发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

研究分离纯化发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶(cell envelope proteinase,CEP)的方法及其酶学性质。用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)悬浮菌体,进行超声波破碎,细胞质量浓度为0.06g/mL,破碎功率330W,工作220次(工作时间3s,间隔时间5s),离心取上清液即为粗酶液。60%硫酸铵沉淀,Sephacryl S-300 HR凝胶层析,Native-PAGE割胶回收纯化发酵乳杆菌的CEP。用纯化的CEP 酶解脱脂乳,酶解液ACE(angiotensin I-converting enzyme)抑制率为50%。SDS-PAGE检测CEP分子质量为32.5kD,最适酶反应温度为41℃,最适酶反应pH值为8.0。Mg2+、Co2+、Ca2+对CEP活性有激活作用;Zn2+、Ni2+、PMSF、EDTA对CEP活性有抑制作用,说明CEP为丝氨酸蛋白酶且酶的活性中心结构的维持与金属离子有关。     

皱纹盘鲍内脏β-1,3-葡聚糖酶的提取及其酶学性质研究

从鲍鱼内脏提取β-1,3-葡聚糖酶粗酶并研究其酶学性质。以昆布多糖为底物监控酶的活性。鲍鱼内脏经匀浆后,采用3倍体积0.1mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)浸提12h。浸提液经离心后收集上清液,并采用60%饱和度的硫酸铵对上清液中的蛋白进行盐析沉淀得β-1,3-葡聚糖酶粗酶。研究表明,粗酶中β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度为40℃,酶活力在40℃以下稳定;酶的最适pH为6.0,酶活力在pH4.0～7.0范围内稳定。Mn2+能明显激活酶活力,而Cu2+、Fe3+、Hg+对酶活力有抑制作用,其中Fe3+的抑制作用最强;亮肽酶素和1,10-菲啰啉对酶活力有明显的抑制作用,而E-64对酶活力有一定的激活作用;此酶对海藻酸钠也有一定水解能力。     

低温脂肪酶的分离纯化及酶学性质

苏云金芽胞杆菌CZW001脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、超滤离心、DEAE-纤维素-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为75.5倍,活性回收率为37.6%,12%SDS-PAGE电泳估计其相对分子质量约40 000。对纯化后的脂肪酶进行酶性质研究表明:酶的最适作用温度为25℃,对热敏感,60℃处理30 min仅残留30%酶活性;酶的适宜作用pH范围在7～9,最适pH为8;该脂肪酶的水解活性对Ca2+表现明显的依赖性,Al3+、Zn2+和Fe2+对脂肪酶有显著的抑制作用;脂肪酶对醇类有机溶剂的耐受性随碳链增加而减小;脂肪酶对豆油表现出显著的特异性,而蓖麻油抑制脂肪酶水解活力。     

双酶水解乳清蛋白ACE抑制肽的制备工艺优化

以乳清蛋白为原料,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶先后水解乳清蛋白,通过单因素试验和正交试验优化胃蛋白酶和胰蛋白酶水解乳清蛋白制备血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的工艺,将水解物以3 kDa超滤膜过滤,研究表明,胃蛋白酶水解乳清蛋白最佳酶解工艺条件为水解温度37℃、底物质量浓度6 g/100 mL、酶与底物比3 728 U/g,此时乳清蛋白ACE抑制率为86%;胰蛋白酶水解乳清蛋白最佳酶解条件为温度55℃、底物质量浓度6 g/100 mL、酶与底物比3 480 U/g,此时ACE抑制率为72%。利用超滤离心管获得分子量小于3 kDa的乳清蛋白ACE抑制率96%。     

乳糖酶特性的研究

从脆壁酵母菌中提取得乳糖酶,其特性:酶最适温度45℃,最适pH值6.5,酶水解乳糖所需的最适乳糖浓度为15%。温度、pH、乳糖浓度和酶浓度对酶水解乳糖影响程度的大小顺序是;pH＞酶浓度＞温度＞乳糖浓度。K+、Na+、Mg++、Mn++对酶有明显的激活作用,Ca++有抑制作用,而微量Ca++（1.0mM）表现激活作用。40℃、0.4%和0.6%酶量水解含乳糖15%的乳清以及30℃C、0.3%酶量水解15%乳糖水溶液,在5小时之内,乳糖水解率均可达80%,达到商业要求。     

