芋头水溶性多糖的分离纯化及其对巨噬细胞免疫活性功能的影响

为探究芋头水溶性多糖的免疫活性功能,本文用DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析对由水提醇沉的方法得到芋头水溶性粗多糖进行分离纯化,并利用Sephadex G-200凝胶柱层析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和傅里叶红外光谱分析其组成结构。再通过CCK-8试剂法、中性红吞噬实验、Griess法和酶联免疫吸附法测定其对巨噬细胞RAW264.7的增殖活性、吞噬能力以及分泌NO和细胞因子能力的影响。结果表明,得到的两种芋头水溶性多糖TPS₁和TPS₂纯度分别为87.4%和81.5%。TPS₁主要成分为含有甘露糖的α型中性多糖,TPS₂主要成分为含有硫酸基团的β型吡喃酸性多糖。细胞实验表明TPS₁和TPS₂在25~400 μg/mL浓度范围内对RAW264.7无毒害作用。其中,TPS₁能够显著提高该细胞的中性红吞噬能力(P<0.05),吞噬指数最大可达到空白对照组的2.07倍;TPS₂则具有更强的促进NO、细胞因子分泌的作用。TPS₁和TPS₂作用下的NO分泌量分别为空白对照组的3.07倍和4.57倍,TNF-α的分泌量为空白对照组的3.04倍和3.76倍,IL-1β的分泌量为空白对照组的1.37和1.54倍。以上结果表明,TPS₁和TPS₂均具有免疫调节的功能,有望进一步开发作为免疫调节剂添加到食品中。     

青蛤酶解多肽对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用

研究酶解法制备的青蛤多肽（Cyclina sinensis peptides,CSP）对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用。以RAW264.7巨噬细胞相对增殖率为指标,选用胃蛋白酶对青蛤肉进行酶解,酶解液经超滤、冷冻干燥后,采用噻唑蓝（methyl thiazolyltetrazolium,MTT）法筛选出增殖活性最高的组分进行免疫调节作用研究。采用MTT细胞增殖实验、倒置显微镜观察、中性红吞噬实验、硝酸根还原酶法及酶联免疫吸附检测法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定CSP-5对RAW264.7巨噬细胞的生长与增殖、细胞形态、吞噬能力、一氧化氮（nitric oxide,NO）分泌能力及细胞因子白介素（interleukin,IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）分泌能力的影响;同时还研究了CSP-5对巨噬细胞各周期分布的影响。结果表明,分子质量小于3 kDa的CSP-5对RAW264.7细胞的生长与增殖具有明显的促进作用,且主要作用于G0/G1期,对细胞吞噬能力、NO分泌能力和细胞因子分泌能力的提高具有显著的促进效果;形态学观察结果显示经CSP-5作用后巨噬细胞体积变大且长出较多伪足。由此可知,CSP-5具有激活巨噬细胞增强机体免疫力的潜在作用。     

毛蕊花糖对巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用的研究

目的：明确毛蕊花糖对巨噬细胞RAW264.7免疫功能的调节作用。方法：分别以质量浓度25、50、100、200、400μg/mL的毛蕊花糖对RAW264.7巨噬细胞进行培养,以10μg/mL的脂多糖(LPS)为阳性对照组、不加任何样品的培养基为空白对照组。通过噻唑蓝(MTT)实验、吞噬中性红实验、NO释放量测定及酶联免疫吸附法测定细胞因子(IL-6、IL-1β、IFN-α、IFN-γ)的分泌量,评价毛蕊花糖的免疫调节作用。结果：质量浓度为25～400μg/mL的毛蕊花糖对巨噬细胞RAW264.7作用24h后,可显著提高巨噬细胞的增殖活性、吞噬活性、NO释放量以及细胞因子的分泌水平,并且毛蕊花糖溶液质量浓度为200μg/mL时效果最好。结论：毛蕊花糖对小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7具有免疫调节活性,是一种良好的免疫增强剂。     

阿里红多糖组分对RAW264.7巨噬细胞免疫功能的影响

目的研究阿里红多糖(Fomes Officinals polysaccharide,FOPS)及其组分FOPS-a、FOPS-b对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用。方法以小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究对象,不同浓度(50~1600μg/m L)FOPS、FOPS-a、FOPS-b干预后,用cck-8试剂盒测定细胞活力,中性红法测定其吞噬活性,NO试剂盒测定NO的含量,ELISA试剂盒测定TNF-α和IL-1β释放能力。结果 FOPS、FOPS-a、FOPS-b在一定的浓度范围内可以提高RAW264.7巨噬细胞的增殖活性、吞噬活性、一氧化氮以及TNF-α、IL-1β的释放量。结论 FOPS、FOPS-a、FOPS-b一定浓度范围内具有良好的增强RAW264.7巨噬细胞免疫功能的作用。     

