A2β-酪蛋白的功能性及其在乳制品中应用的研究进展

牛奶中富含多种营养成分,包括蛋白质、脂质、碳水化合物等,每100 g牛奶中就含有3 g蛋白质,其中主要包括乳清蛋白和酪蛋白。β-酪蛋白占牛奶蛋白总量的24%～28%,其主要包括两种基因型：A1型与A2型。A1β酪蛋白经消化后产生的β-酪啡肽-7会导致人体消化功能紊乱、心血管疾病等不良反应。A2β-酪蛋白则产生较少甚至并不产生β-酪啡肽-7,在胃肠道消化、提高抗氧化功能、降低胆固醇浓度等方面具有益生作用。本文综述了β-酪蛋白基因型在人体内消化后所产生的影响,并阐述了A2β-酪蛋白的益生功能,讨论其对人体健康的作用。并从β-酪蛋白基因型在乳制品中的应用入手,阐述A2β-酪蛋白乳制品的研究进展,为今后乳制品中A2β-酪蛋白的功能研究提供指导意义。     

液相色谱-高分辨串联质谱法测定奶粉中A2β-酪蛋白及β-酪蛋白与乳清蛋白含量关系的研究

目的:建立奶粉中A2β-酪蛋白分离定量的液相色谱-高分辨串联质谱法,并利用婴儿配方奶粉中酪蛋白、乳清蛋白和总蛋白含量的关系,间接得到乳清蛋白含量。方法:样品经前处理后,采用ACQUITY UPLC HSS T_(3)柱(100 mm×2.1 mm×1.8μm),0.1%甲酸-水和乙腈为流动相,梯度洗脱分离。多反应离子监测模式定量测定其中的A2β-酪蛋白特征肽。结果:在0.02~2.0μmol/L范围内线性关系良好(r=0.9938)。在低、中、高三水平加标试验中,回收率在94.9%~98.7%,相对标准偏差在1.7%~3.7%,检出限为0.80 mg/100 g,可满足对奶粉中A2β-酪蛋白定量要求。采用该法对市售11批声称A2奶粉和18批未声称A2奶粉(以下简称A2奶粉和普通奶粉)中A2β-酪蛋白进行测定。结论:A2奶粉中A2β-酪蛋白占总β-酪蛋白含量的86.2%~98.7%,而普通奶粉则低至20.0%~50.0%。另外,乳清蛋白含量的间接测定值和理论计算值经统计分析,无明显差异(P>0.05),为分析婴儿配方奶粉中乳清蛋白含量是否符合国标要求提供参考。     

柑橘纤维添加量对搅拌型A2β-酪蛋白酸奶品质的影响

目的：研究不同柑橘纤维添加量对搅拌型A2β-酪蛋白酸奶品质的影响。方法：以酸奶酸度、粘度、持水力、脱水收缩敏感性和稳定性指数为指标,研究不同柑橘纤维添加量（0‰、0.3‰、0.5‰、0.7‰、0.9‰）对搅拌型A2β-酪蛋白酸奶的影响。结果：随着柑橘纤维添加量的增加,酸奶的酸度、粘度、持水力、脱水收缩敏感性和稳定性指数均发生变化,当柑橘纤维添加量为0.5‰时,产品酸度适中,粘度、持水力、脱水收缩敏感性较好,产品组织结构更稳定。结论：使用柑橘纤维作为稳定体系的原料,工厂产业化生产搅拌型A2β-酪蛋白酸奶时,柑橘纤维添加量至少应为0.5‰。     

A1与A2β-酪蛋白酸奶产品特性的比较

探究分别含有A1、A2两种β-酪蛋白牛乳制成的搅拌型和凝固型酸奶产品特性的区别。持水力结果表明,A1β-酪蛋白酸奶（凝固型和搅拌型）的持水力大于69%,A2β-酪蛋白酸奶（凝固型和搅拌型）的持水力大于65%。质构特性的结果显示,凝固型酸奶差距更为明显,A1 β-酪蛋白酸奶的硬度和稠度分别比A2 β-酪蛋白酸奶高41.4%和59.8%。此外,A1 β-酪蛋白酸奶黏性优于A2 β-酪蛋白酸奶。流变学特性与微观结构结果显示,A1 β-酪蛋白酸奶的滞后回路面积较A2 β-酪蛋白酸奶小14.6%,说明A2 β-酪蛋白制成的酸奶结构更易于被破坏,网状结构更为稀疏。本实验为A2 β-酪蛋白牛乳在酸奶制品的应用及实际生产提供一定理论支持。     