中国蛤蜊内源酶性质的研究

研究了中国蛤蜊的肌肉与消化腺中内源酶的性质。结果表明:1中国蛤蜊肌肉中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H为7.0与9.0,可能存在同工酶;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Ca2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Cu2+在5mmol/L时,对酶活力有激活作用,随着浓度升高对酶活力有抑制作用;Mn2+在5~15 mmol/L时,对酶活力影响不大,在20 mmol/L时对酶活力有激活作用。2消化腺中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H 8.0;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Mn2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Ca2+在5 mmol/L时,对酶活力有抑制作用,随着浓度升高有促进作用。Cu2+在5~15 mmol/L时对酶活力有促进作用,当浓度为20 mmol/L时,对酶活力有抑制作用。3肌肉中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H 10.0;Mn2+、Ca2+对淀粉酶活力有促进作用;Pb2+在5~10 mmol/L时对酶活力有促进作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有抑制作用;Mg2+在5~10 mmol/L时对酶活力有抑制作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有促进作用;Cu2+在5 mmol/L时对酶活力有促进作用,随着浓度升高,对酶活力有抑制作用。4消化腺中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H为9.0;Ca2+在20 mmol/L时对淀粉酶活性有促进作用,低于此浓度有抑制作用。Pb2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+对淀粉酶活性皆有不同程度的抑制作用。     

菌酶协同发酵水解大米蛋白ACE抑制肽及其活性的研究

使用植物乳杆菌2-18和枯草芽孢杆菌Y、枯草芽孢杆菌Y4-2联合蛋白酶共同水解大米蛋白,测定大米蛋白的水解溶出率及脱除液的血管紧张素转换酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制活性。在利用菌酶联合水解大米蛋白的组合中,植物乳杆菌2-18+风味蛋白酶/菠萝蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶组合对大米蛋白的水解溶出率最高,蛋白脱除率为(91.32±1.60)%。大米蛋白水解溶出液中必需氨基酸占总氨基酸含量的39.62%。通过对分子量分布分析,大米蛋白水解溶出液的多肽分子量分布主要在1 kDa～1.5 kDa部分。经植物乳杆菌2-18+风味蛋白酶/菠萝蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶组合对大米蛋白的水解溶出液ACE抑制率达(91.95±1.63)%,具有良好的ACE抑制活性。     

猪血管紧张素转换酶2的分离纯化及性质研究

血管紧张素转换酶2（Angiotensin converting enzyme 2,ACE2）是参与血压调节的关键酶之一,由于传统的ACE2纯化方法难度大、效率低,因此,有必要优化其分离纯化方法,为ACE2的基础研究提供保障。本研究以猪肾为原材料,通过酸沉淀、硫酸铵盐析,结合DEAE-Sepharose、Q-Sepharose及Phenyl Sepharose柱层析对ACE2进行分离纯化。探究了温度、pH、金属离子、抑制剂对纯化的ACE2的活性影响,并通过PAS染色验证其是否为糖蛋白。实验结果表明,纯化的ACE2分子量约为98 kDa,纯化倍数为149.8,得率为0.1%。对ACE进行质谱鉴定,得到41个肽段,与猪ACE2的氨基酸序列高度一致。酶学性质研究结果表明,ACE2为金属蛋白酶,最适pH为7.0,最适温度为40 ℃。Zn2+能激活其活性,而金属离子Cu2+、Fe3+和Cd2+对ACE2的活性有抑制作用。圆二色谱分析发现,ACE2的热变性温度为67.5 ℃。PAS染色结果显示猪ACE2为糖蛋白。本研究结果可为天然ACE2的高效纯化提供参考,也有助于推进以ACE2为靶点的功能性食品开发。     

