RAPD标记在烟草研究中的应用

随机扩增多态DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNAs,RAPD)分子标记技术的诞生,为分子生物学技术在农业研究中的应用注入了新的活力,并为传统农业研究向分子水平发展提供了捷径。本文重点综述了RAPD分子标记技术在烟草群体分离分析和鉴定、标记辅助选择、遗传变异的识别、烤烟品种分子指纹分析、黑胚病菌全基因组DNA多态性标记、根结线虫种类鉴定、赤星病菌的分类地位等方面的研究进展,以及这些领域的研究发展和应用前景。      

烟草靶斑病菌基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化

采用改良的CTAB法,对16个烟草靶斑病菌菌株进行基因组DNA的提取,所得的DNA样品的OD26o/OD280值在1.76～1.89之间,电泳主带清晰,无弥散、拖尾现象,DNA质量较高.通过单因素和正交设计结合的方法对影响RAPD-PCR反应的主要因子Mg2+,dNTP,引物的浓度和模板DNA,Taq酶的用量进行了优化,建立了适宜于病菌的RAPD分子标记的最佳反应体系.优化的反应体系为:模板DNA 10 ng,Mg2+浓度3.25 mmol/L,dNTP浓度0.175 mmol/L,Taq酶1.4 U,引物浓度0.5 μmol/L,反应体系总体积为25 μL.通过该反应体系可以获得清晰、稳定、特异性的分子标记谱带,扩增结果较好.     

烟草品种的SCAR标记鉴别

利用6对SCAR引物对12个烟草(Nicotiana tabacum L.)品种复烤叶片的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增分析。根据6个SCAR标记在不同烟草品种中的扩增差异,建立了12个烟草品种的分子ID和鉴别路线,分析了SCAR标记鉴别遗传差异较小烟草品种的可行性。结果表明:利用组合标记策略,6个SCAR标记可准确地区分12个烟草品种中具有相同抗感性,亲缘关系较近的烟草品种,并可用于复烤叶片的品种鉴定。     

烟草青枯病抗性基因的遗传分析及RAPD标记

选用高感青枯病品种"红花大金元"与高抗青枯病品种"Ti448A"配制杂交组合,采用温室苗期叶片人工注射法接种鉴定两亲本及其杂交后代F₁、F₂、BC₁P₁代的青枯病抗性表现,结果表明抗病亲本材料Ti448A的抗病性由一对显性基因控制。依据混合群体分组分析法(BSA)建立抗青枯病基因池和感青枯病基因池,通过RAPD试验,从近200个随机引物中筛选出一个在两池间具有多态性的引物S503,用双亲、F₁、F₂单株DNA进行RAPD试验证明了该引物扩增出的特异性片段S503-750是一个与抗青枯病基因连锁的RAPD标记,利用JOINMAP (version 1.4)软件计算得此标记与抗青枯病基因间的重组率为5.984%,连锁距离为6.261 cM。      

烟草SSR反应体系的优化

以烤烟品种NC2326、G28及其F1为材料,研究了烟草SSR分析中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响。结果表明:在总体积为20μL的PCR反应中,含20ng模板DNA,1.5U TaqDNA聚合酶,MgCl2终浓度为1.5mmol.L-1,dNTPs浓度为200μmol.L-1,引物浓度为0.25μmol.L-1时效果较好。     

我国烟草品种资源保存体系简述

至１９９６年，我国已有２７９８份烟草品种资源安全保存于国家长期种质库，有３０００多份分别保存于本所中期库和临时供种库，另外还拥有约３兆字节的烟草种质资源数据库及管理系统。现已形成了较完整的烟草品种资源保存体系。这标志着我国烟草品种资源管理达到了现代化水平     

烟草RAPD分析影响因子初探和优化程序

以烤烟品种Hicks和Speight G-28为材料,针对烟草RAPD分析中PCR过程的Taq酶浓度、Mg∧2 浓度、退火温度、循环数、Primer浓度、dNTP浓度等因素进行了研究。结果表明,体系中含0.8U Taq酶,40mmol/L MgCl2,10μmol/L引物,3.0mmol/L dNTP,循环数为40,退火温度36℃效果较好,从而确立适合烤烟RAPD分析的PCR程序主要条件,为RAPD技术应用于烟草的品种鉴定与品种资源研究奠定了基础。     

桑黄DNA提取及RAPD反应体系的优化

以桑黄菌丝体为实验材料,采用CTAB法与SDS法提取DNA,并对RAPD反应体系进行优化。结果表明,应用CTAB法提取的DNA纯度和完整性较好,在此方法上建立了桑黄RAPD反应最佳体系(25μL):模板DNA1.0μL,引物0.8μL,dNTPs0.6μL,Taq聚合酶0.3μL,Buffer2.5μL,ddH2O19.8μL,并通过正交实验验证了该反应体系的稳定性和通用性。PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,40℃退火1min,72℃延伸1.5min,45个循环,72℃最终延伸5min。      

基于RAD-seq数据开发烟草多态性SSR标记

采用RAD-seq技术对两份烟草材料"118-3"和"粤烟98"进行简化基因组测序,分别获得45 119 346和50 360 738个高质量干净读长（HQ clean reads）。通过序列分析,在22 145个reads覆盖的参考基因组序列中共检测到25 343个SSR位点,其中以二和三核苷酸重复基序最为丰富,占总SSR位点的71.59%;除单核苷酸类型外,SSR基序的重复次数主要集中在4~9之间。根据SSR位点两翼的序列,利用Primer 3.0成功设计出23 346对SSR引物,引物设计的成功率为92.12%。依据测序数据初步发现这些SSR中有323个（1.38%）SSR在两份测序材料间具有多态性,随机选择其中50个SSR在4份烟草材料中进行验证,结果发现在两份测序材料间的多态率为76%,存在24%的假阳性;在另两份烟草材料中多态率为20%。研究结果表明,利用简化基因组测序技术能够开发大量SSR标记和发现样品间具有多态性的SSR标记,可为SSR标记的开发和应用提供基础。     

