黏质沙雷菌磷脂酶A1辅助蛋白S对表达宿主菌大肠杆菌抑制作用机制

黏质沙雷菌plaS基因编码的磷脂酶A1辅助蛋白S(phospholipase A1 accessory protein S,PlaS)能够显著提高磷脂酶A1在大肠杆菌中的表达活性,但对宿主菌的生长具有抑制作用,且抑制机制尚无相关研究报道.本实验通过对PlaS进行生物信息学分析并对其N端截短系列表达菌株的生长特性进行研究...     

辅助蛋白基因的剪接对磷脂酶A1酶活的影响

为探究磷脂酶A1辅助蛋白(phospholipase A1 accessory protein,PlaS)对磷脂酶A1 (phospholipase A1,PlaA1)酶活关键调控区域,根据PlaS的结构特点,设计出截短突变体,利用聚合酶链式反应技术将PlaA1与PlaS共表达基因plaB中编码辅助蛋白的基因plaS进...     

粘质沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1在大肠杆菌中的分泌表达及其条件优化

克隆粘质沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1基因pla A,与载体p ET-22b（+）连接构建重组质粒p ET-22b（+）-pla A,并将重组质粒导入受体菌E.coli BL21（DE3）中表达,构建得到重组菌AP22,IPTG诱导表达目的蛋白后将培养基蛋白进行SDS-PAGE分析显示:重组蛋白以可溶性蛋白的形式大量存在于发酵液中,分子质量约35 ku,与预期蛋白大小一致。以磷脂酶A1酶活为指标,在单因素实验的基础之上,通过正交实验得到摇瓶培养最佳条件为:氨苄青霉素终浓度30μg/m L,IPTG加量0.25 mmol/L,温度为34℃,OD600值为0.3,诱导时间4 h。在此条件下重组胞外磷脂酶A1酶活可高达8.6 U/m L,比优化前提高了43.3%。      

磷脂酶C对大肠杆菌细胞膜通透性的影响

本文在大肠杆菌(E.coli BL21 DE3)中分别克隆表达了产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)来源的磷脂酶C(PLC)基因,并系统研究了内源表达的重组PLC对大肠杆菌BL21(DE3)内外膜通透性的影响。结果表明内源表达的产气荚膜梭菌和单核细胞增生性李斯特菌重组PLC对宿主菌内膜通透性影响较大,但对宿主菌外膜通透性的影响相对较弱。此外,本文对两种不同来源重组表达的磷脂酶C蛋白进行了分离纯化,分析了外源添加重组磷脂酶C对大肠杆菌BL21(DE3)细胞膜通透性的影响。结果表明外源PLC对大肠杆菌外膜通透性影响较大,而对内膜通透性影响相对较小。综上所述,产气荚膜梭菌和单核细胞增生性李斯特菌来源的磷脂酶C可以改善大肠杆菌细胞膜的通透性,为进一步提高大肠杆菌工程菌株蛋白异源表达提供新的思路。     

磷脂酶A1催化水解大豆油制备甘油二酯研究（Ⅲ）——产品分析与检测

用高效液相色谱(HPLC)分析了大豆油和经过磷脂酶 A1 催化水解、分子蒸馏纯化的甘油二酯产品中甘油酯的含量,用折光指数检测器(RID)测定水解产品甘油二酯含量为42.64%,通过高效液相色谱电喷雾(ESI)质谱(MS)联用分析了甘油酯的组成.用气相色谱分析了大豆油、分子蒸馏轻相脂肪酸及水解产品的脂肪酸组成.结果发现,和原料大豆油相比,磷脂酶 A1 催化水解得到的脂肪酸中棕榈酸含量显著提高.     