响应曲面法优化β-酪蛋白及其A1、A2型变异体检测方法的酶解条件

利用响应曲面法优化β-酪蛋白及其A1、A2型变异体超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法的酶解条件。将酶解设备（X1）、酶解时间（X2）和酶加入量（X3）作为影响因子,以A2型β-酪蛋白(Y1)、A1型β-酪蛋白(Y2)和β-酪蛋白总量（Y3）的质量浓度为评价指标。根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,针对检测方法中酶解反应这一关键步骤,通过单因素实验优选,响应曲面法研究酶解时间（X2）和酶加入量（X3）与A2型β-酪蛋白(Y1)、A1型β-酪蛋白(Y2)和β-酪蛋白总量（Y3）之间的关系。确定最佳酶解条件为：酶解设备（X1）为水浴摇床,酶解时间（X2）为2.5 h,酶加入量（X3）为15μL。     

A1/A2型β-酪蛋白检测方法研究进展

乳中最常见的β-酪蛋白主要分为A1型和A2型。A2型为原始β-酪蛋白,而A1型等变异体是源于DNA突变所导致的氨基酸序列发生变化。由于A1 β-酪蛋白基因型的个体牛具有较高的产奶量,因此在不断选育后产生了大量的A1型等变异体。但研究表明,A2 β-酪蛋白比A1 β-酪蛋白表现出更好的生物活性。目前已开发出了各种A2奶类产品,但其中的A1/A2型β-酪蛋白的检测方法还未标准化。就目前常见的A2 β-酪蛋白的检测方法进行了分类阐述总结,分别从分子、蛋白质水平以及代谢物差异等方面检测A2 β-酪蛋白或检测A2奶中是否存在A1 β-酪蛋白。这对未来创新、改进检测A2 β-酪蛋白的方法以及建立乳制品中A2 β-酪蛋白检测及定量分析提供理论参考,以期更好的便携式现场检测方法标准化地应用于现实。     

高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方乳粉中A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白含量

建立婴幼儿配方乳粉中A1、A2 β-酪蛋白的高效液相色谱-串联质谱测定方法。乳粉经尿素溶液溶解稀释,胰蛋白酶酶解,过膜后利用ACQUITY UPLC Peptide BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)色谱柱分离,0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈为流动相梯度洗脱,高效液相色谱-串联质谱仪测定。结果表明,A1、A2 β-酪蛋白在0.02～2.00 mg·mL^-1线性范围内,相关系数(R²)均≤0.99,检出限为0.05～0.10 g·kg^-1;定量限为0.2～0.5 g·kg^-1;平均回收率在92.08%～105.29%;平均相对标准偏差为1.5%～7.9%。随机选取了10个品牌的婴幼儿配方乳粉进行测定,得到A1 β-酪蛋白、A2 β-酪蛋白的含量在0～30.3 g·kg^-1。     

稳定同位素稀释-超高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定牛奶及牛源性婴幼儿配方乳粉中A1型和A2型β-酪蛋白含量

目的 建立基于纯化蛋白和稳定同位素稀释-超高效液相色谱-三重四极杆质谱法(ultra performance liquid chromatography coupled triple quadrupole mass spectrometry,UPLC-MS/MS)定性及定量测定牛奶及牛源性婴幼儿配方乳粉中A1和A2 β-酪蛋白变异体的分析方法。方法 首先将β-酪蛋白标准品中A1和A2 β-酪蛋白变异体在高效液相色谱仪上分离,通过各自的纯化蛋白确定两种变异体在标准品中的含量,再将试样中的β-酪蛋白经胰蛋白酶酶解成肽,经UPLC-MS/MS检测。通过筛选的特异肽段,经β-酪蛋白标准品及稳定同位素稀释内标法计算,获得试样中β-酪蛋白A1变异体和A2变异体的含量。结果 本研究采用的β-酪蛋白标准对照品中A1和A2 β-酪蛋白变异体含量分别为20.8%和55.1%,且在检测中标准曲线的线性相关系数均大于0.99,方法重现性中相对标准偏差为2.290%～4.720%。结论 本方法溯源性及精密度好,适用于牛奶及牛源性婴幼儿配方乳粉中两种β-酪蛋白变异体的测定。     