嗜酸乳杆菌胆盐水解酶的分离纯化及酶学性质

对嗜酸乳杆菌La-XH1产生的胆盐水解酶进行分离纯化,并对其部分酶学性质进行研究。结果表明：嗜酸乳杆菌La-XH1胆盐水解酶的粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B柱层析后的酶比活力分别为47.82 U/mg和115.85 U/mg,纯化倍数分别为4.46 倍和10.82 倍,酶的回收率分别为59.89%和25.11%;通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）电泳分析,该酶的分子质量约为43 kD,最适温度为40 ℃,最适pH值为6.0,Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+对该酶有激活作用,其中Fe3+的激活作用最强,Na+、K+对该酶几乎无作用,而Cu2+、Ba2+对该酶有很强的抑制作用。     

酶法生产大豆蛋白ACE抑制肽的研究

研究了Alcalase碱性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、Protames复合蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶对大豆分离蛋白的水解效果和ACE(血管紧张素转化酶)的抑制活性。水解能力用pH-start法检测,水解度大小依次为:Alcalase碱性蛋白酶>Protames复合蛋白酶>Neutrase中性蛋白酶>Flavourzyme风味蛋白酶;ACE抑制活性用高效液相法检测,ACE抑制率强弱依次为:Alcalase碱性蛋白酶>Flavourzyme风味蛋白酶>Protames复合蛋白酶>Neutrase中性蛋白酶。综合考虑,选定Alcalase碱性蛋白酶为生产大豆ACE抑制肽的最适酶,并对其酶解条件进行了优化,确定生产大豆ACE抑制肽的最佳条件为:温度60℃、pH8.0、[S]=4%、[E]/[S]=4%,这时的水解度为14.4%。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的分离纯化研究

本实验对嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的分离纯化进行了研究。嗜酸乳杆菌的粗酶液经40%～80%饱和度的硫酸铵盐析、透析、SephadexG-100凝胶过滤层析等步骤进行分离纯化后,酶的纯化倍数达到3.10,比活力为475.75U/(mg蛋白质);纯化后的亚油酸异构酶在SDS-PAGE电泳中只呈现一条带,并测得分子量约为46.6kDa。     

乳酸菌盐溶性蛋白培养物中血管紧张素转化酶抑制活性肽的测定及分离

将16 株乳酸菌用MRS液体培养基3 代继代培养后,离心,并用灭菌的生理盐水制成乳酸菌悬浮液,接种于远东多线鱼肉盐溶性蛋白溶液（salt-soluble protein,SSP）,对其代谢产物进行血管紧张素转化酶（angiotensinconverting enzyme,ACE）抑制活性测定,筛选出ACE抑制活性较高的Pediococcus acidilactici ID7菌株（ACE抑制率为47.6%）和Lactobacillus plantarum 6214菌株（ACE抑制率为40.6%）。利用高效液相色谱（high performanceliquid chromatography,HPLC）对Pediococcus acidilactici ID7的盐溶性蛋白培养代谢物进行色谱分析,获得了两个峰,其相应成分对ACE抑制的IC50分别为1.21 μg/mL和1.07 μg/mL,利用凝胶过滤HPLC法对出现较高的ACE抑制活性峰的成分进行色谱纯化,获得了ACE抑制率为26.67%,分子质量为586.7 D以下的ACE抑制多肽。     

干酪乳杆菌胞壁蛋白酶的分离及水解酪蛋白产物特性

通过DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-100对干酪乳杆菌胞壁蛋白酶粗提物进行分离纯化,分离到酶比活力为12.50U/mg的CEP-1与16.67U/mg的CEP-2两种胞壁蛋白酶。CEP-1提纯倍数达到50,回收率为33.61%;CEP-2提纯倍数为66.68,回收率55.17%。对不同时间和底物浓度下CEP-1与CEP-2的α-酪蛋白和β-酪蛋白水解特性进行研究。结果显示,酪蛋白水解产物有显著的抗ACE与抗氧化活性,产生最高ACE抑制活性的水解条件为：CEP-2水解α-酪蛋白,时间6h,酶与底物质量比1:10,此时ACE抑制活性为84.66%;在酶与底物质量比1:40,水解时间4h条件下,CEP-2水解β-酪蛋白产生最佳的O2－ ·清除能力,其IC50为0.2138mg/mL。     

