一株海洋来源高效产角蛋白酶菌株的筛选、鉴定及其酶学性质研究

为获得高效产角蛋白酶的菌株,提高产酶能力,研究角蛋白酶酶学性质,该文从广西北部湾海鸭养殖羽毛废弃物土壤通过富集、初筛和复筛获得1株高效降解羽毛角蛋白的菌株Gxun-30,综合形态、生理生化和16S rDNA序列的系统进化分析结构,鉴定为拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)。该菌株产酶条件及所产酶学性质研究结果为,菌株产酶最适温度35℃,发酵48 h,整根羽毛几乎完全降解,酶活性可达434.54 U/mL;所产角蛋白酶最适温度为75℃,最适pH为6.5;该酶热稳定性较好,在70℃以下,能保持酶活的稳定性;金属离子中Ca²⁺、Na⁺对该酶活性起到激活作用,而Mn²⁺、Cu²⁺对该酶有显著抑制作用;酶活性可被苯甲基磺酰氟(phenyl methy sulfonyl fluoride,PMSF)和乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)抑制,表明可能为含金属离子的丝氨酸蛋白酶类;异丙醇对酶活性有明显激活作用,相对酶活性可提高至114%...     

小麦多酚氧化酶的分离纯化及酶学性质研究

为了减少多酚氧化酶(PPO)对产品所带来的负面影响,对从苏北红麦中提取的PPO粗提物进行分离纯化。经硫酸铵沉淀、DEAE阴离子交换层析和Superdex 200凝胶过滤层析,最终得到电泳纯化后只有一条条带的PPO,并对该纯化后的PPO进行酶学性质研究。试验结果为:纯化后PPO总酶活回收率为7.03%,纯化倍数22.35,比酶活为373.44 U/mg,电泳分析表明其相对分子质量约为30 000。测得其最适反应p H为6.5,最适反应温度为37℃;金属离子影响的研究表明,K~+、Na~+对其活性基本无影响,Ca~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)略有激活作用,Zn~(2+)、Cu2+激活作用较强;小麦PPO对邻苯二酚的K_m值为6.90 mmol/L,对焦性没食子酸(三酚类)、邻苯二酚(二酚类)底物亲和性较强,对单酚类(苯酚、愈创木酚)、二酚类(对苯二酚、间苯二酚)底物亲和性很低。     

产右旋糖酐酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

该研究从连云港海域海泥中筛选产右旋糖酐酶菌株,对其进行形态学观察、生理生化试验及分子生物学鉴定,并对其产右旋糖酐酶的酶学性质、酶解产物组分及抗氧化活性进行研究。结果表明,筛选得到一株产右旋糖酐酶菌株GN02,其被鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。菌株GN02产右旋糖酐酶的最适温度和pH分别为20 ℃和7.0,在25～40 ℃、pH 5.0～9.0范围具有良好的稳定性。酶解1 h的主要产物为异麦芽四糖（85.6%）和异麦芽三糖（14.3%）。酶解产物清除羟基自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和超氧阴离子自由基的半抑制浓度（IC50值）分别为0.42 mg/mL、2.98 mg/mL和11.54 mg/mL。     

产酸性纤维素酶细菌的筛选鉴定及其酶学性质

采用刚果红染色法进行初筛,3,5-二硝基水杨酸法进行复筛,从不同来源的土壤样品中筛选到了一株产纤维素酶活性较高的菌株,酶活达到39.20 U/mL,命名为XH-4.通过形态学观察、生理生化及分子生物学试验,初步确定该菌株为贝莱斯茅孢杆菌.对其产生的纤维素酶酶学性质研究表明:纤维素酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值...     

