微滴式数字聚合酶链式反应对香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量分析

为实现肉制品中动物源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）,以鸡的转化生长因子β-3基因、猪的朊蛋白基因和牛的生长激素基因为靶基因,建立香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量检测方法。结果表明：所建立ddPCR方法特异性强,能特异性检测相应的鸡、猪、牛源性成分;根据肉粉质量（mg）与DNA质量浓度（ng/μL）、DNA质量浓度（ng/μL）与基因拷贝数浓度（copies/μL）之间的线性关系,得到鸡肉粉、猪肉粉和牛肉粉质量（x1）与基因拷贝数浓度（ y 2） 之间的关系式为： 鸡：x1=（n*y2）/273.946 - n/886.557 + 0.216; 猪：x1=（n*y2）/64.950 + n/60.644 + 0.215; 牛：x1=（n*y2）/62.839 + n/12.646 + 1.218（n为稀释倍数）;基于建立的ddPCR方法对64 份市售不同种类香肠样品进行检测,在1 份原料标识仅为“猪肉”的香肠中检出鸡源性成分含量为18.68%。本研究建立的ddPCR方法能够实现香肠中鸡、猪、牛源性成分的准确定量检测,并可以此判断“蓄意掺假”或“无意带入”。     

肉制品中牛源性成分荧光定量聚合酶链式反应方法的建立与应用

为了能够快速准确检测出市场中掺假牛肉制品,采用Taq Man探针法,建立一种用于快速有效检测牛肉制品中牛源性成分的荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。选择Gen Bank中牛β-actin基因的保守序列,设计并合成特异性引物及Taq Man探针,以构建的p MD-18T-96-beef质粒为标准品,优化反应条件。结果表明:重组质粒标准品经PCR、测序和酶切鉴定正确,建立的标准曲线Ct值与模板拷贝数对数值之间呈良好的线性关系,相关系数为0.98,斜率为-3.345,敏感度为46.1 copies/μL。特异性实验表明,用该方法检测猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等非牛肉制品结果均为阴性。批内重复实验变异系数均小于0.98%,批间重复实验变异系数均小于0.33%,表明该方法重复性良好。用建立的荧光定量PCR方法与SN/T 2051—2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》同时对市场上40份牛肉加工品进行检测,结果显示,本方法检测有3份样品为牛源成分阴性,与SN/T 2051—2008方法检测结果相同。可见,本实验建立的荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于检测市场中肉类掺假的行为。     

一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品中猪源性成分含量测定

为了建立一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品猪源性成分含量测定方法,分别以猪线粒体DNA的NADH4基因和16S rRNA基因为靶位点设计猪特异性引物、探针和通用引物、探针,建立猪源性成分含量测定方法,通过特异性、灵敏性、线性、准确度及市售肉制品检测,对该方法体系进行检验和评价.结果表明:建立的猪源性成分含量实时荧光聚合酶链式反应测定方法体系具有良好的特异性及灵敏性,最低可检测到0.4pg/μL纯猪肉DNA;无论是猪特异性体系还是通用体系都呈现良好的线性关系(R2均达到0.999以上)和较宽的线性范围;通过含猪源性成分的模拟混合肉样检测,样品猪源性成分含量的回收率平均值为122.27％,说明该方法具有较高的准确度;通过市售肉制品检测表明该方法可以用来检测实际样品(包括生鲜样品和熟肉样品)中猪源性成分含量.     

应用微滴式数字聚合酶链式反应定量检测牛肉制品中的猪源性成分

参照GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光聚合酶链式反应法》,以牛的生长激素（growth hormone,GH）基因和猪的朊蛋白（prion protein,PRNP）基因2 种核基因为靶基因合成特异性引物和探针。理论推导单位质量牛肉的GH基因与猪肉PRNP基因拷贝数之比为一固定值,通过微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）方法对该固定值进行检测和验证,并以该固定值对牛肉/猪肉人工混合样本和市售牛肉制品中的猪肉成分进行定量检测。结果表明：该方法具有良好的准确性及可重复性;牛肉中掺杂猪肉质量分数在5%～99%范围内时,检测结果绝对误差小于1.28%,变异系数小于6.5%,猪肉成分的回收率为99.09%～102.80%;20 份牛肉制品中,4 份检出猪肉成分,其中3 份的相对含量为29.19%～98.15%,1 份为0.12%（低于本方法检出限5%）。因此,ddPCR方法可以较好地应用于牛肉制品中掺杂猪肉成分的定量检测。     

一种羊乳粉的微滴式数字PCR定量分析方法

基于市场上对乳品溯源技术的迫切需求,以微滴式数字聚合酶链式反应技术对羊乳粉中的乳源进行准确判别。基因检测技术对判别乳源来源方面克服了成分复杂、检测时间长等的缺点,更加精准地针对本源进行检测,减少了误判的可能性。本实验以羊乳粉质量、DNA质量浓度及其拷贝数为实验指标,建立了以羊乳粉拷贝数与质量的关系式,准确地判断出羊乳粉的质量,其公式为M=（C－4.75）/3.56,其中,M代表羊乳粉的质量（mg）,C代表每微升的拷贝数（copies/μL）,该方法的建立对现有市场上的羊乳粉定量检测提供了新的方法和思路。     

基于微滴式数字聚合酶链式反应技术的肉制品中鸭源性成分的定量检测

为实现肉制品中鸭源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)技术,以鸭生长激素(growth hormone,GH)基因为靶基因,建立肉制品中鸭源性成分的定量检测方法.结果表明:所建立的ddPCR方法能特异性检测鸭源性...     