牛乳液酪蛋白的CO2沉淀分离

以CO2为沉淀剂,从牛乳液中分离酪蛋白,考察了牛乳液浓度、CO2压力和温度对酪蛋白产率的影响。结果表明,在相对低温的条件下,用低压CO2处理低浓度牛乳液,可以得到较高的酪蛋白产率。据此提出了可供参考的牛乳酪蛋白分离工艺条件:牛乳液浓度为1/40纯乳;CO2压力为0.5MPa;温度为10～25℃。      

液相色谱-高分辨串联质谱法测定奶粉中A2 β-酪蛋白及β-酪蛋白与乳清蛋白含量关系的研究

目的：建立奶粉中A2 β-酪蛋白分离定量的液相色谱-高分辨串联质谱法,并利用婴儿配方奶粉中酪蛋白、乳清蛋白和总蛋白含量的关系,间接得到乳清蛋白含量。方法：样品经前处理后,采用ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm×1.8 μm）,0.1%甲酸-水和乙腈为流动相,梯度洗脱分离。多反应离子监测模式定量测定其中的A2 β-酪蛋白特征肽。结果：在0.02~2.0 μmol/L范围内线性关系良好（r=0.993 8）。在低、中、高三水平加标试验中,回收率在94.9%~98.7%,相对标准偏差在1.7%~3.7%,检出限为0.80 mg/100 g,可满足对奶粉中A2 β-酪蛋白定量要求。采用该法对市售11批声称A2奶粉和18批未声称A2奶粉（以下简称A2奶粉和普通奶粉）中A2 β-酪蛋白进行测定。结论：A2奶粉中A2 β-酪蛋白占总β-酪蛋白含量的86.2%~98.7%,而普通奶粉则低至20.0%~50.0%。另外,乳清蛋白含量的间接测定值和理论计算值经统计分析,无明显差异（P>0.05）,为分析婴儿配方奶粉中乳清蛋白含量是否符合国标要求提供参考。     

牛乳β-酪蛋白检测的间接ELISA方法

将从干酪素中提取的牛β-酪蛋白对新西兰白兔进行多次皮下免疫注射.采集血清并用硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,以制备兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗体.最后将纯化的抗体用于间接ELISA法检测牛乳β-酪蛋白的含量.     

奶牛β-酪蛋白基因分型及A2型牛群培育技术研究进展

牛乳中β-酪蛋白含有多种变异体,其中A1β-酪蛋白（A1）和A2β-酪蛋白（A2）是其最常见的2种变异体。由于A1和A2蛋白在氨基酸序列上仅存在个别氨基酸的差异,因此通过常规的分离、纯化手段较难以实现纯度较高的A1和A2蛋白的制备。本研究利用分子生物学手段,分别构建含有CSN2-A1和CSN2-A2目的基因的重组质粒载体pET28a（+）-CSN2-A1和pET28a（+）-CSN2-A2。将构建的重组表达载体导入到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达和纯化。结果表明,在0.2 mmol/L IPTG,37 ℃下诱导表达4 h可获得大量蛋白,但通过SDS-PAGE电泳显示目的蛋白以包涵体形式表达,存在于细胞破碎后的沉淀中。通过洗涤、溶解、镍柱亲和色谱纯化、复性以及鉴定等步骤最终可获得纯度大于90%（PAGE）的A1和A2重组蛋白,从而为制备A1和A2蛋白提供新的途径。     

乳状液中αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的结构特点及吸附行为

乳状液界面处主要的酪蛋白成分是αs1-酪蛋白和β-酪蛋白.本文主要综述了这两种酪蛋白分子的结构特点并比较其差异,进一步阐述了pH、离子强度、分子聚合、未吸附粒子等因素对其吸附行为的影响.     

山羊β-酪蛋白的分离及其含量的测定

从呼和浩特市周边地区采集的新鲜山羊奶，通过离心脱脂，调节等电点沉淀蛋白，对所得沉淀物进行DEAE离子交换层析，分离出α-酪蛋白和β-酪蛋白，并且β-酪蛋白被完全纯化出来。建立ELIsA双夹心方法对β-酪蛋白的含量进行测定，该法可直接用于培养液中β-酪蛋白的定量分析。     

β-胡萝卜素/酪蛋白纳米复合物的形成及β-CE的生物利用率

β-胡萝卜素（β-CE）具有多种生物活性,但是不稳定,容易降解,利用酪蛋白（CN）对β-胡萝卜素进行自组装能够对其起到保护作用,从而提高β-胡萝卜素在食品工业中的利用价值。本文以β-CE/CN形成纳米复合物为背景,研究了其形成的影响因素、粒径分布以及β-CE的生物利用率。结果表明,β-CE/CN纳米复合物的形成受温度与β-CE/CN质量比的影响较大,β-胡萝卜素经酪蛋白自组装后,其水溶解性提高。经体外消化实验,β-CE/CN纳米复合物经胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解后,酶解产物经SDS-PAGE分析,酪蛋白随着酶解时间的延长其水解程度增加,因此β-CE从纳米复合物中更易释放出来,其生物利用率提高。      

