胆盐水解酶基因在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达胆盐水解酶(Bile salt hydrolase,BSH)基因。方法以重组质粒pMD18-BSH为模板,PCR扩增BSH基因,克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA上,经AvrⅡ线性化,电转化至毕赤酵母SMD1168,PCR筛选阳性重组子,诱导表达,表达产物经Western blot进行分析。结果重组表达质粒pGAPZαA-BSH经双酶切及测序证明构建正确;经PCR鉴定阳性的重组酵母菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约35000的目的蛋白表达条带;表达的重组蛋白可与兔抗植物乳杆菌多克隆抗体发生特异性反应。结论在毕赤酵母中成功表达了BSH,为BSH结构与相关功能及高效降解胆固醇的基因工程菌株的研究奠定了基础。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

目的克隆猪血清白蛋白(PSA)基因,并在毕赤酵母中分泌表达。方法Trizol法提取新鲜猪肝组织总RNA,经RT-PCR扩增PSA全长cDNA,克隆至酵母分泌型表达载体pPICZaC,构建重组表达质粒pPICZaC-PSA,电转化至毕赤酵母X33,甲醇诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒pPICZaC-PSA经双酶切及测序鉴定正确,表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约69500处可见特异条带,表达量为菌体总蛋白的29.5%,紫外吸收法测定蛋白含量为0.06mg/ml,并可与PSA多抗发生特异性反应。结论已成功克隆了PSA基因,并在毕赤酵母中获得表达。     

抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。     

共表达蛋白二硫键异构酶对IFNβ-HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响

目的探讨共表达蛋白二硫键异构酶(PDI)对干扰素β与人血清白蛋白(IFNβ-HSA)融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响。方法根据GenBank公布的毕赤酵母PDI序列设计引物,利用PCR方法从毕赤酵母基因组中扩增目的基因片段,插入表达载体pPICZαA,并整合入融合蛋白(IFNβ-HSA)基因工程菌中,筛选共表达PDI的重组酵母菌,甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA法检测IFNβ-HSA的表达量。结果经PCR鉴定,重组表达质粒pPICZαA-PDI已转入毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA中。经SDS-PAGE分析,PDI在菌体内大量表达,原始菌株和共表达菌株均明显表达融合蛋白IFNβ-HSA,共表达PDI菌株表达量提高了60%,ELISA法测定达(22.49±3.52)mg/L。结论共表达PDI能促进外源蛋白的分泌表达,为进一步研究在毕赤酵母中过量表达分子伴侣对其分泌外源蛋白的影响奠定了基础。     

拷贝数对毕赤酵母重组菌表达猪胰岛素前体的影响

通过5 L发酵罐补料分批培养,分析了猪胰岛素前体(PIP)基因拷贝数对毕赤酵母生长、细胞存活率和基因稳定性的影响.结果表明,在甘油阶段和甲醇诱导初期拷贝数对毕赤酵母的生长无显著影响,但在甲醇诱导24 h后高拷贝数毕赤酵母菌株(12拷贝重组菌A2和18拷贝重组菌A3)的比生长速率明显比低拷贝数菌株(1拷贝重组菌G1和6拷...     

乙酰肝素酶大亚基在毕赤酵母中的表达

目的构建乙酰肝素酶(HPA)大亚基片段真核表达质粒,并在毕赤酵母中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的HPA大亚基基因序列设计引物,PCR方法扩增肝素酶基因,构建毕赤酵母真核表达质粒pPICZαA-HPA。电击穿孔法转化感受态毕赤酵母SDM1168,斑点免疫印迹法筛选重组菌株,PCR法鉴定阳性克隆。甲醇诱导表达重组蛋白,Western blot鉴定表达产物。结果构建的重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;斑点免疫印迹法筛选出的9个单菌落经PCR扩增,均可见1161bp的目的基因条带;表达产物经Western blot分析,具有良好的反应原性,表达量约为5μg/L。结论已成功构建了HPA大亚基片段真核表达质粒pPICZαA-HPA,并在毕赤酵母SDM1168中分泌表达了HPA大亚基。     

猪干扰素α基因的克隆与真核表达

目的克隆猪干扰素α(IFNα)基因,并在毕赤酵母中进行表达。方法用植物血凝素诱导猪外周血中的淋巴细胞,Trizol试剂提取总RNA,经RT-PCR扩增猪IFNα基因,将其克隆至pPIC9K载体中,构建重组真核表达质粒pPIC9K-IFNα,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,电转化至毕赤酵母GS115中。筛选阳性菌株,经甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果RT-PCR扩增获得521bp的猪IFNα基因;所构建的重组表达质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为19000,可溶性蛋白约占菌体总蛋白的13%;该蛋白能与相应抗体产生特异免疫反应。结论已成功克隆并在毕赤酵母中表达了猪IFNα基因,为进一步研究其生物学性状奠定了基础。     

