牛奶发酵过程中阪崎克罗诺杆菌可形成活的非可培养状态

该研究以保加利亚乳杆菌为牛奶发酵剂,研究了牛奶发酵过程中阪崎克罗诺杆菌与保加利亚乳杆菌的相互作用以及阪崎克罗诺杆菌存活量的变化情况,并结合16S rDNA高通量测序技术和PMA-qPCR方法分析阪崎克罗诺杆菌在牛奶发酵过程中是否形成“活的非可培养”状态。结果显示,保加利亚乳杆菌在牛奶中发酵48 h后pH值可达到3.40,酸度值可达212.00。在发酵前期接种阪崎克罗诺杆菌,48 h后pH值和酸度值分别为3.50和193.30;在发酵中期接种阪崎克罗诺杆菌,48 h后pH值和酸度值分别为3.47和214.30。发酵前期阪崎克罗诺杆菌的污染对保加利亚乳杆菌发酵结果的影响更大。阪崎克罗诺杆菌在牛奶中生长48 h后菌浓度可稳定在9.08 lg(CFU/mL);不论在牛奶经发酵前期或中期接种阪崎克罗诺杆菌,发酵后期平板计数法均检测不到阪崎克罗诺杆菌,但16s rDNA和PMA-qPCR技术均可检测到阪崎克罗诺杆菌活菌的存在。该研究结果说明,阪崎克罗诺杆菌在牛奶发酵后进入了“活的非可培养”状态,该状态的存在会导致该菌检测时活菌数量的低估,从而引发乳及乳制品的安全隐患。     

添加扩增内标的PCR方法快速检测食品中的阪崎克罗诺杆菌

为了解决常规PCR方法检测阪崎克罗诺杆菌时因检测过程中环境和食品理化因素的影响而导致的假阴性结果的产生,本研究以细菌16S rRNA基因为扩增内标对照,以阪崎克罗诺杆菌特异性基因grx B为靶基因设计了一对特异性引物,并通过优化PCR反应条件,最终建立了一种添加扩增内标的阪崎克罗诺杆菌PCR检测方法,可以指示PCR过程中因存在DNA聚合酶抑制剂而导致的假阴性结果。通过对20种细菌进行PCR检测显示,该方法对阪崎克罗诺杆菌具有良好的特异性。灵敏度实验结果表明,该检测方法对阪崎克罗诺菌纯DNA模板的检测灵敏度为2.15×102fg/μL,对阪崎克罗诺杆菌纯培养物的检测灵敏度为9.4×103CFU/m L。对人工污染婴幼儿奶粉的检测结果显示,阪崎克罗诺杆菌接种量为0.94 CFU/g的婴幼儿奶粉样品经过8 h增菌培养后,即可检出。食品样品检测结果表明,不添加扩增内标的PCR检测方法中出现的假阴性结果可被本方法检出。该检测方法特异性强、灵敏度较高,能消除阪崎克罗诺杆菌常规PCR检测方法中可能出现的假阴性结果,适用于婴幼儿配方乳粉、乳制品等食品中阪崎克罗诺杆菌的快速检测。     

免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法建立

目的:制备高效且特异性好的阪崎克罗诺杆菌抗体及其免疫磁珠,建立免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)检测奶粉中的阪崎克罗诺杆菌的方法。方法:制备阪崎克罗诺杆菌混菌抗体及其免疫磁珠,对免疫磁珠分别在纯培养及奶粉基质中的捕获率进行研究,利用MALDI-TOF MS对不同奶粉基质中不同杂菌污染条件下的检测样本进行鉴定并验证免疫磁珠的特异性。结果:阪崎克罗诺杆菌免疫磁珠在纯培养条件及奶粉基质中对4株阪崎克罗诺杆菌及其混菌的捕获率均>80%,联合MALDI-TOF MS鉴定结果显示在奶粉基质中不同杂菌污染条件下具有较好的鉴定结果,即使在高比例（1:100）杂菌污染条件下,仍能准确鉴定奶粉中阪崎克罗诺杆菌,此时检测样品中阪崎克罗诺杆菌浓度仅为20 CFU/mL。结论:本研究建立了一种操作简便、鉴定结果准确的免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法,为奶粉中阪崎克罗诺杆菌的快速准确鉴定提供了新的方法参考。     

奶粉中阪崎克罗诺杆菌生长与失活建模的研究进展

奶粉中含有丰富的营养物质,极易被微生物污染,而阪崎克罗诺杆菌是污染奶粉的主要病原菌之一。本文对国内外阪崎克罗诺杆菌生长、失活建模的研究进行综述,生长模型的建立为病原微生物的监测提供有效信息,失活模型的建立能反映传统、新型微生物控制技术和历史应激对阪崎克罗诺杆菌的失活作用效果。最后,针对目前阪崎克罗诺杆菌在预测建模研究中存在的问题进行探讨,并对阪崎克罗诺杆菌的研究方向提出建议,以期为今后的研究提供参考。     

