常温常压等离子体诱变选育高产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）23798为原始菌株,对其进行常温常压等离子体（ARTP）诱变,以磺胺胍抗性和氨基酸与茚三酮特异显色为筛选标记,以期得到高产L-异亮氨酸的诱变谷氨酸棒杆菌,并对其遗传稳定性进行研究。结果表明,原始菌株23798经过ARTP诱变处理180 s后,经0.4 mg/mL磺胺胍抗性筛选、多孔板高通量筛选、发酵培养复筛,选育出一株高产L-异亮氨酸诱变谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）B1。该菌株在摇瓶中发酵培养48 h,L-异亮氨酸产量达18.5 g/L,比原始菌株提高62.03%,且遗传性状稳定。     

L-异亮氨酸产生菌的代谢改造与发酵控制策略

L-异亮氨酸是人体必须氨基酸,广泛应用于医药、食品、化妆品等领域.本文综述了谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌合成L-异亮氨酸的调控机制,重点阐述了代谢工程技术在L-异亮氨酸产生菌改造中的应用,并讨论了L-异亮氨酸发酵中的主要影响因素.     

增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成L-异亮氨酸的影响（英文）

该实验考察和比较增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成L-异亮氨酸的影响。通过以L-异亮氨酸生产菌Corynebacterium glutamicum YI为出发菌株,分别采用基因组整合和质粒的方式过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc及丙酮酸羧化酶编码基因pyc。结果表明,获得pyc基因组整合和质粒过表达菌株ILE01和ILE02,摇瓶条件下菌株L-异亮氨酸产量分别提高17.3%(6.1 g/L)和9.6%(5.7 g/L)、发酵罐条件下分别提高11.7%(24.8 g/L)和8.1%(24.0 g/L)。获得ppc基因组整合和质粒过表达菌株ILE03和ILE04,摇瓶条件下菌株L-异亮氨酸产量分别提高30.8%(6.8 g/L)和13.5%(5.9 g/L)、发酵罐条件下分别提高15.8%(25.7 g/L)和9.5%(24.3 g/L)。此外,过表达pyc和ppc还可不同程度地提高L-异亮氨酸转化率。然而采用质粒过表达pyc和ppc均使得菌株生物量下降。因此,过表达pyc和ppc均能显著提高L-异亮氨酸产量和转化率,基因组整合的过表达方式效果优于质粒过表达。该研究首次比较并报道了增强谷氨酸棒杆菌回补途径对谷氨酸棒杆菌生产L-异亮氨酸的影响,可为其代谢工程改造提供参考。     

谷氨酸棒状杆菌合成L-高丝氨酸的代谢改造与发酵条件探究

目的:本研究以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032为底盘细胞,构建1株L-高丝氨酸合成菌株并分析溶氧环境对其产物合成的影响。方法:首先通过外源添加0～40 g/L的L-高丝氨酸分析谷氨酸棒状杆菌的产物耐受性;随后,通过基因thrB敲除阻断L-高丝氨酸的降解途径,获得谷氨酸棒状杆菌重组菌H1;在此基础上利用挡板摇瓶进行细胞培养以增强发酵过程中氧气供给能力。结果:与大肠杆菌相比,谷氨酸棒状杆菌对L-高丝氨酸具有更强耐受性。研究中通过敲除基因thrB构建了L-苏氨酸缺陷型谷氨酸棒状杆菌重组菌H1,发现基础培养基中加入0.5 g/L的L-苏氨酸后,该重组菌生长恢复正常水平。挡板摇瓶条件下重组菌H1的L-高丝氨酸产量增加至836.7 mg/L,较普通摇瓶产量44.6 mg/L提高了17.76倍。结论:通过阻断L-苏氨酸的合成,成功构建L-高丝氨酸合成菌株谷氨酸棒状杆菌H1,并且发现利用挡板摇瓶增强发酵过程中供氧能力是促进谷氨酸棒状杆菌高效合成L-高丝氨酸的有效手段,为后续提高L-高丝氨酸发酵产量提供了参考。     

