N末端结构模块缺失对嗜热酸性III型普鲁兰多糖水解酶TK-PUL酶学性质的影响

通过对嗜热酸性III型普鲁兰多糖水解酶TK-PUL进行N末端截短突变,并比较TK-PUL与突变酶的酶学性质,确定N末端结构模块的缺失对酶学性质的影响。结构模块N1的缺失改良了TK-PUL的催化特性,其α-淀粉酶比活力提高至TK-PUL的1.11 倍,普鲁兰酶比活力提高至TK-PUL的1.12 倍,于100 ℃的半衰期延长至TK-PUL的1.15 倍。结构模块N2的缺失提高了酶的热稳定性,于100 ℃的半衰期延长至TK-PUL的1.25 倍。但是结构域N2的缺失降低了酶的pH值稳定性、酶的底物结合能力以及比活力。并且结构域N2影响了酶的底物选择性,导致其α-淀粉酶活性与普鲁兰酶活性的比值由0.49提高至0.60。结果表明,TK-PUL的N末端结构模块N1和N2均不是其发挥催化活性所必需的结构区域,但是对酶的底物结合能力、底物降解能力以及稳定性具有重要影响。     

易错PCR技术提高嗜热酸性III型普鲁兰水解酶TK-PUL催化活性的研究

嗜热酸性III型普鲁兰水解酶TK-PUL在液化条件下可完全水解淀粉为淀粉糖,在“液化糖化一步法”的淀粉制糖工艺中具有巨大的应用潜力。本研究拟采用易错聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术提高TK-PUL的催化活性。经过两轮易错PCR及高通量筛选,获得了催化活性提高的突变体L538D。与TK-PUL相比,L538D以可溶性淀粉为底物的比酶活力提高了50%,以普鲁兰多糖为底物的比酶活力提高了21%;L538D以可溶性淀粉、普鲁兰多糖为底物的k_cat/K_m值分别提高了44%、27%。即L538D的α-1,4-糖苷键水解活性和α-1,6-糖苷键水解活性均明显提高,并且其α-1,4-糖苷键水解活性的提高幅度更大。同源模建得到的蛋白质分子结构显示,将TK-PUL中Leu538替换为Asp,可能通过缩短氨基酸残基侧链的长度和减弱氨基酸残基的疏水性,提高了催化活性位点Glu538所在loop结构的柔性,从而提高酶的催化活性。本研究结果表明,TK-PUL中Leu538是影响其催化活性的重要氨基酸残基。     

嗜热酸性普鲁兰水解酶Ⅲ的高效分泌表达及其酶学性质

本研究旨在通过共表达分子伴侣蛋白以及优化发酵条件来提高III型普鲁兰水解酶（TK-PUL）在短小芽孢杆菌中的分泌表达水平。通过构建共表达TK-PUL和分子伴侣蛋白的多种重组短小芽孢杆菌,并以胞外酶活为指标对其进行筛选,确定最有利于TK-PUL分泌表达的分子伴侣蛋白及对应的重组短小芽孢杆菌。在此基础上采用单因素实验和响应面法优化重组短小芽孢杆菌的发酵条件。结果表明,共表达分子伴侣蛋白PrsA^Ba的重组短小芽孢杆菌的胞外酶活达到98.79 U/mL,提高了0.31倍。该重组短小芽孢杆菌的最佳培养基包括19.65 g/L 葡萄糖、21.46 g/L 酵母提取物、12.01 g/L MgCl₂·6H₂O、9.02 g/L 脯氨酸、0.01 g/L FeSO₄·7H₂O、0.01 g/L MnSO₄·4H₂O、0.001 g/L ZnSO₄·7H₂O。在发酵温度为35 ℃、起始发酵pH为7.0的条件下,该重组短小芽孢杆菌于最佳培养基中培养66 h时,其胞外酶活达到192.68 U/mL,提高了1.56倍。本研究通过共表达分子伴侣蛋白和发酵优化实现了TK-PUL在短小芽孢杆菌的高效分泌表达,为TK-PUL的应用提供了基础。