肉制品中牛源性成分的PCR-RFLP检测

根据牛线粒体DNA特异性片段设计出引物,应用PCR-RFLP技术检测出7种生肉和4种加工肉制品中的牛源性成分,并根据线粒体中Cytb保守序列设立内源参照基因检测DNA提取效率。方法简便、快速、适合实验室常规物种检测。     

基于实时荧光定量PCR和数字PCR的肉制品中牛源性成分检测

为了能够快速有效的检测出肉制品中牛源性成分,采用实时荧光定量PCR和数字PCR检测方法,检测肉制品中牛源成分。先依据牛肉单复制基因组特异区域,通过多序列比对设计特异性引物与探针,再利用苯酚-氯仿法提取标准品基因组DNA,确立实时荧光定量PCR和数字PCR两种方法的反应条件,测定DNA模版纯度及浓度可得实验提取的DNA溶液不含杂质,在此基础上构建牛源性成分荧光定量PCR标准曲线,检测两种方法的特异性、抗干扰性与肉制品中牛源性成分。分析实验结果可知,引物与探针在两种方法中均对牛肉有荧光信号显示,两种方法具有牛源性特异性,检测数值与实际样品数值基本一致,且两种方法抗干扰性较好,当存在其他肉类干扰时,仍可准确监测出牛源性,两种方法的最大误差分别为3.8%和4.0%;可定量检测不同肉制品中牛源性成分,两种方法均未检测出样品10牛肉丸中牛源性成分,验证了市面上确实存在假肉情况。说明所用方法能够准确、快速地检测出肉制品中的牛源性成分,适用于市场中肉制品的检测,对保障消费者的权益和健康具有十分重要的意义。     

肉制品中羊源性成分的定性和定量检测

通过检测肉制品中DNA的来源进行动物源性检测是打击鲜肉及加工肉制品制假掺假的重要技术手段。依据GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法》合成用于TaqMan 实时荧光聚合酶链式反应的引物和探针,利用鲜肉及加工肉制品进行羊源性成分定性和定量检测方法研究。首先利用12 种不同动物鲜肉组织的DNA检测方法的特异性,然后以羊源DNA梯度稀释液为模板进行灵敏度实验,最后在加工肉制品中检测方法的适用性和定量检测能力。结果表明：此方法具有羊源性成分检测特异性,对其他动物来源的鲜肉DNA均无扩增信号,可以检出羊肉和猪肉混合样品中0.1%的羊肉;方法灵敏度高,可以检出10 pg的羊源DNA;方法适用性广,可以对加工肉制品（羊肉干）进行羊源性成分的定性和定量检测。     

微滴式数字PCR对肉制品中羊肉和猪肉定量分析

为了实现肉制品中羊肉和猪肉的量化研究,本文应用微滴式数字PCR对肉制品进行定量检测。通过在看家基因上设计单拷贝特异性引物,能更好的鉴别是人为因素的掺假还是在加工过程中无意的带入。根据dd PCR的结果显示,在一定范围肉质量和DNA的浓度,DNA浓度和DNA拷贝数(C)成现一定的线性关系。通过人为掺假及市售样品检测以验证此方法。以DNA浓度作为中间换算值,得到肉质量和DNA拷贝数之间的换算关系M_羊=0.12C-10.6 M_猪=0.07C+4。通过对已知掺假比例的肉样及市售样品进行检测,能够较好的得到掺假肉的质量。目前市场上存在一定的掺假现象且该检测方法具有一定市场应用前景,本文建立的微滴式数字PCR在羊肉和猪肉及其制品中的掺假检测具有较强的应用潜力,对目前混乱的肉制品掺假的市场监管提供了科学的依据。     

微滴数字PCR法对肉制品中牛源和猪源成分的定量分析

为准确检测肉及肉制品中肉源成分的含量,实验基于微滴数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerasechain reaction,ddPCR）技术,建立了定量检测肉及肉制品中牛肉和猪肉含量的方法。由ddPCR结果可知,在一定范围内生鲜肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,并以DNA含量为中间值计算出DNA拷贝数（C）与生鲜肉质量之间的换算公式M牛=0.062C－0.943,M猪=0.045C－1.72。应用建立的数字ddPCR方法对已知目标肉种含量的混合肉样进行检测,结果表明测量值和真实值基本一致,且不受外源物种的干扰。通过对市售样品的检测,能够准确检测出不同样品中牛肉和猪肉的含量,并发现存在掺假现象,说明该检测方法具有良好的市场应用前景。本实验建立的ddPCR方法在肉及肉制品中牛肉和猪肉含量的定量检测方面具有较大的应用潜力,可为肉制品真伪鉴别日常检测提供有力的科学依据。     