辽宁省婴幼儿食品源阪崎克罗诺杆菌生物膜与耐药性分析

目的 探究婴幼儿食品中的阪崎克罗诺杆菌在形成生物膜后对其耐药性表达的影响,并对该致病菌的耐药性监测提供建议。方法 本研究对2018—2021年辽宁省婴幼儿配方食品中分离出的58株阪崎克罗诺杆菌进行了15种抗生素的药物敏感性、生物膜成膜力检测和不同生物态下耐药性分析。结果 辽宁省婴幼儿食品中检出的阪崎克罗诺杆菌对头孢唑啉、头孢噻肟、复方磺胺、氯霉素、头孢西丁、萘啶酸、氨苄西林/舒巴坦存在不同程度耐药性,88%的受试菌株对多黏菌素的耐药性达到中介,并且存在多重耐药菌;婴幼儿奶粉源阪崎克罗诺杆菌的耐药性均高于婴幼儿谷物辅食源阪崎克罗诺杆菌;生物膜成膜率100%,中等黏附力菌株居多占61.02%;基于生物膜态对应受试菌的药敏试验结果分析,头孢唑啉、头孢噻肟、亚胺培南、四环素和氨苄西林的药物抗性均增加,复方磺胺的药物抗性消失。结论 辽宁省市售婴幼儿食品中阪崎克罗诺杆菌不仅对多种抗生素具有单一耐药性,且存在多重耐药株;不同生物态的阪崎克罗诺杆菌均对头孢类抗生素药物抗性较高,同时生物膜态可以改变其药物抗性,应持续对婴幼儿食品源中不同生物态的阪崎克罗诺杆菌进行耐药监测。     

一种快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法

对磁珠吸附过程中三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA,TE)缓冲液的p H值、蛋白酶K添加量、吸附时间和吸附温度等参数进行了优化。在优化条件下氨基磁珠可以非特异性地直接吸附婴幼儿配方奶粉中存在的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),并结合聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术特异性扩增阪崎克罗诺杆菌DNA,检测灵敏度达到102CFU/mL。此外,经特异性试验验证,此方法用于检测常见食源性致病菌及克罗诺菌属中的非阪崎克罗诺杆菌均无交叉反应。同时,经干扰性试验验证,体系中存在的其他干扰菌株DNA并不会影响阪崎克罗诺杆菌的检测。该方法避免了抗体的使用,解决了抗体制备难度大、成本高等问题,同时克服了传统方法 3～5 d前增菌时间过长的弊端,实现了对婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的快速检测。     

实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌方法的建立

目的建立实时荧光单引物等温扩增(SPIA)检测阪崎克罗诺杆菌的方法。方法本文以阪崎克罗诺杆菌Omp A基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,对4株不同来源阪崎克罗诺杆菌和21株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA特异性分析,通过不同浓度梯度阪崎克罗诺杆菌菌悬液灵敏度的检测和添加有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方奶粉样品检出限的确定,评价方法的准确度。结果除4株阪崎克罗诺杆菌外,其他细菌均未出现特异性荧光扩增曲线,具有良好的特异性。在40 min内,实时荧光SPIA检测阪崎克罗诺杆菌纯培养基因拷贝灵敏度为每反应1 copies,相应活菌数为1.6×10-1cfu/ml;对婴儿配方奶粉模拟样品中阪崎克罗诺杆菌的检出限是1.5×100cfu/100 g。结论本研究建立的方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单等优点,适用于实验室快速检测阪崎克罗诺杆菌Omp A基因。     

环介导等温扩增-无电加热法检测乳中阪崎克罗诺杆菌

设计了一个无电加热器,利用氧化钙和水的化学反应提供热源,建立一种检测乳中阪崎克罗诺杆菌的环介导等温扩增无电检测体系,同时以阪崎克罗诺杆菌的ITS序列为靶基因,设计特异性引物,使其能够实现快速、高效的现场检测婴儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌,最终通过琼脂糖凝胶电泳法对检测结果进行判定。利用上述建立的无电检测体系,进行阪崎克罗诺杆菌灵敏度实验并与传统用电加热器法进行对比,在不同环境温度下进行测试。结果表明,利用该无电检测体系和基于传统电加热器检测阪崎克罗诺杆菌纯培养物的灵敏度均为2.6×10~2CFU/m L,且人工污染的婴儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的灵敏度均为4.2×10~2CFU/g。该无电检测体系稳定性好,在环境温度为4~37℃时,灵敏度均能达到10~2CFU/g。     