轮叶党参粗多糖对体外培养小鼠脾淋巴细胞及RAW 264.7细胞的免疫活性

目的:研究轮叶党参多糖对小鼠脾淋巴细胞及巨噬细胞(RAW 264.7)作用以探究其免疫增强的功效。方法:浓度为1000,500,250,125 μg/mL多糖体外分别与脾脏细胞、RAW 264.7共培养,采用ELISA法检测细胞上清中细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-6和TNF-α浓度的变化。采用MTT法,研究轮叶党参粗多糖对RAW 264.7增殖的影响。Griess法测定细胞上清液中NO的含量变化。通过RT-PCR法检测iNOS mRNA的生成情况。结果:与正常组相比,轮叶党参粗多糖组IL-2、IFN-γ、IL-6、TNF-α和NO的分泌量极显著增加(p<0.01),显著促进RAW 264.7增殖(p<0.05)。与正常组比较,iNOS mRNA明显增加。结论:轮叶党参粗多糖可与ConA协同增强T细胞活性,也可参与活化单核-巨噬细胞对特异性免疫与非特异性免疫活性起到正向调节的作用。     

红松松仁多糖对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用

目的:探讨红松松仁多糖PNP40c-1对脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用及可能机制。方法:以LPS刺激RAW264.7细胞诱导炎症模型,分别采用MTT法、比色法、酶联免疫法、RT-PCR和Western Blot等方法,比较LPS诱导前后巨噬细胞的细胞活力、吞噬能力、一氧化氮(nitric oxide,NO)/一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,iNOS)和细胞因子表达的变化;同时对Nrf2/HO-1信号通路中关键蛋白核因子E2相关因子2(nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2 protein,Nrf2)和血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的mRNA和蛋白表达水平进行研究,以探讨PNP40c-1的具体作用机制。结果:在LPS诱导RAW264.7细胞的炎症反应中,PNP40c-1以剂量依赖性显著提高巨噬细胞的吞噬能力(P<0.05),抑制LPS诱导的NO和iNOS过量表达;PNP40c-1还可通过Nrf2/HO-1信号通路调节炎症因子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(IL-6)的分泌,缓解炎症反应。结论:红松松仁多糖PNP40c-1对LPS诱导的炎症反应具有一定的抑制作用,其作用机制与调节Nrf2/HO-1信号通路有关。     

大粒车前子多糖对脂多糖刺激RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用

采用脂多糖构建RAW264.7巨噬细胞炎症模型,研究大粒车前子多糖的抗炎作用。培养巨噬细胞RAW264.7,利用脂多糖构建细胞炎症模型,中性红吞噬实验检测细胞吞噬活性;酶联免疫吸附法检测车前子精制多糖（Plantago asiatica L. crude polysaccharide,PLCP）处理前后细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosisfactor-α,TNF-α）、白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）和IL-6的分泌量,Griess反应测定RAW264.7细胞释放NO水平。结果表明,PLCP可显著抑制RAW264.7炎症细胞的吞噬活性,降低炎症细胞因子TNF-α、IL-10和IL-6的分泌量及NO的释放量。     

蛹虫草多糖调节小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫活性的分子机制

多种真菌多糖近年来因其免疫调节活性成为保健食品领域研究的热点。本实验以食药用真菌蛹虫草提取物蛹虫草多糖（Cordyceps militaris polysaccharides,CMP）为研究材料,初步探究CMP对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫活性的调节机制。噻唑蓝实验结果显示CMP无细胞毒性,且100、200 μg/mL CMP可以明显增强RAW264.7细胞活性;中性红法、Griess法和酶联免疫吸附检测结果表明25～200 μg/mL的CMP以剂量依赖方式增强RAW264.7细胞吞噬活性并增加一氧化氮（nitric oxide,NO）和白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）分泌,肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的分泌呈先升高后降低的趋势,在100 μg/mL时达到最高值;抑制剂中和实验结果显示当Toll样受体4（Toll-like receptors 4,TLR4）和甘露糖受体（mannose receptor,MR）受到抑制时,CMP诱导的RAW264.7免疫反应显著降低,这表明TLR4和MR均为CMP激活巨噬细胞的受体;此外,Western blot结果显示丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）信号通路也参与CMP诱导的RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β。表明TLR4和MR/MAPK信号传导途径在CMP诱导巨噬细胞RAW264.7产生免疫应答时发挥了重要作用。     