嗜酸乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取优化

为了获得较高酶活力的嗜酸乳杆菌细胞壁蛋白酶(CEP),对嗜酸乳杆菌CEP的提取方法进行优化。经过比较超声波破碎法、Ca2+-free法、溶菌酶裂解3种方法,确认溶菌酶裂解法结合使用非离子清洁剂破壁是提取嗜酸乳杆菌CEP的最佳方法。在单因素试验的基础上,采用正交试验对嗜酸乳杆菌CEP的提取工艺进行优化,得出嗜酸乳杆菌CEP的最佳提取方法：用裂解液(50mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl、TritonX-100添加量1%、1.5mg/mL溶菌酶,pH 7.8)悬浮菌体(20mL/g),37℃保温3h,4℃、4500r/min离心20min,取上清液。溶菌酶裂解法提取CEP过程中各因素对CEP提取效果的影响依次为：溶菌酶质量浓度＞裂解pH值＞TirtonX-100添加量＞保温时间。     

Isolation,selection, and characterization of lactic acid bacteria for a competitive exclusion product to reduce shedding of Escherichia coli O157:H7 in cattle

Lactic acid bacteria (LAB) were selected on the basis of characteristics indicating that they would be good candidates for a competitive exclusion product (CEP) that would inhibit Escherichia coli O157:H7 in the intestinal tract of live cattle. Fecal samples from cattle that were culture negative for E. coli O157:H7 were collected. LAB were isolated from cattle feces by repeated plating on deMan Rogosa Sharpe agar and lactobacillus selection agar. Six hundred eighty-six pure colonies were isolated, and an agar spot test was used to test each isolate for its inhibition of a four-strain mixture of E. coli O157:H7. Three hundred fifty-five isolates (52%) showed significant inhibition. Seventy-five isolates showing maximum inhibition were screened for acid and bile tolerance. Most isolates were tolerant of acid at pH levels of 2, 4, 5, and 7 and at bile levels of 0.05, 0.15, and 0.3% (oxgall) and were subsequently identified with the API system. Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbreukii, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus brevis, Lactobacillus cellobiosus, Leuconostoc spp., and Pediococcus acidilactici were the most commonly identified LAB. Nineteen strains were further tested for antibiotic resistance and inhibition of E. coli O157:H7 in manure and rumen fluid. Four of these 19 strains showed susceptibility to all of the antibiotics, 13 significantly reduced E. coli counts in manure, and 15 significantly reduced E. coli counts in rumen fluid (P < 0.05) during at least one of the sampling periods. One of the strains, M35, was selected as the best candidate for a CEP. A 16S rRNA sequence analysis of M35 revealed its close homology to Lactobacillus crispatus. The CEP developed will be used in cattle-feeding trials.     

产ACE抑制肽乳酸菌的筛选、益生特性评定及应用

目的:筛选出富产血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽的乳酸菌并评定其益生特性.方法:依据蛋白水解度及ACE抑制率对乳酸菌进行初筛,然后依据模拟胃肠消化后的ACE抑制率最终筛出2株乳酸菌ZJUIDS09和ZJUIDS11,进一步评价其耐酸、耐胆盐、抗生素耐药性和抑菌...     

绿色木霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

针对绿色木霉AS3.3711产生的β-葡萄糖苷酶组分,先后运用包括乙酸铵沉淀、透析、Sephadex G-150葡聚糖凝胶柱层析在内的一系列分离纯化技术对该纤维素酶进行纯化,得到β-葡萄糖苷酶纯化组分,并对该酶的酶学性质进行研究。纯化后酶液的蛋白质量浓度为8.12 mg/mL、酶活力为4.08 U/mL,纯化倍数达到18.48,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）测定分子质量为66.0 kD。绿色木霉β-葡萄糖苷酶在酸性条件下稳定性良好,最适pH值为5.0;在温度60～70 ℃能长时间保持较高酶活力,最适反应温度为60 ℃。金属离子中,Ca2+、Mg2+、K+对绿色木霉AS3.3711 β-葡萄糖苷酶活力起到促进作用,Ca2+促进作用最强;而Zn2+、Fe3+对该酶有抑制作用,Ag+、Cu2+、Hg2+重金属离子使β-葡萄糖苷酶几乎丧失了全部活性。