白细胞介素-10基因多拷贝表达盒的构建及在毕赤酵母中的表达

目的构建白细胞介素-10(IL-10)基因多拷贝表达盒,提高IL-10在毕赤酵母中的表达水平。方法体外构建重组表达载体αIL-10/pAO815,BamHⅠ和BglⅡ双酶切获得目的基因表达盒(AOX-αIL-10),再连接到BglⅡ酶切位点处,依次构建多拷贝重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815。从质粒pPIC9K上用NdeⅠ和SalⅠ双酶切获得Kan抗性基因,重组到多拷贝表达载体n(AOX-αIL-10)/pAO815上。重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815电转化毕赤酵母,PCR筛选含有IL-10基因的酵母转化子,甲醇诱导表达,对表达量高的转化子再次经重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815-Kan电转化,高浓度G418抗性筛选二次酵母转化子,使用甲醇诱导表达。ELISA测定IL-10含量,MC/9细胞测定IL-10活性。结果所构建的8拷贝表达盒的重组载体8(AOX-αIL-10)/pAO815和4拷贝表达盒4(AOX-αIL-10)/pAO815-Kan,转化子分泌表达IL-10水平最高,为(8.25±1.65)mg/L,比活性为1.465×105U/mg。结论已成功构建了高拷贝表达盒,并提高了IL-10在毕赤酵母中的表达水平。     

重组HBsAg在汉逊酵母中的分泌表达

目的构建重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)分泌型汉逊酵母工程菌株,并进行诱导表达。方法在HBsAg基因前加酿酒酵母α前导肽(MFα)基因序列作为信号肽,将整个序列优化为汉逊酵母优选密码子,采用搭桥PCR方法分别合成后,通过1对引物PCR法融合在一起。将融合基因插入汉逊酵母穿梭质粒pDGXHP2.0的甲醇氧化酶基因(MOX)启动子下游,构建成多拷贝分泌型重组表达载体。将其电转化多型汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌ATCC34438(Ura3-),筛选分泌表达HBsAg的汉逊酵母工程菌株,并比较在YPD、BMMY、MM3种培养基中分泌表达HBsAg的水平,ELISA检测培养上清液中HBsAg的表达量,透射电镜观察类病毒颗粒(VLPs)。结果构建了HBsAg汉逊酵母多拷贝表达质粒pDGXHP2.0-2MFα-HBsAg和pDGXHP2.0-4MFα-HBsAg,筛选获得了分泌表达HBsAg的汉逊酵母HP/2MFα-HBsAg和HP/4MFα-HBsAg。经诱导,工程菌株在YPD培养基中分泌表达的HBsAg量高于在BMMY和MM中的表达量;ELISA定量检测表达量最高可达10μg/ml,培养上清液经透射电镜观察,形成了VLPs。结论HBsAg在汉逊酵母中能够分泌表达,并能形成VLPs,但表达量低于胞内表达量。     

SARS病毒S2蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究用毕赤酵母菌表达SARS病毒S2蛋白亚单位。方法依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成SARS病毒刺突蛋白S2亚单位的基因(1590bp),再与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-S2,转化毕赤酵母GS115,并经MD和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-S2。经诱导、表达,并对表达产物进行分析、鉴定。结果所构建的重组质粒pPIC9K-S2正确,在毕赤酵母中可高效表达,其表达产物与阳性SARS血清产生特异性反应。结论SARS病毒刺突蛋白S2亚单位可在毕赤酵母中高效表达,产物具有良好的抗原特异性。     

人巨细胞病毒pp65基因在毕赤酵母中的表达

目的构建表达人巨细胞病毒(HCMV)pp65336-507基因的毕赤酵母工程菌。方法扩增HCMVpp65336-507基因,构建重组表达质粒pPIC9/pp65336-507,转化毕赤酵母菌GS115。PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE及Westernblot鉴定表达产物。结果已构建和筛选到阳性表达克隆株,表达的pp65336-507蛋白的相对分子质量约为26000,能与特异的pp65抗体结合。结论已成功构建了分泌表达pp65336-507蛋白的毕赤酵母工程菌,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。     