L-异亮氨酸高产菌种的选育研究

以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)为出发菌株,利用低能氮离子束注入对其进行多次诱变,结合异亮氨酸氧肟酸盐(Ile Hx)等氨基酸结构类似物定向筛选,得到一株稳定的高产L-异亮氨酸菌株:摇瓶培养72 h,产酸可达21~22 g/L,在50 L发酵罐上发酵51 h,产酸可达32 g/L。     

高产L-精氨酸谷氨酸棒状杆菌的构建

以产L-精氨酸诱变菌株谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）AJC为出发菌株,采用基因组编辑技术对其进行改造。 首先,敲除阻遏蛋白ArgR和FarR,解除反馈阻遏作用;然后,敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh和整合鸟氨酸乙酰转移酶编码基因argJ,阻 断乳酸合成途径和增加前体物;最后,敲除谷氨酸分泌蛋白编码基因NCgl1221和整合乙酰谷氨酸激酶基因argB,减弱L-谷氨酸的胞 外分泌,筛选一株L-精氨酸高产菌株。 结果表明,获得一株高产L-精氨酸菌株AJC-4（C. glutamicum AJCΔargRΔfarRΔldh::PtufargJ ΔNCgl1221::PsodargB）,该菌株在5 L发酵罐中发酵64 h后,L-精氨酸产量和糖酸转化率分别为78.0 g/L和0.38 g/g,较出发菌株AJC分 别提高21.9%、18.8%;副产物乳酸和L-谷氨酸积累量分别为0.11g/L、0.16 g/L,较出发菌株AJC分别降低96.8%、96.1%。     

生物素对L-缬氨酸发酵的影响

为研究生物素添加量对谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamate）发酵生产L-缬氨酸的影响,以谷氨酸棒状杆菌XV0505（Leu－＋Ile－＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）为供试菌株,考察不同生物素添加量条件下菌体量、耗糖、产酸以及副产物L-丙氨酸的情况,确定了生物素最适添加量为50 μg/L;利用膜偶联透析发酵方式有效解除了发酵生产过程中产生的反馈抑制现象,降低了副产物的产量,提高了L-缬氨酸的转化率及产量。与原单批次发酵的工艺相比,新工艺的最终L-缬氨酸总量达到106.1 g/L,产量提高了47.4%,糖酸转化率提高到34.5%。     

基因敲除降低L-缬氨酸发酵中亮氨酸和异亮氨酸含量的研究

黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)是L-缬氨酸生产的重要菌株,但缬氨酸发酵中常出现亮氨酸、异亮氨酸含量超标的问题.本研究敲除编码黄色短杆菌亮氨酸和异亮氨酸合成的关键基因,自主构建得到了工程菌株MH-1000-△ilvA、MH-1000-△leuA和MH-1000-△ilvA△leuA.对这些工程菌株进行摇瓶发酵和50 L罐发酵,结果表明,工程菌株有效地降低了L-缬氨酸发酵液中L-亮氨酸和L-异亮氨酸的含量,对于缬氨酸的高纯度生产具有一定的实际意义.     

谷氨酸高产菌GDK-9的定向选育及其发酵过程研究

以天津短杆菌GDK6为出发菌株,通过原生质体紫外诱变、紫外诱变和硫酸二乙酯(DES)诱变定向选育L-谷氨酸生产菌。经摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代,最终筛选出1株L-谷氨酸高产菌GDK-9。该菌株在未优化条件下摇瓶发酵42h产L-谷氨酸79.2g/L。另外,试验结果证实GDK-9菌株的遗传标记和产酸能力十分稳定。在优化条件下,通过7L罐发酵32h,谷氨酸产量达131.5g/L,糖酸转化率达到62.2%。     