     

耐热普鲁兰酶CBM68结构域中关键位点对其酶学性质的影响

通过对Anoxybacillus sp.LM18-11来源的耐热普鲁兰酶(Pul A)与麦芽三糖共结晶的晶体结构分析,在新命名的底物结合域CBM68中预测出4个与底物结合有关的氨基酸位点(Y14、D16、K62和R96),分别将4个氨基酸位点突变为丙氨酸,得到突变体Pul A~(Y14A)、Pul A~(D16A)、Pul A~(K62A)和Pul A~(R96A)。其中,突变酶Pul A~(Y14A)和Pul A~(R96A)的底物结合力及催化效率与野生酶Pul A相比均有明显降低,其K_m值分别比Pul A提高了4.2倍和2.5倍,k_(cat)/K_m分别为Pul A的29%和37%。同时,Pul A~(Y14A)和Pul A~(R96A)的最适作用温度均降低了10℃,Pul A~(R96A)的最适作用p H也降低了0.5个单位。说明Y14和R96是CBM68结构域中的关键氨基酸位点,这两个位点的发现为进一步探究CBM68结构域的作用机制奠定了基础。     

嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶协同压热制备莲子抗性淀粉的工艺优化及其功能特性研究

本研究以莲子淀粉为原料,采用嗜热酸性Ⅲ型普鲁兰水解酶（TK-PUL）与压热联合制备RS3型抗性淀粉（EHP-LRS3）。通过单因素实验和响应面试验对TK-PUL与压热联合制备EHP-LRS3的工艺参数进行了优化,采用扫描电子显微镜和X-射线衍射对EHP-LRS3的形貌、晶体结构进行了观察与分析,并考察了EHP-LRS3对长双歧杆菌的促增殖能力。结果表明,在TK-PUL酶解温度为80℃时制备EHP-LRS3的最佳工艺为：向质量分数为35.32%的莲子淀粉乳（pH5.00）中添加25.00 U/g（莲子淀粉）的TK-PUL,将混合物于80℃处理12.70 h,再将其依次于121℃压热处理10 min、4℃回生处理24 h。在最佳工艺条件下,EHP-LRS3的得率为58.46%。扫描电镜分析显示EHP-LRS3呈不规则的沟壑状结构。X-射线衍射分析表明EHP-LRS3的晶体结构呈现出不同于莲子淀粉A型晶体结构的B型晶体结构。EHP-LRS3对长双歧杆菌的促增殖能力优于压热法制备的RS3型抗性淀粉（HP-LRS3）。本研究采用TK-PUL与压热联合制备得到高得率的RS3型抗性淀粉（EHP-LR...     

N-糖基化对β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中异源表达的影响

为研究N-糖基化对里氏木霉β-甘露聚糖酶(β-mannanase,Man1)在毕赤酵母GS115中异源表达的影响,采用定点突变的方法,将Man1上3个N-糖基化修饰位点(N131、N158和N329)上的天冬酰胺用中性谷氨酰胺取代。结果发现,N-糖基化位点的突变对Man1的转录水平无明显影响,突变后获得的Man1表观分子质量有轻微下降,与Man1相比,3个突变体N131、N158和N329的甘露聚糖酶活力分别降低了85.43%和79.48%和16.3%;而热稳定性分别提高了7.87%、13.5%和15.37%。由此可见,N-糖基化修饰对于β-甘露聚糖酶的高效表达是必需的,其中N131和N158糖基化位点尤为重要,但是会稍微降低β-甘露聚糖酶的热稳定性。     