桑黄DNA提取及RAPD反应体系的优化

以桑黄菌丝体为实验材料,采用CTAB法与SDS法提取DNA,并对RAPD反应体系进行优化。结果表明,应用CTAB法提取的DNA纯度和完整性较好,在此方法上建立了桑黄RAPD反应最佳体系(25μL):模板DNA1.0μL,引物0.8μL,dNTPs0.6μL,Taq聚合酶0.3μL,Buffer2.5μL,ddH2O19.8μL,并通过正交实验验证了该反应体系的稳定性和通用性。PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,40℃退火1min,72℃延伸1.5min,45个循环,72℃最终延伸5min。     

复烤烟叶RAPD反应体系优化研究

以复烤烟叶为实验材料,对烟草RAPD分析过程中的主要影响因素进行研究,获得了清晰的DNA条带.确立了最适RAPD反应体系,即20μL反应体系中,模板40 ng,Mg2+1.5 mM,dNTP0.13 mM,引物0.30 μM,Taq DNA聚合酶1.25 U;37℃退火30 s.该反应体系为烟叶品种的合理利用及分子标记研究提供了可靠的理论依据和技术支持.     

烤烟品种的RAPD引物筛选

本试验筛选出了45个引物,可产生遗传多样性,其中OPA-08、OPA-16、OPC-10、OPC-12、GENMES'S 36号、78号、112号、181号引物其扩增结果稳定性好、多态性强。这些引物的RAPD扩增结果都可作为烟草烤烟品种的遗传多样性分析、基因定位及分子标记等。经凝胶电泳比较,GENMED'S 36号引物可作为烟草品种的最适宜的引物;1.8kb条带被初步认为与抗黑胫病基因相关。这些结果为以后对烟草烤烟品种在分子水平上的研究奠定了基础,加速烟草烤烟品种分子水平上的研究进程      

烤烟品种的RAPD分析

利用RAPD标记研究了29个烤烟品种的分子指纹和遗传关系。100个随机引物经10个品种筛选,选出18个随机引物对29个品种基因组DNA进行扩增,得到了29个烤烟品种的分子指纹图谱,参照这些图谱,可对不同烤烟品种进行真实性鉴定。以扩增到的79条多态性DNA片段为基础计算29个品种间遗传相似系数,利用UPGMA法作聚类图,可将参试品种分为3个类群。云南省主栽品种K326与近年选育的品种V2、云烟85、云烟317等被归为一类,遗传基础过于狭窄,建议选用一些遗传关系较远的品种进行亲本选配、品种布局;北方烟区主栽品种NC89、地方品种净叶黄及G140等则归为另一类。      

部分烟草核心种质RAPD分析

本研究对24个不同类型烟草核心种质进行了RAPD标记。通过43个RAPD引物PCR扩增的214个分子量不同的DNA片段,标记出24个烟草核心种质的指纹图谱,表现了高度的遗传多样性。通过聚类分析,将24个种质分为6大聚类群,类群Ⅰ包含11种质,其中烤烟5个,晒烟3个,白肋烟2个,雪茄烟1个;类群Ⅱ包含9个种质,其中烤烟2个,晒烟2个,白肋烟2个,香料烟2个,马里兰烟1个;类群Ⅲ、Ⅴ,分别包含晒烟、黄花烟各1个;Ⅳ、Ⅵ为2个野生种。各类群遗传差异由大到小顺序为Ⅵ > Ⅴ > Ⅳ > Ⅲ > Ⅱ > Ⅰ。种质间的遗传差异并不完全取决于栽培类型间的差异,而与种质间演化关系有关,野生种与栽培种间存在较大的遗传差异。      

葡萄RAPD不同电泳指纹特点及其用于葡萄品种鉴定的评价

为更好地将快速简便的RAPD技术应用于葡萄品种资源的鉴定以及遗传基础的研究,本文以18个葡萄品种为试材,对琼脂糖凝胶电泳以及聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测RAPD的PCR扩增产物的效果进行了比较.结果表明,PAGE检测出的谱带总数量以及多态性谱带数量均高于前者;PAGE电泳指纹信息能够更好地鉴定葡萄品种.同时对随机挑选的片段进行克隆与测序发现,这些片段都是对应引物的RAPD扩增产物.     

Reliable identification of grapevine rootstock varieties using RAPD PCR on woody samples

Since grapevine ( Vitis spp .) rootstock material is being traded increasingly as disbudded woody material a lack of distinctive morphological features on such material necessitates an alternative and reliable means of identification. Methods described here were developed for rapid and efficient extraction of DNA from woody samples rich in phenolic compounds and polysaccharides, and for subsequent identification of varieties by RAPD PCR. Using these methods, and with the application of only one selected RAPD primer, we were able to differentiate sixteen rootstock varieties, including the seven varieties most commonly used in Germany. Problems commonly encountered with reproducibility of RAPD patterns were avoided by choosing primers with a dinucleotide sequence and a high G/C content that allowed a rather high annealing temperature of 45°C. Methods described here should also be useful for other horticultural crops, especially those with woody tissues rich in phenolic compounds and polysaccharides.