嗜热芽孢杆菌高温蛋白酶HS08活性中心研究

运用化学修饰方法对一株嗜热芽孢杆菌所产生的耐高温蛋白酶HS08活性中心的结构进行了研究。结果表明,蛋白酶HS08的活性被酶活性中心丝氨酸残基专一性抑制剂PMSF以及金属离子螯合剂EDTA强烈抑制,色氨酸和精氨酸对酶活性有重要作用,但并不位于酶的活性中心。Zn2+可使该酶活性明显提高,Cu2+对该酶活性有抑制作用。因此,该酶属于金属离子激活的丝氨酸族蛋白酶。     

嗜热芽孢杆菌高温蛋白酶HS08活性中心研究

运用化学修饰方法对一株嗜热芽孢杆菌所产生的耐高温蛋白酶HS08活性中心的结构进行了研究。结果表明,蛋白酶HS08的活性被酶活性中心丝氨酸残基专一性抑制剂PMSF以及金属离子螯合剂EDTA强烈抑制,色氨酸和精氨酸对酶活性有重要作用,但并不位于酶的活性中心。Zn2+可使该酶活性明显提高,Cu2+对该酶活性有抑制作用。因此,该酶属于金属离子激活的丝氨酸族蛋白酶。      

嗜热芽孢杆菌高温蛋白酶HS08的化学修饰研究

分离纯化了嗜热芽孢杆菌产生的耐高温蛋白酶HS08,以SDS-PAGE凝胶电泳和Superdax75预装柱凝胶过滤,测定蛋白酶HS08的分子质量为30.6ku,同时研究了酶专一性抑制剂对酶活性的影响。结果表明,蛋白酶HS08的活性被酶活性中心丝氨酸残基专一性抑制剂PMSF以及金属离子螯合剂EDTA强烈抑制,而NBS、WRK、TNBS、Phenylgloxalhydrate等修饰剂对酶活性无明显抑制作用。K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+等金属离子对酶活性影响实验结果表明,Zn2+可使该酶活性明显提高,Cu2+对该酶活性有抑制作用。因此,该酶属于金属离子激活的丝氨酸族蛋白酶。蛋白酶HS08的酶动力学实验表明,以BSA为底物,PMSF可使蛋白酶HS08最大反应速率Vmax下降50%,而对其米氏常数Km影响不大。     

嗜热芽孢杆菌HSO8耐热中性蛋白酶的分离纯化及部分特性研究

从高温土壤中分离出1株产耐热中性蛋白酶的嗜热芽孢杆菌,研究了该酶的分离纯化与生化特性.蛋白酶经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephacryl S-100HR凝胶层析分离纯化后,纯化倍数提高4.25倍,产率5.1%;经SDS-PAGE电泳测得其分子质量为30.9 kDa.酶的最适温度与pH试验表明,其最适温度为65 ℃,最适pH为7.5,并在50 ℃时保持1 h以上的稳定.该蛋白酶活性受到EDTA的抑制,Zn2+能提高酶活性,该酶为金属蛋白酶.改性酪蛋白(Azocasein)、酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)等3种底物专一性试验表明,改性酪蛋白是其最适底物.     

枯草芽孢杆菌HS18碱性蛋白酶分离纯化及其性质研究

从合浦珠母贝肠道中分离鉴定到酶菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HS18,将枯草芽孢杆菌HS18的发酵液,经过硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A-50柱层析、Sephadex G-100柱层析3步纯化后得到了单一的酶蛋白,回收率为11.4%;经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得酶蛋白分子量约为31ku;该蛋白酶最适反应温度为50℃,最适pH10.0;K+及Na+对酶有明显激活作用;丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂（PMSF）能强烈抑制酶活性。表明所纯化到的蛋白酶为丝氨酸碱性蛋白酶。      

高地芽孢杆菌PY41碱性蛋白酶纯化

该文对高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)PY41菌株的碱性蛋白酶进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析和疏水层析得到纯化的碱性蛋白酶,经SDS–PAGE凝胶电泳检测得到该蛋白酶相对分子质量为29.5 kDa。     

碱性蛋白酶产生菌嗜碱性芽孢杆菌的筛选

从土壤中筛选出的嗜碱性芽孢杆菌TGl,能在pH9～11条件下生长、产酶。酶促反应的最适pH为11,最适温度45℃。在pH12条件下的最适温度为30℃。在30℃,接种量4％,种龄10小时,初始pH11,培养时间60小时的条件下,酶活力可达2600单位/毫升。     