67.8ku丝瓜多酚氧化酶酶学性质的研究

目的:为对67.8ku丝瓜多酚氧化酶（PPO）的酶学性质进行研究。方法:从丝瓜中提取、纯化得67.8ku的丝瓜多酚氧化酶,并分别从温度、pH、作用底物、金属离子、抑制剂及表面活性剂对丝瓜PPO活性的影响等方面对丝瓜PPO的酶学性质进行研究。结果:结果表明,pH为6.0时相对酶活最高,pH3.0⁸.0酶活较稳定;其最适作用温度为30℃,对热稳定性较强,70℃保温120min后还具有40%的相对酶活;Co2+、K+、Ca2+等对酶有较强的激活作用,而Na+、Mg2+、Cu2+对酶有明显的抑制作用;抗坏血酸为该酶最好的抑制剂,其次为半胱氨酸、β-巯基乙醇、Na2S2O3、Na2SO3等;十二烷基肌氨酸钠（Laurouyl Sarcosine）、十二烷基硫酸钠（SDS）等对酶有一定的激活作用,而十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、吐温-20（Tween-20）对酶有抑制作用;与l-多巴（l-dopa）的结合力最强,以其为底物时该酶的Km为1.32mmol/L,Vmax为0.22OD475/min。结论:该研究确定了丝瓜多酚氧化酶的最适作用条件及其影响因素,可为控制丝瓜在贮藏、加工过程中的酶促褐变提供理论依据。      

67.8ku丝瓜多酚氧化酶酶学性质的研究

目的:为对67.8ku丝瓜多酚氧化酶(PPO)的酶学性质进行研究。方法:从丝瓜中提取、纯化得67.8ku的丝瓜多酚氧化酶,并分别从温度、pH、作用底物、金属离子、抑制剂及表面活性剂对丝瓜PPO活性的影响等方面对丝瓜PPO的酶学性质进行研究。结果:结果表明,pH为6.0时相对酶活最高,pH3.0~8.0酶活较稳定;其最适作用温度为30℃,对热稳定性较强,70℃保温120min后还具有40%的相对酶活;Co2+、K+、Ca2+等对酶有较强的激活作用,而Na+、Mg2+、Cu2+对酶有明显的抑制作用;抗坏血酸为该酶最好的抑制剂,其次为半胱氨酸、β-巯基乙醇、Na2S2O3、Na2SO3等;十二烷基肌氨酸钠(Laurouyl Sarcosine)、十二烷基硫酸钠(SDS)等对酶有一定的激活作用,而十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、吐温-20(Tween-20)对酶有抑制作用;与l-多巴(l-dopa)的结合力最强,以其为底物时该酶的Km为1.32mmol/L,Vmax为0.22OD475/min。结论:该研究确定了丝瓜多酚氧化酶的最适作用条件及其影响因素,可为控制丝瓜在贮藏、加工过程中的酶促褐变提供理论依据。     

八角莲多酚氧化酶的酶学性质

以邻苯二酚为底物,研究八角莲多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）粗提液的酶学特性。结果表明,底物邻苯二酚最适浓度为1.0 mol/L,八角莲PPO的最适pH值为7.0,最适温度为30 ℃,90 ℃高温处理10 min,八角莲PPO酶活力仅剩11.92%。PPO催化的酶促褐变反应符合米氏动力学方程,相应动力学参数Km和vmax分别为0.230 7 mol/L和769.23 U/min。抗坏血酸、甘氨酸、乙二胺四乙酸、柠檬酸对酶活性具有抑制作用,十二烷基硫酸钠表现出激活作用,亚硫酸氢钠对酶活性的抑制作用强于硫代硫酸钠,Al3+和Cu2+对酶活性具有一定的激活作用,Ca2+对酶活性有一定的抑制作用,Mg2+、Fe2+和Fe3+对酶活性影响不显著。     

一株酸性淀粉酶产生菌的分离鉴定及其酶学性质研究

用含有淀粉的选择培养基,通过透明圈法筛选到一株产酸性淀粉酶的菌株,其发酵液酶活力达到123U/mL。通过形态观察。生理生化实验和16S rDNA序列分析等方法初步鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌,命名为Bacillus lincheniformis BW-2。对其产生的淀粉酶的酶学性质进行分析发现,该菌株产生的淀粉酶最适反应温度为70℃;最适反应pH为4.5,同时具有较好的热稳定性和pH稳定性;Ca2+和Mg2+对该酶有激活作用,Mn2+和Cu2+对该酶有抑制作用,抑制剂PMSF（苯甲基磺酰氟）及DTT（二硫苏糖醇）对该酶活力影响较小。通过PAGE分析发现BW-2产生的淀粉酶与已知热稳定淀粉酶分子量或结构可能存在差异。Bacillus lincheniformis BW-2是一株具有研究开发潜力的产酸性淀粉酶的菌株。      