人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性

目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。     

人脑钠肽与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

目的在毕赤酵母中表达重组人脑钠肽(BNP)与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白,并检测其活性。方法重叠PCR法拼接BNP二联体与HSA基因,插入表达载体pPIC9K,电穿孔法转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定及活性检测。结果融合基因(BNP)2-HSA经测序正确,重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确。诱导72h,融合蛋白表达量最高,可达200mg/ml,且具有良好的反应原性,其活性为rhBNP标准品的1%。结论已在毕赤酵母中成功表达了具有一定生物活性的(BNP)2-HSA融合蛋白,为开发BNP长效药物奠定了基础。     

重组人血管内皮生长因子165b在毕赤酵母中的表达及纯化

目的在毕赤酵母中表达重组人血管内皮生长因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF)165b(rhVEGF-165b),并进行纯化。方法 PCR扩增hVEGF165b基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b,SalⅠ酶切线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。表达产物经Ni-NTA sephrose镍柱纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b经双酶切和测序,证明构建正确;表达的rhVEGF165b蛋白相对分子质量约为23 000,纯化后纯度达90%以上,具有人VEGF的抗原性。结论成功在毕赤酵母中表达了rhVEGF165b蛋白,纯化的蛋白纯度较高,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型L1/E7嵌合基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的克隆人乳头状瘤病毒16型(HPV16)L1/E7嵌合蛋白基因,并在毕赤酵母中表达。方法PCR扩增HPV16L1/E7基因,并克隆至毕赤酵母表达载体pPIC-3·5K和pPIC-9K中,构建含HPV16L1/E7基因的pPIC3·5K-HPV16L1/E7和pPIC9K-HPV16L1/E7重组表达载体,经测序证实插入的外源基因读码框正确后,分别转入GS115和KM71菌株中,筛选阳性转化菌株,经PCR鉴定,甲醇诱导表达HPV16L1/E7嵌合蛋白,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定,电镜观察,并经离心法纯化VLPs。结果HPV16L1/E7基因已成功插入pPIC-3·5K和pPIC-9K载体中,共获得6株KM71HPV16L1/E7-pPIC3·5K、5株GS115HPV16L1/E7-pPIC3·5K、1株KM71HPV16L1/E7-pPIC9K和2株GS115HPV16L1/E7-pPIC9K阳性转化菌株,并可表达相对分子质量约为69000的蛋白,与预期值一致。表达量约为0·35~1·04mg/ml。Westernblot显示该蛋白可与抗-HPV16L1蛋白和抗-HPV16E7蛋白的单克隆抗体特异性结合。在透射电镜下可观察到VLPs的形成,其形态与HPV16天然病毒颗粒相似。经纯化的目的蛋白纯度接近100%。结论已成功构建了pPIC3·5K-HPV16L1/E7和pPIC9K-HPV16L1/E7重组表达载体,阳性转化菌株可表达结构与野生型HPV16一致的VLPs。     

圆弧青霉碱性脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达

目的在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效表达圆弧青霉碱性脂肪酶(Alkaline lipase,LipⅠ)。方法采用RT-PCR法从圆弧青霉PG37中扩增lipⅠ基因的cDNA片段,克隆入表达质粒pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-lipⅠ,转化入毕赤酵母GS115,筛选高拷贝重组子GS115/lipⅠ,甲醇诱导表达,并对诱导表达条件进行初步优化。结果 GS115/lipⅠ在培养基初始pH6.0,甲醇添加量1.0%的BMMY培养基中,于30℃诱导96h,发酵液上清中LipⅠ的活性为10.5U/ml。在培养基初始pH9.0,甲醇添加量1.0%的BMMY培养基中,24℃诱导120h,GS115/lipⅠ发酵液上清中LipⅠ的活性最高,达407U/ml。结论在毕赤酵母GS115中高效表达了具有活性的圆弧青霉LipⅠ。     

HSV-1 stocker株糖蛋白G基因膜外区毕赤酵母表达载体的构建及序列分析

目的构建Ⅰ型单纯疱疹病毒型特异性包膜糖蛋白G基因膜外区毕赤酵母表达载体,并进行序列分析。方法PCR扩增HSV-1-gG基因的膜外区,克隆于pGEM-T载体,转化DH5α,提取质粒酶切鉴定后,与pPIC9K载体连接,转化DH5α,筛选阳性克隆,鉴定后转化GS115菌,构建酵母表达载体。对克隆的序列进行分析,预测表达产物的理化特性、抗原性及表达形式。结果获得的重组酵母表达载体pPIC9K-gG,测序结果证实为HSV-1-gG基因,序列分析其高度保守,预测蛋白相对分子质量15870,等电点pI为4.72,包含全部膜外区分值达1.7的6个强抗原决定簇,将以可溶性形式分泌表达于胞外。结论已成功构建HSV-1stocker株糖蛋白G基因膜外区毕赤酵母表达载体。