嗜碱性芽孢杆菌产高碱碱性蛋白酶发酵培养基及发酵条件的研究

对一株高产高碱碱性蛋白酶的嗜碱性芽孢杆菌的发酵培养基及发酵工艺进行了优化。确定了发酵培养基所采用的棉籽饼粉最适粒度为 80目 ,麦芽糊精的最佳DE值为 3 0 %。并确定了该菌株的最适发酵培养基配方为 ( g/1 0 0mL) :棉籽饼粉 3 ,酵母浸粉 1 75 ,麦芽糊精 1 0 ,柠檬酸钠 0 3 ,CaCl2 0 3。K2 HPO4 1 ;最适摇瓶发酵条件为 :种龄 1 2h ,接种量 2 %,装液量 5 0mL/2 5 0mL ,摇床转速 2 0 0r/min ,3 4℃ ,发酵 5 4h ,碱性蛋白酶的发酵单位可达 3 3 985u/mL ,比优化前提高了5 4 48%。此外 ,还进行了 5L罐放大实验 ,在 5L罐所确定的最适工艺条件下 ,发酵单位可达3 65 79u/mL。     

嗜热脂肪芽孢杆菌对超高压的耐性初探

对嗜热脂肪芽孢杆菌Ａｓｌ．９９９进行了超高压杀菌实验，探讨压力、时间、基质对灭 效果的影响，并考察了热处理和抑菌剂地高压杀菌的协同作用效果。     

一株嗜热脂肪芽孢杆菌的筛选及其产酶特性研究

从高温大曲中分离得到了一株产淀粉酶和蛋白酶的嗜热芽孢杆菌ZJY-1,研究了菌株ZJY-1的生长特性和产酶特性,并应用于强化麸曲探究其价值。经鉴定分析,菌株ZJY-1为嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus),其最适生长pH为7.0,有良好嗜热性,最适生长温度为55℃,且在65℃高温下仍生长良好;菌株酶活力检测结果表明,不同发酵时间菌株功能酶活力存在差异,淀粉酶活力最高达到了133.5 U/g±12.5 U/g,蛋白酶活力最高为175.4 U/g±4.8 U/g;通过制备强化麸曲试验表明,ZJY-1麸曲具备分泌蛋白酶和淀粉酶能力,生物量指标可达到5.7×10¹⁰±2.8×10⁹CFU/g。本研究丰富了大曲微生物菌种资源,为高温曲发展方向提供了参考价值。     

高产中/碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌W1菌株的筛选及条件优化

为了筛选高产蛋白酶活性细菌,以大豆及其发酵制品为目标样品,采用酪蛋白平皿筛选到一株既可产中性蛋白酶又可产碱性蛋白酶的细菌菌株W1,经形态学及16S rDNA基因序列分析鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp. Subtilis),其产中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力分别为28.99 U/mL和33.19 U/mL。通过单因素试验对其产蛋白酶的培养条件进行初步优化,并在此基础上以总蛋白酶活力为指标对其产蛋白酶条件进一步进行正交试验优化,最佳条件为培养基初始pH 9.0,接种量4%,培养温度35℃,培养时间48 h,此条件下中性蛋白酶活力为40.39 U/mL,碱性蛋白酶活力为52.02 U/mL,总蛋白酶活力为92.41 U/mL,优化后相应酶活力分别提高了39.3%、56.7%和48.6%,这将为枯草芽孢杆菌W1菌株蛋白酶的酶学性质研究提供帮助,同时也是对蛋白酶活性枯草芽孢杆菌资源库的丰富。     

嗜热芽孢杆菌对美拉德反应的作用初探

从白云边高温大曲中筛选到一株嗜热芽孢杆菌BG05,通过美拉德模式反应和除菌灭酶实验发现,BG05对美拉德反应有一定的促进作用,存在某种酶能够催化美拉德反应的进行。以麸皮为固体发酵培养基,研究外界条件对BG05促进美拉德反应的影响因素,结果表明：55℃高温发酵、8d的发酵时间、初始pH7.0、料液比1：0.7、接种量10%的外界条件能够更好的促进美拉德反应的进行,Fe3＋对美拉德反应的发生有较明显的促进作用。     