芋头多酚氧化酶的酶学性质研究

以邻苯二酚为底物,采用分光光度法研究了芋头多酚氧化酶(PPO)的酶学特性。结果表明:芋头PPO的最适温度pH为7.5,最适温度为40℃;90℃高温处理2 min,可使酶完全失活;PPO催化的酶促褐变反应符合米氏动力学方程,相应动力学参数Km=0.0221mol/L,Vmax=46.08 U/min;4种抑制剂对PPO活性均有不同程度的抑制作用,抑制效果由强到弱顺序为:抗坏血酸>亚硫酸氢钠>L-半胱氨酸>柠檬酸;金属离子Sn2+对PPO活性具有较强的抑制作用,A13+、Cu2+、Mg2+、Ca2+和Co2+对PPO活性有一定的抑制作用,Zn2+对PPO活性具有激活作用,Fe3+、Fe2+和Mn2+对PPO活性几乎没有影响。     

一株酸性淀粉酶产生菌的分离鉴定及其酶学性质研究

用含有淀粉的选择培养基,通过透明圈法筛选到一株产酸性淀粉酶的菌株,其发酵液酶活力达到123U/mL。通过形态观察。生理生化实验和16S rDNA序列分析等方法初步鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌,命名为Bacillus lincheniformis BW-2。对其产生的淀粉酶的酶学性质进行分析发现,该菌株产生的淀粉酶最适反应温度为70℃;最适反应pH为4.5,同时具有较好的热稳定性和pH稳定性;Ca2+和Mg2+对该酶有激活作用,Mn2+和Cu2+对该酶有抑制作用,抑制剂PMSF(苯甲基磺酰氟)及DTT(二硫苏糖醇)对该酶活力影响较小。通过PAGE分析发现BW-2产生的淀粉酶与已知热稳定淀粉酶分子量或结构可能存在差异。Bacillus lincheniformis BW-2是一株具有研究开发潜力的产酸性淀粉酶的菌株。     

产胞外葡萄糖氧化酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质初步研究

乳酸脱氢酶（LDH）是乳酸生成途径中的关键酶,敲除乳酸脱氢酶基因,理论上可以减少甚至消除乳酸的产生,提高2,3-丁二醇的产量和得率。该研究采用体外拼接方式构建乳酸脱氢酶基因的同源线性片段ldhL-Cmr-ldhR,将其电转化至Klebisella oxytoca HD79中,通过Red同源重组技术筛选敲除成功的重组菌株,经聚合酶链式反应（PCR）、荧光定量-聚合酶链式反应（FQ-PCR）及2,3-丁二醇产量检测验证。结果表明,重组菌株2,3-丁二醇产量为40.20 g/L、转化率为0.38 g/g和生产强度为0.48 g/（L·h）,相比供试菌株分别提高了26.8%、11.8%和45.5%;而乳酸产量则由4.83 g/L下降至2.45 g/L,相比供试菌株降低了49.3%。该实验为后续进一步提高2,3-丁二醇的产量和扩大菌株选择范围奠定基础。     

海洋低温肌氨酸氧化酶生产菌株的筛选、鉴定及酶学特性研究

为获得更适应低温环境的产肌氨酸氧化酶菌株,该研究从渤海海泥中分离、筛选高产低温肌氨酸氧化酶菌株,采用形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行鉴定,并对其所产的肌氨酸氧化酶的酶学特性进行初步研究。结果表明,共分离到产肌氨酸氧化酶的菌株8株,其中菌株LYH18的肌氨酸氧化酶活力最高,为1.65 U/mL;菌株LYH18被鉴定为海泥芽孢杆菌（Bacillus oceanisediminis）;肌氨酸氧化酶的最适作用温度和pH分别为25 ℃、8.0,在温度25～40 ℃、pH 7.0～10.0的范围内,酶活性较稳定,该酶属于低温酶。     

一株产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的Rhodococcus hoagii筛选、鉴定及酶学性质

从连云港高公岛海域采集的海泥中使用平板变色圈法初筛和摇瓶发酵复筛后,获得一株产几丁质脱乙酰酶的菌株MCDAⅡ-2。综合形态学特征以及16SrDNA序列分析最终将菌株MCDAⅡ-2鉴定为Rhodococcus hoagii。进而研究其酶学性质,得该几丁质脱乙酰酶最适催化温度为35℃,最适pH为8.0。Na^+、Mg^2+、Li+、Sr^2+对酶促反应起到促进作用,Ca^2+、Ba^2+、Co^2+、Cd^2+、Fe^2+及EDTA对酶促反应起到了抑制作用,而K^+对酶促反应影响较小。酶在25℃~35℃时较稳定,在中性和弱碱性条件下稳定性较好。本次研究的结果将为几丁质脱乙酰酶的工业化应用奠定基础。     

