D-阿洛酮糖酶法生产的研究进展

稀有单糖D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体,主要通过D-塔格糖3-差向异构酶或D-阿洛酮糖-3-差向异构酶对D-果糖进行异构化获得。D-阿洛酮糖不仅可以作为食品添加剂和膳食补充剂,而且具有改善胰岛素抵抗、增强抗氧化和降血糖控制等多种生理功能。因此,D-阿洛酮糖作为传统高能量糖如蔗糖、果糖等的健康替代品,具有重要的研究价值。作者综述了D-阿洛酮糖的理化性质、来源、体内代谢、生理功能、应用和最新生产技术,讨论了D-阿洛酮糖生产中存在的问题及解决方案。针对低废物生成、低能耗、高糖产量等特点,提出了一种绿色、可循环利用的D-阿洛酮糖生产工艺技术。     

共固定化生产高含量低聚果糖的研究

生产低聚果糖过程中，副产物葡萄糖抑制酶反应，降低了产物中低聚果糖的含量。本文采用两种固定化方法，通过去除或转化葡萄糖，从而制备出高含量的低聚果糖。首先以２％戊二醛和０．１％丹宁于２０℃时处理固定化黑曲霉菌体与葡萄糖氧化酶，将菌体与酶共包埋得到固定化颗粒，所得到的共包埋产物于５０℃ｐＨ５．０条件下与５０％蔗糖溶液摇瓶反应２４ｈ，得到７１％的低聚果糖；又采用固定化黑曲霉增殖细胞与固定化葡萄糖异构酶协同作用方法，将５０％蔗糖溶液通入柱式反应器，连续生产得到高含量低聚果糖，产物中低聚果糖和果糖含量分别为６３％和１６％。     

D-阿洛酮糖合成及偶联酿酒酵母发酵的研究

该研究利用含有组成型启动子的质粒pET-20b载体,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中对3种D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行异源表达,其后以D-果糖为底物进行静息细胞转化。结果表明,重组菌在摇床30 ℃、200 r/min转速下发酵48 h,能够利用D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖,转化率分别达到27.56%、23.99%和25.98%。为降低D-果糖对D-阿洛酮糖纯化过程中的影响,在产糖的过程后偶联酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）好氧发酵过程,消耗掉混合糖液中的D-果糖,结果显示转化24 h后D-果糖去除率达到94.22%,该研究为下游D-阿洛酮糖的分离和纯化提供了新的思路。     

Aspergillus ficuum菊粉酶的分离纯化及其酶解菊粉制备低聚果糖

采用硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、DEAE-Cellulose离子交换色谱等分离纯化技术，从Aspergillus ficuum菌株混合酶系中分离得到4种菊粉酶组分，应用薄层层析法分离各组分水解菊粉的产物，发现其中3种组分主要含外切菊粉酶，一种主要含有内切菊粉酶。进一步对所得到的内切菊粉酶组分酶解菊粉制备低聚果糖进行了研究，研究了底物浓度、加酶量、反应温度和反应pH对低聚果糖制备的影响，确定其最适反应条件为：底物浓度50g／L、加酶量10U／g底物，反应温度45℃，反应PH6．0。在此条件下反应72h，菊粉酶解率达74％，低聚果糖得率可达50％以上，酶解产物以DP2～DP4为主。     

利用酵母提高低聚果糖纯度

将黑曲霉AS0023生产的果糖转移酶作用于底物蔗糖,可制备含量为55%的低聚果糖,但该产品中亦含有30%的副产物葡萄糖.利用酵母消化低聚果糖产品中的葡萄糖,可生产高纯度低聚果糖.将筛选得到具有较弱转化酶活性的酵母SK2.003,经培养后添加于总糖浓度为20%的低聚果糖中,经30℃、250r/min反应24h,制得纯度为80.24%的低聚果糖.     