阪崎克罗诺杆菌耐热性和耐酸碱性的研究

研究阪崎克罗诺杆菌分离菌株对温度及酸碱的耐受性,从而对婴儿配方粉生产过程中的阪崎克罗诺杆菌的污染进行控制。对4株来源不同的阪崎克罗诺杆菌进行不同温度和酸碱条件的处理,并将处理后的菌液涂布于TSA培养基观察菌株的存活情况;以阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544为阳性对照。结果显示,不同来源的菌株对温度及酸碱的耐受性存在一定的差异,这为降低该菌的感染风险提供了依据。     

GABA旁路在阪崎克罗诺杆菌耐干燥胁迫中的作用

阪崎克罗诺杆菌是婴幼儿配方奶粉（Powdered Infant Formula,PIF）中常见的食源性致病菌,γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid,GABA）是一种广泛存在于各种生物体内的非蛋白氨基酸,而gabT控制的氨基丁酸转氨酶是GABA代谢旁路的关键酶。该研究通过构建阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544 gabT基因敲除菌株（ΔgabT）,探讨gabT控制的GABA（γ-氨基丁酸）代谢旁路对阪崎克罗诺杆菌抵抗干燥的作用。结果表明,ΔgabT在干燥胁迫下处理一周后存活率可达到28.64%显著高于野生型菌株（WT）的存活率1.57%。此外,GABA在ΔgabT中累积量高于WT,与存活率结果呈正相关,表明GABA累积能帮助阪崎克罗诺杆菌抵御干燥胁迫。扫描电子显微镜检测结果也显示ΔgabT菌株具有较完整的细胞形态,进一步验证了GABA积累有助于阪崎克罗诺杆菌在干燥环境胁迫下的生存。该研究为阪崎克罗诺杆菌中基于GABA旁路的靶向调控奠定了基础,为阪崎克罗诺杆菌防控提供新思路。     

Cronobacter spp. in powdered infant formula

Cronobacter species are opportunistic pathogens, and a mortality rate of 40 to 80% is associated with infections. This pathogen can cause a range of serious diseases such as meningitis, septicemia, necrotizing enterocolitis, and brain abscesses and has been responsible for a variety of sequelae such as quadriplegia. Although Cronobacter can cause disease in both adults and infants, infant infections associated with powdered formula are the focus of this review. Since the first reported Cronobacter infection outbreak in 1958, powdered infant formula has been identified as a major source of these outbreaks, resulting in many recalls of powdered infant formula worldwide. This contamination has created an immense problem for the powdered infant formula industry. In this review, we discuss the taxonomy of Cronobacter species, the natural habitat of Cronobacter and its presence in foods, the physiology, pathogenicity, and virulence of Cronobacter species, and available detection methods. We also discuss reported cases of Cronobacter infection linked to powdered infant formula consumption and then focus specifically on the official World Health Organization guidelines for preparation of powdered infant formula.     

GB 4789.40-2016和ISO 22964:2017方法检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌属的实验室适用性研究

克罗诺杆菌属（原阪崎肠杆菌）可在婴幼儿配方粉（Powdered Infant Formula,PIF）中长期存活。随着食品贸易的全球化，人们对婴幼儿配方粉（PIF）中克罗诺杆菌的污染尤为关注。本文参照ISO 16140-2 2016中方法比对的原则要求，对检测PIF中克罗诺杆菌的中国标准方法 GB 4789.40-2016（参考方法）和欧盟标准方法 EN ISO 22964:2017（替代方法）进行了方法比较研究。共有12个外部实验室参与检测3个不同污染水平（0 MPN/10 g,1.299 MPN/10 g和2.210 PMN/10 g）下添加了测试菌株的576份盲样的测试。结果表明，在低污染水平和高污染水平下，GB 4789.40-2016的灵敏度分别为80.00%和81.16%，而ISO 22964:2017对应的灵敏度分别为90.00%和97.10%。无论污染程度如何，相对检测水平（RLODs）都低于接受限（AL=2.5）。同时，采用AOAC指南中提出的检测概率（POD）模型对统计数据进行了分析，结果显示替代方法和参考方法之间没有统计学上的显著差异。据此得出用于检测PIF中阪崎...     