磷脂酶A1水解卵磷脂的研究靠

研究磷脂酶A1水解卵磷脂的条件,确定最佳的酶解条件为酶解温度50℃,水∶磷脂(w/w)50,反应溶液pH 8.0,酶解时间9h,添加50μL 0.3mol/L Ca2 溶液及100μL磷脂酶A1溶液。     

均相壳聚糖固定化磷脂酶A1(PLA1)的研究

以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂、酶液,三者均相反应,固定化磷脂酶A1,对它的固定化条件及固定化酶的各种性质进行了研究。固定化最佳条件,以脱乙酰度为92.8%,平均分子量为7.84×105,戊二醛浓度为3%缩合后,在0.5mg/100mL酶、pH6.0、25mmol/L CaCl2、4℃条件下固定化酶,酶活力回收可达59%。固定化酶最适温度60℃、最适pH值8.0,Km=9.08mmol/L。     

大豆毛油磷脂组成对磷脂酶A1深度脱胶的影响

为确保后续精炼的顺利进行,大豆毛油需先进行脱胶处理将含磷量降至10 mg/kg以下。就磷脂酶A1(PLA1,Lecitase Ultra)对22种不同来源大豆毛油的深度脱胶效果进行了研究。结果表明:大豆毛油的磷脂组成对PLA1深度脱胶效果存在一定影响; PA占比与PLA1深度脱胶油含磷量呈极显著正相关(p 0. 01),PC占比与PLA1深度脱胶油含磷量呈显著负相关(p 0. 05),PA与PC的比例与PLA1深度脱胶油含磷量呈极显著正相关(p 0. 01); PA含量较高、PC含量较低的大豆毛油PLA1深度脱胶效果相对较差;但大多数情况下,PLA1深度脱胶能够使大豆毛油的含磷量降至10 mg/kg以下,满足后续精炼要求。     

固定化磷脂酶A1水解卵磷脂的研究

对固定化磷脂酶A1水解卵磷脂的条件进行优化，经正交试验确定最佳的酶解条件，即酶解温度为50℃，反应溶液pH为8．0，2％溶血磷脂4mL酶解时间10h，且酶解溶液中加入溶血磷脂对磷脂的水解影响最显著。     

超声波对磷脂酶A1脱除油中非水化磷脂的影响

以菜籽四级油为原料,研究了超声波对磷脂酶A1脱除油中非水化磷脂的影响。结果表明,适宜的超声辐射可显著提高磷脂酶A1对油脂的酶处理脱胶速度;超声波对磷脂酶A1的作用效果与超声功率、超声时间和超声频率密切相关;超声作用没有改变磷脂酶A1对油脂脱胶的最适pH,但使磷脂酶A1对油脂脱胶的最适温度明显增高。     

壳聚糖对细菌细胞膜及膜蛋白的作用

研究壳聚糖对受试菌株大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(St. aureus)的抑制作用;通过测定壳聚糖作用前后菌液的相对电导率变化和以1-N- 苯萘胺为荧光探针荧光强度的变化,分别考察壳聚糖对E.coli 和St. aureus 细胞膜和E.coli 外膜渗透性的影响;运用荧光分光光度计研究壳聚糖对E.coli 细胞膜中色氨酸(Trp)荧光强度的影响。结果表明,壳聚糖具有很好的抑菌性能,能改变细菌细胞膜的渗透性,从而破坏细胞膜。壳聚糖对细胞膜中Trp 的荧光具有明显的猝灭作用,且对细胞膜蛋白的猝灭作用 属于静态猝灭。     

酸胁迫对鼠伤寒沙门氏菌抗酸性、细胞膜及膜蛋白的影响

目的：以鼠伤寒沙门氏菌CGMCC 1.1190为对象,研究柠檬酸反复胁迫处理对其抗酸性、细胞膜及其膜蛋白的影响。方法：将CGMCC 1.1190分别在经柠檬酸调节到pH值为3.0、2.7、2.5的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中胁迫处理并转接12 次培养后,获得3 株CGMCC 1.1190的抗酸性菌株,测定了这3 株抗酸性菌株的D值、菌落形态、个体形态、膜通透性、膜流动性和膜蛋白的变化。结果：这3 株抗酸性菌株的D值随着酸处理次数的增加不断增大,酸胁迫的pH值越低,D值越大,菌落形态与个体形态变化越明显;与原始对照菌株相比,当这3 株抗酸性菌株置于pH 2.0的强酸环境下时,其碘化丙啶染色区域的死菌比例显著降低（P＜0.05）,表明酸胁迫pH值越低,这3 株抗酸性菌株的细胞膜对H＋通透性越低;随着酸胁迫pH值的降低,CGMCC 1.1190抗酸性菌株细胞膜磷脂的熔点升高,表明细胞膜磷脂的相变温度升高,细胞膜流动性降低;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,这3 株抗酸性菌株分子质量35～180 kDa范围内的细胞膜蛋白表达量增加,在135 kDa和180 kDa处均增加了特异条带。结论：随着酸胁迫pH值的降低,CGMCC 1.1190抗酸性增加,菌落变小,个体形态变长,细胞膜通透性和流动性均降低,部分膜蛋白表达量和表达种类增加,这些变化有利于其适应在酸胁迫环境下生长,提高生存能力。     