多重微滴式数字PCR定量检测市售核桃乳中核桃、大豆源性成分

目的:为市售核桃乳中核桃源及主要掺杂物种大豆两种源性成分建立准确、快速定量检测方法。方法:从植物组织(核桃、大豆)或是植物蛋白饮料(核桃乳饮料)提取核酸后,主要采用多重微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,测算单位质量核桃和大豆的目的基因拷贝数比值,建立基因拷贝数与质量之间的关系,进而利用该比例关系换算出植物蛋白饮料中核桃和大豆的投料量,以实现对植物蛋白饮料中植物源性成分的定量检测。结果:基于多重微滴式数字PCR定量检测市售产品中大豆和核桃源性组分的方法,引物探针特异性好,目标物种间无交叉反应;灵敏度高,核桃中掺杂大豆的质量检测限为0.5%,相对误差为5.6%。将单一源性5种不同质量下靶基因拷贝数之比与5种不同比例混合源性靶基因拷贝数之比通过重复3次检测,综合比较并拟合后得到单位质量下拷贝数(C_(大豆)/C_(核桃)=1.771 1)的换算比例值。在从商品超市中抽取的11份不同品牌的核桃乳中(仅含核桃一种植物源成分),多重微滴式数字PCR方法检测显示:11份样品均检出核桃源性成分,6份样品检出大豆源性成分,其中4份样品中大豆与核桃质量之比高于10%,判断存在掺杂使假;2份样品大豆与核桃质量之比低于0.2%,极低的检出量推断为工艺沾染。结论:采用多重微滴式数字PCR准确、快速的定量方法可作为鉴别核桃乳中掺杂使假问题的有效手段。     

基于微滴数字PCR技术的婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌定量检测及应用

应用微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）技术,建立婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌定量检测方法。以双歧杆菌的单拷贝特异性基因rpsL为目标基因设计引物探针,对ddPCR条件进行优化,考察方法的特异性、灵敏度和重复性,并与平板计数方法进行对照验证。结果表明,建立的方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。细菌纯培养液的检出限为296 CFU/mL,模拟样品检出限为7 300 CFU/g,不与10 种近缘乳酸菌发生交叉反应,且重复性较好,采用已建立的ddPCR方法和平板计数方法对市售婴幼儿配方乳粉样品进行检测,2 种方法测定值结果偏差小于10%,结果一致性较好。本研究建立的ddPCR方法对婴幼儿配方乳粉中的双歧杆菌定量检测能够更快速、灵敏、准确,具有一定的应用前景。     

液滴数字PCR定量检测鸭血制品中掺假成分

鸭血制品作为市场常见商品,掺假现象十分严重。选取鸡、鸭、鹅基因组中的特异性单拷贝基因为靶基因,设计引物和探针,建立鸡、鸭、鹅血微滴数字PCR定量检测方法。使用人工混合样品对该方法的准确性进行验证,同时通过检测市售样品来验证方法的适用性。实验结果表明,样品含量在1~1000 μg/mg时,靶基因拷贝数与样品质量之间具有良好的线性关系,检测限和定量限分别为5 μg/mg和1 μg/mg。通过人工混合样品和市售样品检测证明,该方法具有良好的准确性和适用性,可用于对鸡、鸭、鹅血制品的定量检测。     

利用可视基因膜芯片技术与实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析肉制品中动物源性成分

为调查了解肉制品中动物源性成分,以帮助判别掺假情况,应用可视基因膜芯片检测技术对市售的肉松、香肠、肉卷、预制调理肉、肉干及肉脯等23份样品动物源性成分进行筛查分析,同时,针对筛查结果采用实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）法进一步确证。结果表明：可视基因膜芯片检测法与实时荧光定量PCR法检测结果一致,提高了未知样品的筛查效率;在本次随机分析的样品中,动物源性成分检测结果与标签标示不一致的情况占比高达21.7%,肉制品掺假虚标情况不容忽视。     

实时荧光聚合酶链式反应检测肉制品中的鸭源性成分

通过鸭的肌动蛋白β-actin保守基因设计可特异检测鸭肉成分的引物和探针,建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术检测鸭肉的方法,并通过模拟肉样和市售样品检测方法的准确性和适用性。结果表明：该方法可以特异性检测出麻鸭和草鸭成分,而对猪、牛、羊、鸡等DNA均没有扩增,检测灵敏度可达到1 pg DNA;通过模拟肉样检测确定最低质量分数检测限为0.01%;市售样品的检测结果表明,该方法能很好地应用于市场,满足市场检测需求。