastBac HTA-lysozyme的PCR产物分别可见444和393 bp的目的基因条带,测序结果证实重组克隆质粒构建正确。PCR结果显示Lysozyme-1、Lysozyme-2、slysozyme-1、slysozyme-2、slysozyme-3、slysozyme-4号重组穿梭质粒可扩增出目的条带。sf9-PHLY和sf9-PHSLY的表达产物经12%SDS-PAGE分析,分别可见相对分子质量约17 500和19 300的特异蛋白条带;表达的两种重组蛋白均可与鼠抗6×His单抗特异性结合;表达产物具有溶菌酶活性。结论成功在杆状病毒表达系统中表达了hLY基因,为其临床应用和大规模生产奠定了基础。