中性蛋白酶高产菌株的诱变选育

对产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) SHB 2010-1进行物理和化学诱变以筛选高产菌株。考察了6种筛选培养基在分辨中性蛋白酶高产菌株上的效率,菌株在脱脂牛奶培养基上生长状态最佳,水解圈易于观察。以紫外线、硫酸二乙酯为诱变剂,研究了两者的致死率曲线,选择致死率为90~95%的剂量进行两轮复合诱变,诱变菌的发酵液酶活依次较出发菌提高1.49%、10.99%、38.77%和59.68%,复合诱变表现出较单一诱变更强的效应,并能利用弱诱变剂紫外线积累的隐性突变。最终筛选得到的菌株命名为DES-59,在50 mL发酵培养基中培养60 h酶活达到7307 U/mL,相应的生物量为2.205×1010 CFU/mL,表现出典型的生长偶联型。突变菌的nprE基因经克隆及测序与数据库上的序列一致,酶活性的提高并非由中性蛋白酶A结构改变引起,突变出现在生产蛋白酶的其他位点上,有利于潜在性能的提高。     

枯草芽孢杆菌B.subtilisML中性蛋白酶基因的克隆及鉴定

以蛋白酶高产菌株Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＭＬ为供体菌，提取其染色体ＤＮＡ，经限制性内切酶ＢａｍＨＩ完全酶切后，插入枯草杆菌载体ｐＮＱ１２２的相同酶切位点，连接后转化中性碱性蛋白酶基因双缺陷型菌株Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＤＢ１０４。从含有氯霉素的酪蛋白平板上获得了２０个具有蛋白酶活性的克隆。     

枯草杆菌中性蛋白酶基因的表达

本文研究了中性蛋白酶基因在不同宿主菌及各种培养条件下的蛋白酶表达水平。用含有中性蛋白酶基因的重组质粒ＰＭＰＲ４，ＰＭＰＲ８和ＰＭＰＲ１６转化ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＢＧ２０３６，ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＡＳ１．３９８和ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＭＬ，对转化菌产生的蛋白酶活性分析表明：三个重组质粒的导入，均使主菌的酶活性有大幅度的提高。其规律是：宿主菌的蛋白酶活性越低，提高的幅     

枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的特性及补料研究

采用分离纯化的枯草芽孢杆菌进行产中性蛋白酶的研究,结果表明:适宜的碳源和氮源分别为玉米粉和豆粕粉;磷酸盐能提高酶产量;未添加Na2HPO4和KH2PO4的情况下,Ca2+和Mg2+对产酶都有抑制作用;Na2HPO4和KH2PO4存在时,1 mmol/L的Ca2+和Mg2+能使酶产量分别提高12%和8%,随着离子浓度的增加,产酶受到抑制;采用在11 h、18 h和24 h分别补加10 g/L玉米粉和7.5 g/L豆粕粉的补加策略,产量提高了96%,生产强度提高了112%。     

地衣芽孢杆菌A 产碱性蛋白酶的研究

研究从经过60Co 照射的东海香参水解液中分离出的地衣芽孢杆菌A 产碱性蛋白酶的产率、分离纯化与生化特性。经硫酸铵沉淀、DEAE- Sepharose 离子交换层析和Sephadex G-75 凝胶层析分离纯化后,碱性蛋白酶产率为5.8%;经SDS- PAGE 电泳测得其分子质量为35kD。酶的最适反应温度为50℃,最适pH 值为11,热稳定性较好。该蛋白酶具有一定的耐氧化能力。     

中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4产酶条件及部分酶学性质

采用稀释平板分离法从土壤中分离到一株产中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4．通过单因素碳、氮源以及正交试验确定了最佳产酶培养基配方，同时还研究了起始pH值、金属离子、接种量对产酶的影响以及温度、pH值、金属离子以及表面活性剂对酶稳定性的影响；以最佳培养基为发酵培养基，于37℃、160r／min振荡培养48h，酶活达2519．35U／mL；该酶最适作用温度为55℃，最适作用PH值为7．5，在pH7．5缓冲体系中，55℃反应60min后仍有50％的酶活力，Ca^2＋和表面活性剂对酶有一定的激活作用，但激活作用不明显。