没食子酸对金线鱼鱼糜凝胶特性及其体外消化产物活性的影响

以金线鱼鱼糜为原料,添加没食子酸（gallic acid,GA）,通过二段加热法制备金线鱼鱼糜凝胶,考察GA添加量（0%～0.25%）对鱼糜凝胶特性、微观结构和分子间化学作用力的影响,进行体外模拟消化,研究体外消化产物的抗氧化活性和降胆固醇活性,探讨GA的添加对鱼糜凝胶功能活性的改善。结果表明,添加GA能改善鱼糜凝胶强度和质构特性,而对凝胶的白度不利。当GA添加量为0.15%时,鱼糜凝胶的质构特性最好,白度和持水性最高,凝胶的微观结构致密,维持凝胶的主要化学作用力是二硫键。体外消化结果显示,添加GA后,鱼糜凝胶的蛋白质体外消化率增加（P＜0.05）,消化产物的活性增强（P＜0.05）。当GA的添加量为0.15%时,鱼糜凝胶体外消化产物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、2,2′-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基清除率、羟自由基清除率均增加到80%（P＜0.05）,胆固醇酯酶抑制率增加到50.82%（P＜0.05）,胆固醇胶束化抑制率增加到41.88%（P＜0.05）,表明GA添加到鱼糜中经热处理和体外消化后仍保留了自身的生物活性。因此,适量没食子酸的添加能有效改善金线鱼鱼糜的热凝胶性能且能保留其功能活性,为新型功能性鱼糜制品的开发提供一定参考。     

溴酸钾氧化二甲基黄动力学光度法测定食品中的痕量硒

基于0．004mol／L的HN03介质中，在乳化剂OP存在时，痕量硒催化溴酸钾氧化二甲基黄的褪色反应，建立了测定痕量硒的催化光度法。方法检出限为0．015μg／L，线性范围为0～0．8μg／L。加标回收率为98．0％～102.5％，样品测定的相对标准偏差（RSD）为2．6％～4．3％。用于测定食品中的痕量硒,结果满意。     

粗粮速食米替代高脂饮食对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响

粗粮速食米（instant rice with added coarse grain,IR/CG）是一种新型的粗粮制品,既具有自热米饭食用方便的特点,又具有粗粮谷物的营养价值,但其产生的健康影响并不明确,因此本研究通过高脂饮食（high fat diet,HFD）联合链脲佐菌素腹腔注射诱导小鼠产生糖尿病,探究IR/CG对2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）小鼠糖脂代谢的作用。通过IR/CG与高脂饲料不同比例混合制备小鼠饲料,低、中、高剂量（25%（质量分数,下同）、50%、75% IR/CG）饲料以及100% IR/CG饲料分别记作IR/CG-L、IR/CG-M、IR/CG-H及IR/CG,利用上述饲料喂养小鼠,并与基础饲料、高脂饲料喂养的小鼠（分别记作Control、Model组）进行生理、生化指标等的比较。在饮食干预期间测定小鼠体质量、空腹血糖浓度、摄食量及葡萄糖耐量;IR/CG饮食干预4 周后,计算小鼠脏器系数,对小鼠肝脏、胰腺进行苏木精-伊红染色,测定小鼠空腹胰岛素水平、血糖血脂相关指标,并测定小鼠促炎细胞因子水平。结果显示,IR/CG的摄入能够不同程度改善T2DM小鼠高血糖血脂水平,其中IR/CG-H、IR/CG组改善效果较为显著。此外,IR/CG-H、IR/CG能够显著改善小鼠胰岛素抵抗现象,减少胰岛素分泌、降低胰高血糖素及糖基化血红蛋白水平,减轻小鼠炎症状态。通过对肝脏、胰腺的脏器指数及病理学切片分析发现,IR/CG干预能够有效减轻小鼠肝脂肪变性,部分恢复胰岛结构。上述结果表明IR/CG替代HFD对T2DM小鼠具有显著的调节血糖血脂作用,本研究能为粗粮自热米饭产品及粗粮功能性食品的开发提供理论依据。