兜唇石斛发酵多肽Asp-Asp-Asp-Tyr和Asp-Tyr- Asp-Asp对LPS诱导RAW264.7细胞的抗炎作用

为了研究兜唇石斛发酵多肽Asp-Asp-Asp-Tyr（DDDY）、Asp-Tyr-Asp-Asp（DYDD）对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞抗炎活性。以合成的兜唇石斛发酵多肽为研究对象,采用噻唑蓝法筛选增殖活性最高的发酵多肽浓度,通过中性红吞噬实验和倒置显微镜观察发酵多肽对细胞的吞噬作用和分化形态变化,使用ELISA试剂盒测定细胞中NO及细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子TNF-α的分泌量。结果表明：12.5、25、50和100 μg/mL四组质量浓度的发酵多肽对细胞无毒性并有增殖作用;100 μg/mL的DDDY和DYDD和1 μg/mL的LPS处理可以激活细胞,增强细胞吞噬能力,相对吞噬率为2.05%、1.97%和2.19%;构建LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型,发现两种发酵多肽处理有效抑制细胞分化,使细胞恢复正常形态;抑制细胞NO分泌能力,100 μg/mL DDDY和DYDD处理组的NO分泌能力降低到LPS组的0.41倍和0.49倍;并且对抑炎细胞因子分泌能力的提高和促炎细胞因子的降低有显著效果,均表现出剂量反应关系。由此可知,DDDY和DYDD对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应具有抗炎作用,为后面探究发酵多肽的炎症机制提供理论支持。     

硒化低聚氨基多糖对RAW264.7细胞的免疫调节作用

本实验旨在研究硒化低聚氨基多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫功能的影响。用噻唑蓝比色法分别考 察硒化低聚氨基多糖、Na2SeO3对巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响,并观察巨噬细胞形态的变化。通过中性红 法、酶联免疫吸附测定法及实时荧光定量反转录聚合酶链式反应法分别检测巨噬细胞的吞噬能力、肿瘤坏死因子 （tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素（interleukin,IL）-6及IL-10细胞因子的分泌量及其mRNA表达水平。 结果表明：硒质量浓度为100～1 000 μg/L时,硒化低聚氨基多糖对细胞的相对增殖率无显著影响;而Na2SeO3的硒 质量浓度超过200 μg/L即对巨噬细胞RAW264.7产生细胞毒性作用。硒化低聚氨基多糖能增强巨噬细胞吞噬活性, 显著提高RAW264.7细胞TNF-α、IL-6及IL-10分泌量及其mRNA表达水平,且效果比Na2SeO3处理组、低聚氨基多糖 处理组及Na2SeO3＋低聚氨基多糖复合添加组好。实验结果提示硒化低聚氨基多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7具有一 定的免疫调节作用。     

体外评估乳杆菌对巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用的影响

该研究以商业菌株鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG为阳性对照菌,体外评估实验室保藏的5株乳杆菌对巨噬细胞RAW264.7细胞活性、吞噬活性及免疫活性分子NO、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与白细胞介素-10（IL-10）分泌水平的影响,以期从中筛选出具良好免疫调节作用的菌株。结果表明,鼠李糖乳杆菌260具有更优的免疫调节作用,在特定乳杆菌活菌浓度时,能显著提高巨噬细胞RAW264.7的细胞活性、吞噬活性及NO、TNF-α和IL-10的分泌水平（P＜0.05）。最高细胞增殖率为196.62%;最低乳酸脱氢酶（LDH）释放量为554.36 U/100 mL;最高吞噬活性为136.86%;最高NO分泌量为5.70 μmol/L;最高IL-10分泌量为15.56 pg/mL,最高TNF-α分泌量为50.98 pg/mL。     