香菇素与β-酪蛋白的相互作用研究

目的 研究β-酪蛋白与风味物质香菇素相互作用的具体机制, 阐明相互作用对β-酪蛋白结构及微环境产生的影响。方法 构建香菇素-β-酪蛋白互作模型体系, 经荧光光谱法、紫外-可见分光光度法、圆二色光谱、等温滴定及气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法对香菇素与β-酪蛋白的相互作用进行检测分析。结果 气相色谱-质谱法检测结果表明, β-酪蛋白对香菇素起到显著缓释的作用, 光谱法检测结果及等温滴定结果表明, β-酪蛋白和香菇素的结合主要由疏水相互作用驱动, 热量变化焓值(ΔH)为7.25 kJ/mol, 熵值(ΔS)为113.20 J/(mol·K)。结论 香菇素与β-酪蛋白发生了疏水相互作用。在相互作用过程中, β-酪蛋白发生了静态荧光淬灭, 紫外光谱蓝移以及β-酪蛋白甲基化位点的改变证明了相互作用影响了β-酪蛋白的结构以及微环境极性。     

多酚氧化酶交联β-酪蛋白的抗原性变化初步研究

利用多酚氧化酶催化牛乳β-酪蛋白交联,并通过ELISA方法检测交联前后β-酪蛋白抗原性的变化。SDS-PAGE结果显示,多酚氧化酶可以有效地催化β-酪蛋白交联。同时,间接竞争ELISA检测的β-酪蛋白交联后的半抑制浓度(IC50值)由2.63μg/mL变为4.07μg/mL,表明交联后β-酪蛋白抗原性明显降低。本研究工作为通过多酚氧化酶交联制备低致敏性乳制品提供了部分理论依据。     

多酚氧化酶交联β-酪蛋白的抗原性变化初步研究

利用多酚氧化酶催化牛乳β-酪蛋白交联,并通过ELISA方法检测交联前后β-酪蛋白抗原性的变化。SDS-PAGE结果显示,多酚氧化酶可以有效地催化β-酪蛋白交联。同时,间接竞争ELISA检测的β-酪蛋白交联后的半抑制浓度（IC50值）由2.63μg/mL变为4.07μg/mL,表明交联后β-酪蛋白抗原性明显降低。本研究工作为通过多酚氧化酶交联制备低致敏性乳制品提供了部分理论依据。      

果胶结构特征对果胶-β-酪蛋白复合体系性质的影响

本文研究了果胶结构特征对果胶-β-酪蛋白复合体系性质的影响,将6种结构特征（半乳糖醛酸含量GA、酯化度DM、酰胺化度DA、分子质量Mw）的果胶（L13、L101、L102、L104、H121和H150）与β-酪蛋白复合,采用动态光散射、ζ电位、荧光光谱和圆二色谱等方法考察果胶结构特征对果胶-β-酪蛋白复合体系的粒径、电位、二级结构、溶解性、乳化性和起泡性的影响,最后采用多元线性回归分析评价果胶各结构特征对果胶-β-酪蛋白复合体系性质影响的贡献程度。研究表明：果胶与β-酪蛋白发生静电相互作用形成复合体系,果胶的添加改变了β-酪蛋白的分子结构。相比β-酪蛋白而言,所有果胶与β-酪蛋白复合体系具有更高的乳化和起泡能力。多元线性回归表明：溶解性和乳化性与GA、DM和DA呈正相关,与Mw呈负相关,DA对两者的影响最大,Mw对两者的影响最小;起泡性与GA和DM呈正相关,与DA和Mw呈负相关,DA对其影响最大,Mw对其影响最小。     

原料乳中产β-内酰胺酶菌株的快速筛选和鉴定

利用青霉素-藤黄微球菌-TSA培养基建立一种快速筛选原料乳中产β-内酰胺酶细菌的方法,该筛选方法比常规方法更加便捷,易于观察,并且具有很高的特异性分离鉴别能力,同时通过细菌16S rDNA序列比对方法来鉴定所分离的产酶菌的种属。结果表明,原料乳中存在产β-内酰胺酶的菌株,主要产酶菌为大肠杆菌。