磷脂酶A1水解大豆浓缩磷脂研究

该研究采用磷脂酶A1水解大豆浓缩磷脂,通过单因素实验确定各因素合适范围,利用响应面实验方法,得到磷脂酶A1水解大豆磷脂最佳工艺条件为:反应温度51℃、反应时间6h、加酶量3．6％、 pH值5．0、底物浓度0．25 g／mL;利用气相色谱仪分析水解前后磷脂脂肪酸组成,硬脂酸完全水解,棕榈酸含量从20．2％减至5．1％。     

杨梅叶原飞燕草素对胰脂肪酶和磷脂酶A1的影响

比较了奥利司他（Orlistat）以及不同加工程度的杨梅叶原飞燕草素提取物（杨梅叶粉末、杨梅叶含糖提取 物和杨梅叶去糖提取物）对胰脂肪酶和磷脂酶A1在体外以及SD大鼠小肠内的活性抑制能力。结果表明：Orlistat对 体外和大鼠小肠内的胰脂肪酶的活性抑制率均为最高,分别为99.0%和96.5%,排在第二的去糖提取物分别为90.9% 和91.4%;Orlistat对体外和大鼠小肠内的磷脂酶A1的活性抑制率也均为最高,分别为97.1%和97.2%,排在第二的 去糖提取物分别为96.7%和87.7%。检测了去糖提取物的半抑制浓度,对于胰脂肪酶和磷脂酶A1分别为0.01 mg/mL 和0.06 mg/mL,分析其对胰脂肪酶的抑制类别为竞争性抑制＋反竞争性抑制,对磷脂酶A1的抑制类别为竞争性抑 制,杨梅叶原飞草素是一种潜在的高效、可控的新型减肥产品。     

氨基化Fe3O4-SiO2固定化磷脂酶A1

以磁性Fe3O4-SiO2纳米颗粒为载体,研究固定化条件对磷脂酶活力的影响,通过响应面试验得到最优固定化条件为：固定化pH 6.7、固定化温度30 ℃、固定化时间7.9 h、戊二醛质量分数8.3%、加酶量8.2 mL/50 mg,在此条件下酶活力回收率能达到63.6%,蛋白固载率68%。并对制备的固定化磷脂酶的化学组分、形态结构和粒径进行分析,结果表明磷脂酶固定化效果较好,粒径均一,载体平均粒径为200 nm左右。固定化酶热稳定性、pH值稳定性和贮藏稳定性增强,最适反应温度为50 ℃,最适pH 6.0,重复操作10 次后保留60%以上的初始酶活力。     

大孔树脂固定化磷脂酶A1及其用于菜籽油脱胶工艺的优化

选择8种大孔树脂对磷脂酶A1进行固定化,结果表明,离子交换树脂D001的固定化效果最好,其优化的最佳条件为缓冲液pH5.0、酶添加量1.5mL/g、固定化时间4h,在该条件下获得的固定化酶活力为665.8U/g。将固定化酶用于菜籽油脱胶实验,经响应面优化确定最优脱胶条件为固定化酶添加量1.8g/kg、反应时间3.6h、反应温度51℃、反应pH5.5,在此条件下得到的脱胶油中磷含量为5.82mg/kg。将固定化酶重复脱胶5次后,仍保留初始酶活力的47.9%,脱胶油中磷含量为9.78mg/kg。