野生亚侧耳多糖的提取和对巨噬细胞Raw264.7的免疫调节作用研究

本研究从亚侧耳子实体中分离出水溶性亚侧耳多糖(HSP),通过体外实验评估其对Raw264.7巨噬细胞的免疫调节作用。采用WST-1法检测HSP对巨噬细胞增殖作用的影响,Griess试剂检测一氧化氮(NO)浓度,ELISA法检测HSP对淋巴细胞中一肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和前列腺素E2(prostaglandins E2,PGE₂)等细胞因子分泌量的影响,反转录聚合酶链式反应分析诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶-2(COX-2)、白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α和IL-1β的转录水平表达量。结果表明,HSP可显著提高Raw264.7细胞内NO的浓度,在HSP浓度为100.00 μg/mL时,NO的分泌量达到最大值(29.94 mmol/L)。与空白组相比,HSP可以显著提高TNF-α、IL-1β、PGE₂等免疫因子(P<0.05)的分泌量,其中IL-1β、PGE₂的25 μg/mL剂量组中各因子分泌量(31.9524 pg/mL,1.8174 ng/mL)均与LPS(脂多糖)阳性对照组相接近。反转录聚合酶链式反应分析结果表明,HSP能够提高iNOS和COX-2的蛋白表达量。HSP具有免疫调节的功能,可以作为免疫调节剂添加到功能性食品和药品中。     

北五味子多糖对RAW264.7细胞的免疫调节作用

北五味子是我国传统中药材,近年来因其具有的护肝、安神等多种功效而得到了广泛地关注和研究。本实验提取北五味子多糖并超滤处理获得不同分子质量的多糖组分Sp1(100 ku)和Sp2(10~100 ku),分别按不同质量浓度对小鼠巨噬细胞系RAW264.7孵育处理,通过检测细胞增殖活性、吞噬能力、NO分泌水平及培养基中细胞因子(细胞白介素(interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α))的含量,并与脂多糖实验组进行对比,评价北五味子多糖在免疫调节方面的作用。结果显示,较低分子质量的Sp2组分活性较强,在500.00μg/m L以上时,可以对小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力、NO分泌水平、IL-1β和TNF-α含量有普遍的促进作用,显现出良好的免疫提高潜力,而较高分子质量的Sp1组分活性较弱。     

蒲公英糖蛋白体外抗炎作用及对NF-κB信号通路的调控

探讨蒲公英糖蛋白(glycoprotein from Taraxacum,TG)对由脂多糖引起的RAW264.7细胞炎症的抗炎效果,并阐明其活性的基本分子机制。利用脂多糖刺激RAW264.7细胞,建立体外炎症模型,采用噻唑蓝比色法检测TG对RAW264.7细胞的增殖毒性,Griess试剂法检测了一氧化氮(nitric oxide,NO)的分泌情况,反转录聚合酶链式反应检测炎症细胞因子——白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)m RNA以及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)m RNA的表达水平,酶联免疫吸附测定法测定IL-6和TNF-α的分泌量,Western blot检测P-IκB-α蛋白的表达水平,用以研究TG对核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号转导通路的抑制作用。结果表明:TG能够显著甚至极显著地抑制NO的分泌,IL-6、TNF-α、i NOS的m RNA的表达,IL-6和TNF-α的分泌(P0.05、P0.01)。TG高度显著上调了IκB-α的蛋白表达(P0.001),并显著下调了P-IκB-α的蛋白表达(P0.05),且与TG质量浓度成正比。其中在TG质量浓度为250、500、1 000μg/m L时对TNF-α分泌量的抑制率分别为28.6%、65.4%、89.3%,对IL-6分泌量的抑制率分别为32.3%、54.1%、85.7%。TG间接抑制了NF-κB信号转导途径,有显著的体外抗炎效果且抗炎效果与TG的质量浓度呈剂量依赖性。     

重组黑芝免疫调节蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7向M1型分化的影响

真菌免疫调节蛋白具有免疫调节和抗肿瘤功效。巨噬细胞在肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用,M1型巨噬细胞具有很强的肿瘤杀伤能力和抗原递呈能力。本研究通过真菌免疫调节蛋白在体外对小鼠巨噬细胞RAW264.7经典活化M1型的影响探究其抗肿瘤的作用机制。利用重组黑芝免疫调节蛋白（recombinant Ganoderma atrum immunomodulatory protein,rFIP-gat）干预RAW264.7细胞,用中性红吞噬实验测定细胞吞噬能力,一氧化氮（nitric oxide,NO）检测试剂盒测定NO浓度,采用实时荧光定量聚合酶链式反应测定肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）的mRNA相对表达量。结果表明,rFIP-gat以剂量依赖的方式增强RAW264.7细胞的吞噬能力,促进其产生NO,并提高iNOS和TNF-α基因的转录。因此,rFIP-gat可能具有诱导RAW264.7细胞向M1型巨噬细胞分化的作用。