海洋氨肽酶菌株的筛选鉴定及其酶学特性研究

从大连渤海海域海泥海水样品中分离出一株高产海洋氨肽酶(aminopeptidase)菌株YZ1-2,对其进行形态学、生理生化、分子生物学(16S rDNA)鉴定,确定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。并对其产海洋氨肽酶进行酶学特性研究,结果表明,最适作用温度为30 ℃;最适作用pH值为8.5;Co2+、Zn2+等能较强地激活氨肽酶的活性,Ni2+、Ca2+等对酶的抑制性较强;乙二胺四乙酸(EDTA)可以有效地抑制氨肽酶活性。     

尿酸氧化酶高产菌筛选与酶学性质的研究

采用平板透明圈法和摇瓶发酵法筛选尿酸氧化酶高产菌株,并通过菌体形态特征和18S rDNA序列分析进行菌种鉴定。通过产酶发酵试验,优选产酶的最适条件;利用多种技术对尿酸氧化酶进行分离纯化,并通过酶促反应对酶学性质进行研究。结果表明,筛选获得1株尿酸氧化酶高产菌株UR-05,其被鉴定为食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母（Blastobotrys adeninivorans）。菌株UR-05所产尿酸氧化酶分子质量约为41.5 kDa,比酶活为215.4 U/mg;该酶的最适温度为30 ℃、最适pH值为8.0;Mg2+和Na+对该酶有激活作用,K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+对该酶有抑制作用。菌株UR-05所产尿酸氧化酶在一定条件范围内呈现出较强的活性,具有进一步研究及应用的价值。     

海洋肌酐水解酶菌株的筛选鉴定及其酶学性质研究

从渤海海泥中筛选出一株肌酐水解酶高产菌株S-09,经形态学、生理生化特征并结合16S rDNA系统发育分析,鉴定菌株为微小杆菌属(Exiguobacterium sp.)。对所产肌酐水解酶进行酶学性质研究表明,该酶的最适作用温度为30 ℃,热稳定性较差;最适作用pH值为7.5,碱性条件下,pH值稳定性较好;Co2+、Mn2+对酶的激活作用较强,Ag+、Hg2+对酶有显著的抑制作用。     

海洋低温甾醇酯酶菌株的筛选鉴定及其酶学特性研究

从大连渤海湾海泥海水样品中分离出一株高产海洋甾醇酯酶的菌株Q-06,对其进行形态观察、生理生化试验和分子生物学（16S rDNA）鉴定,并对其产海洋甾醇酯酶进行酶学特性研究。结果表明,菌株Q-06被鉴定为莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi）,其最适作用温度和pH值分别为30 ℃和7.0,该酶在低温下酶活性较高,有一定的耐弱碱性。Ag+对酶的抑制性较强,Mg2+、Ni2+、Ca2+等对甾醇酯酶的活性有微弱的激活作用,乙二胺四乙酸（EDTA）和十二烷基硫酸钠（SDS）均可以有效地抑制甾醇酯酶活性。     

一株褐藻酸裂解酶高产菌的筛选及其酶学性质研究

从腐烂的海带中筛选出一株褐藻酸裂解酶（Aly）高产菌,经形态学分析、生理生化特征和分子水平鉴定,该菌为交替假单胞菌属,命名为Pseudoalteromonas sp. EE258。利用硫酸铵沉淀、快流速DEAE-琼脂糖凝胶（DEAE-sepharose Fast Flow）和丙烯葡聚糖凝胶（Sephacryl S-100）柱层析等方法,对Pseudoalteromonas sp. EE258产生的褐藻酸裂解酶Aly-EE258进行分离纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定该酶的分子质量为23 ku。酶学性质研究显示：该酶的最适反应温度为40 ℃,最适反应pH值为7.0,在20 ℃以下时稳定性较好,Ca2+和Ba2+能明显提高酶的活性,Fe2+、Al3+、Mg2+和乙二胺四乙酸（EDTA）抑制酶的活性。Aly-EE258能不同程度地裂解褐藻酸、聚古洛糖醛酸和聚甘露糖醛酸,其中聚甘露糖醛酸裂解后主要产生单一的低聚寡糖,在实际应用方面具有重要意义。