1dhA基因敲除对Corynebacterium glutamicum TCCC11822 发酵生产L-谷氨酸的影响

针对L-谷氨酸发酵过程中乳酸产量偏高的问题,以L-谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌（Corynebactenum glutamicum） TCCC 11822为出发菌株,通过构建敲除质粒pK18mobsacB△1dh并采用同源重组技术敲除其乳酸脱氢酶编码基因1dhA,以期达到减少副产物、提高L-谷氨酸产量和转化率的目的.结果表明,与出发菌株相比1dhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6％,L-谷氨酸的产量和转化率分别提高7.6％和5.5％,但生物量略有下降.本研究可为L-谷氨酸及其他氨基酸生产菌株的理性改造提供参考.     

微生物发酵法生产L-异亮氨酸的研究进展

L-异亮氨酸作为三大支链氨基酸之一,在食品、牲畜饲料和医药等领域都有广泛应用。微生物发酵法是目前生产L-异亮氨酸最主要的方法,选育优良的生产菌种和优化发酵控制工艺有助于提高L-异亮氨酸的产量。该文对L-异亮氨酸的生物合成途径及代谢调控机制、L-异亮氨酸产生菌的选育现状以及发酵控制工艺进行了系统综述,为后续利用微生物发酵法生产L-异亮氨酸的生产研究提供了参考。     

葡萄糖亚适量流加对谷氨酸棒杆菌产L-异亮氨酸的影响

通过动态调节葡萄糖对谷氨酸棒杆菌的供应速率,解决菌种在发酵产L-异亮氨酸不同时期对葡萄糖消耗能力差异的问题。实验结果表明,以谷氨酸棒杆菌YILM1504为供试菌株,在发酵初始葡萄糖添加量80 g/L、90%最大补糖速率的亚适量补糖工艺下,得到动态补糖速率为0（0～8 h）、5.40～7.47（8～14 h）、7.47～7.00（16～24 h）、7.00～5.20 g/（L·h）（24～40 h）,L-异亮氨酸达到44.32 g/L,糖酸转化率为19.63%。经代谢流对比分析发现,葡萄糖经戊糖磷酸途径和糖酵解途径代谢流之比为0.56,进入Ile的代谢流增强了18.92%,进入缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸的代谢流减弱了67.12%、72.21%、30.23%,该方法针对谷氨酸棒杆菌在细胞生长阶段与产酸阶段不同的耗糖能力,提供了精细的补糖速率策略,产酸高峰期明显延长,副产物积累比例得到降低,原料利用率大幅提升。     

全营养流加对谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸的影响

在谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸的过程中,发酵后期菌体活力变弱,副产物增多,是限制L-异亮氨酸产业化的主要因素。研究通过3个阶段全营养流加策略探究最适发酵条件。首先,为解决L-异亮氨酸发酵中后期菌种活力下降的问题,实验通过利用发酵中后期全营养培养基流加策略,使得L-异亮氨酸达到了33.0 g/L。其次,为了解决初始发酵培养基高营养抑制问题,采用低浓度初始发酵培养基偶联发酵过程流加全营养控制策略,L-异亮氨酸达到了36.8 g/L。最后,由于玉米浆的高用量造成发酵染菌、起泡过多及后提取困难等产生的问题,通过清洁氮源丝肽粉等比例替换玉米浆全营养流加实验,使得副产物缬氨酸(valine,Val),亮氨酸(leucine,Leu),丙氨酸(alanine,Ala)分别降低到1.4、0.8、0.5 g/L,比初始降低了82.5%、86.7%和88.9%。通过上述3个阶段全营养流加策略,使得L-异亮氨酸产量提升的同时,副产物生成也得到有效的抑制。     

谷氨酸棒杆菌生产缬氨酸的代谢工程研究进展

L-缬氨酸是人体必需的三种支链氨基酸之一,在生命代谢过程中起着非常重要的作用,因此被广泛应用于食品、医药及饲料等行业。目前,L-缬氨酸主要采用微生物发酵法生产,而谷氨酸棒杆菌是最常用的生产菌种。作者分析了谷氨酸棒杆菌中L-缬氨酸的生物合成途径和代谢调控,综述了对其进行代谢工程改造来提高L-缬氨酸产量的最新研究进展。     