奶粉中阪崎肠杆菌的污染及快速检测方法的研究

目的：了解福建省市售婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的污染状况、污染途径并寻找快速准确的检测方法。方法：应用分离鉴定、PCR 和荧光PCR 等方法检测,分离鉴定采用阪崎肠杆菌显色培养基和全自动微生物生化仪。结果：阪崎肠杆菌在192 份市售婴幼儿配方奶粉中的检出率为1.56%,在60 份原料奶粉中的检出率为13.33%,30 份生产车间环境样本均未检出。结论：福建省市售婴幼儿配方奶粉中存在阪崎肠杆菌的安全隐患,某工厂奶粉中阪崎肠杆菌的污染主要来自原料奶粉。荧光PCR 和显色培养基可用于阪崎肠杆菌的快速筛选和分离。     

婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染调查及分子分型研究

目的了解温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染情况及分子分型特征,分析不同菌株间亲缘相关性。方法参照GB 4789.40—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》方法在食品中分离鉴定克罗诺杆菌。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)方法对克罗诺杆菌进行分型研究。结果 2013—2017年共采集737份婴幼儿食品和配方奶粉,克罗诺杆菌总检出率为6.1%(45/737)。其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高(23.4%,37/158)。45株克罗诺杆菌属于阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)和莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)。其中阪崎克罗诺杆菌最多(73.3%,33/45),其次为丙二酸盐克罗诺杆菌(24.4%,11/45)。MLST共分为25个ST型,其中ST64、ST1、ST40、ST4和ST7为优势型别。45株克罗诺杆菌PFGE分型得到38个带型,未发现有明显的优势分型和聚集现象。PFGE型和MLST型结果分析表明,绝大数具有相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型,而相同MLST型却不一定具有较高的亲缘关系。结论温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌的污染状况较轻,其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高。食品来源的克罗诺杆菌图谱具有高多态性和离散性。     

婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

目的：建立一种检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的解旋酶恒温基因扩增方法。方法：根据阪崎克罗诺杆菌ITS基因设计特异性引物,优化解旋酶恒温基因扩增法反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,人工添加阪崎克罗诺杆菌确定检出限,多种致病菌在建立的解旋酶恒温基因扩增体系中扩增验证特异性,电泳检测扩增产物。结果：解旋酶恒温基因扩增法检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌得到与设计序列长度一致的100 bp基因片段,检出限为10 CFU/g,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的终浓度分别为0.1、5.0 μg。结论：解旋酶恒温基因扩增法用于检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的特异性强、灵敏度高、耗时短,为婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供了新的方法。     

Nonthermal Inactivation of Cronobacter sakazakii in Infant Formula Milk: A Review

Up-to-date, nonthermal technologies and combinations of them, in accordance with the “hurdle technology” concept, are being applied by different research groups in response to calls by the International Food and Human Health Organizations (ESPGHAN, 2004; FAO/WHO, 2006, 2008) for alternatives to thermal control of Cronobacter sakazakii in reconstituted powdered infant formula milk. This review highlights (i) current knowledge on the application of nonthermal technologies to control C. sakazakii in infant formula milk and (ii) the importance of the application of nonthermal technologies for the control of C. sakazakii as part of the development of strategies in the context of improving food safety and quality of this product.     

部分茶饮料原辅料中优势菌-克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)的分离和鉴定

克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)是新兴的条件致病菌,主要通过污染的婴儿配方奶粉引起2岁以下婴幼儿严重疾病甚至死亡.在对茶饮料原辅料192份样品进行细菌总数测定和优势菌16S rDNA序列分析时,发现2批次绿茶和l批次果葡糖浆中优势菌疑似条件致病菌-克罗诺杆菌,而且其数量较高(4.0× 102cfu/g～104cfu/g).进而通过rpoB序列分析,将4个分离株鉴定为阪崎克罗诺杆菌Cronobacter sakazakii(原阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii).结果表明在常见的食品原料-果葡糖浆和绿茶中存在克罗诺杆菌的污染,rpoB分型方法在对克罗诺杆菌属细菌的鉴定到种上表现出高度特异性,灵敏而准确.     

婴幼儿配方粉生产中克罗诺杆菌溯源研究

结合陕西省两个婴幼儿配方乳粉加工厂婴配粉生产工艺,对生产原辅料、车间环境、加工设备及工厂周边土壤进行采样,检测克罗诺杆菌的污染状况,并对菌株进行脉冲场凝胶电泳(Pulse field gel electrophoresis,PFGE)分型溯源,定位克罗诺杆菌在生产过程的污染点.结果 表明,采集的1246份样品中检出14...     

柳江县市售国产婴幼儿配方粉中阪崎肠杆菌污染监测分析

目的 了解市售国产婴幼儿配方粉中阪崎肠杆菌污染状况,为消费预警提供科学依据。方法 分别按2011、2012年版国家食源性致病菌监测工作手册对市场上11家国内生产的32份婴幼儿配方粉进行检测。结果 32份样品检出2株阪崎肠杆菌,检出率为6.25%。其中婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌检出率4.35%(1/23);婴幼儿谷物食品中阪崎肠杆菌检出率11.11%(1/9)。结论 柳江县市售部分婴幼儿配方粉中存在阪崎肠杆菌污染,食用安全隐患不容忽视,应加强监测力度,预防和控制阪崎肠杆菌引起的食物中毒事件发生。