谷氨酸棒杆菌L-色氨酸营养缺陷型突变 及其高产菌株的选育

目的以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)HX-22为出发菌株,研究了目标发酵产物L-色氨酸合成途径交叉反馈抑制途径代谢突变与色氨酸分解代谢类似物抗性的营养缺陷型突变诱导过程及L-色氨酸高产复合突变菌株的筛选。方法采用硫酸二乙酯、紫外线、钴60γ-射线等诱变方法交叉处理起始与突变菌株,通过营养缺陷表型和自杀代谢底物抗性的筛选方法,定向突变和选育L-色氨酸合成与分解代谢突变的色氨酸高产菌株。结果通过多次连续营养缺陷型诱变选育,筛选出一株具有分支酸-Trp/Phe/Tyr代谢途径L-Phe和L-Tyr合成缺陷型和L-Trp分解代谢自杀代谢底物抗性的L-色氨酸高产菌HX22-118(ΔPhe~--ΔTyr~--5FT~r-4FP~r-SG~r);通过连续传代10次发酵,色氨酸产酸最高达到28.4 g/L,平均27.1g/L,较出发菌株HX22产酸水平提高81.8%。结论选育出的高产菌株具有多重代谢途径突变(ΔPhe~--ΔTyr~--5FT~r-4FP~r-SG~r),突变体具有良好的遗传稳定性,具有后续工业化生产应用潜力。     

直接发酵法生产L-丝氨酸高产菌株的选育

为了解除高浓度L-丝氨酸对3-磷酸甘油酸脱氢酶的反馈抑制,进一步提高L-丝氨酸的产量,以一株能直接利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌SYPS-062-36为出发菌,经硫酸二乙酯逐级诱变处理,在D-丝氨酸抗性梯度平板上挑取正突变株,获得一株遗传性能稳定的高产菌株SYPS-062-33a-18,其可积累L-丝氨酸(11.0±0.25)g/L,较出发菌L-丝氨酸产量(6.65±0.23)g/L提高了65.4%。说明本研究不仅以D-丝氨酸作为抗性平板筛选得到高产L-丝氨酸的突变株,而且为下一步进行反向代谢工程的研究提供了良好的实验材料。     

Innovative metabolic pathway design for efficient l-glutamate production by suppressing CO2 emission

In the pathway of L-glutamic acid (L-Glu) biosynthesis in Corynebacterium glutamicum, 1 mol of L-Glu is synthesized from 1 mol of glucose at a cost of 1 mol of carbon dioxide (CO(2)), with a maximum theoretical yield of 81.7% by weight. We have designed an innovative pathway for efficient L-Glu production employing phosphoketolase (PKT) to bypass the CO(2)-releasing pyruvate dehydrogenase reaction, thereby increasing the maximum theoretical yield of L-Glu from glucose to up to 98.0% by weight (120% mol/mol L-Glu produced/glucose consumed). The xfp gene encoding PKT was cloned from Bifidobacterium animalis and overexpressed under the strong cspB promoter in C. glutamicum. A functional enzyme was detected in an L-Glu-producing strain of C. glutamicum (odhA). When cells of this producer strain with the xfp gene and those without the xfp gene were cultivated in a controlled fermentation system, the L-Glu production yield of the strain expressing the xfp gene was much higher than that of the original strain, coupled with the suppression of CO(2) emission. Consequently, we could successfully enhance L-glutamate production by installing the PKT pathway of B. animalis into C. glutamicuml-Glu metabolism, and this novel metabolic design will be able to increase L-Glu production yield beyond the maximum theoretical yield obtained from the conventional metabolic pathway of biosynthesis from glucose.