枯草芽孢杆菌全细胞转化高效合成D-阿洛酮糖

D-阿洛酮糖是一种重要的稀少糖,在食品、化妆品和医药等领域都有着广泛的应用价值。目前,工业上生产D-阿洛酮糖以生物酶法为主。由于传统酶法存在步骤烦琐、成本高、产物纯化分离难等缺点,已难以满足工业生产需要。近年来,全细胞合成体系以其低成本、便操作、易分离等特点受到人们的关注。以一种来源于Caballeronia insecticola的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)为研究对象,实现了在生产安全菌株枯草芽孢杆菌WB800中的高效异源表达,并以D-果糖为底物全细胞催化合成D-阿洛酮糖。为了提高DAEase的表达量,通过设计构建含有不同组成型启动子的重组菌株对其表达进行了优化。并对全细胞反应体系的条件(温度、pH值、金属离子、细胞浓度)进行了优化,探究了不同底物浓度下D-果糖的转化效率。结果表明：启动子P_ylbP介导下的重组DAEase在枯草芽孢杆菌WB800内具有较高的表达水平,重组DAEase全细胞反应的较适温度为65℃,较适pH值为9.5,较适金属离子为5 mmol/L Mg²⁺。采用全细胞方法以500 g/L D-果糖为底物制备D...     

Clostridium scindens ATCC35704中的D-塔格糖-3-差向异构酶的克隆表达、纯化及活性研究

D-阿洛酮糖作为一种新型低热量功能性甜味剂,可以通过D-塔格糖-3-差向异构酶家族,以D-果糖为底物C-3位异构化得到。一个新的来源于微生物Clostridium scindens ATCC 35704中ZP 0243228的D-塔格糖-3-差向异构酶基因(CS-DTE),通过克隆并成功导入E.coli BL21(DE3)中,构建了基因重组菌,诱导目的重组基因过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析,在约31 ku处出现显著的特征蛋白条带;通过对其活性检测表明,该重组酶分别以D-塔格糖和D-果糖为底物,可以生成D-山梨糖和D-阿洛酮糖,转化率分别为8.6%和27.9%。     

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、 结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E.coliBL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/LIPTG诱导E.coliBL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。     

D-阿洛酮糖3-差向异构酶的异源表达和酶学性质

克隆了来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因,利用重叠延伸PCR技术在Cb-dpe基因的上游加入了P43启动子,形成P43-Cb-dpe,再将P43-Cb-dpe连接到p MA5载体上构建出双启动子表达载体,并导入到Bacillus subtilis WB800中进行表达;与单启动子表达系统相比,双启动子表达载体能够显著提高Cb-dpe的表达量。对重组Cb-DPE酶进行了分离纯化和酶学性质的研究,结果表明:重组Cb-DPE的最适温度为55℃,最适pH为7.0,在温度30~40℃范围内和pH 6.5~7.5之间有良好的稳定性;Co~(2+)、Mn~(2+)可显著增强酶活;D-阿洛酮糖为底物时,K_m为26.68 mmol/L,小于果糖的61.80 mmol/L,说明该酶对D-阿洛酮糖的亲和性比对D-果糖的高。而在动力学参数方面,以D-阿洛酮糖为底物对应的催化效率K_(cat)/K_m为95.8 L/(mmol·min),大于以果糖作为底物时的54.1 L/(mmol·min)。     

利用重组大肠杆菌和马克斯克鲁维酵母高效催化合成D-阿洛酮糖

提出了一种高效、低成本的两阶段生产D-阿洛酮糖的生产工艺。第一阶段,构建异源表达Flavonifractor plautii D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组大肠杆菌用于转化果糖,实现D-阿洛酮糖的全细胞生物合成。重组大肠杆菌在pH 7.5、65℃条件下反应最优,且在不添加金属离子、60℃反应条件下半衰期达到2.7 h,具有高热稳定性。在添加干重2.4 g/L重组大肠杆菌的D-果糖纯水溶液中,产物D-阿洛酮糖的终质量浓度为231 g/L,转化率达到33%。在添加硼酸根离子的条件下,D-阿洛酮糖的终质量浓度为378 g/L,转化率可以达到63%。在第二阶段,利用马克斯克鲁维酵母消耗混合体系中的D-果糖生产乙醇,降低分离成本。在不添加任何营养物质的情况下,在2种不同体系内,D-果糖均可以完全被消耗并产出约0.4 g/g的乙醇。该文研究结果为D-阿洛酮糖的低成本工业化生产奠定了良好的基础。     

酶处理促进龙眼果汁中蔗糖的转化和低聚果糖的生成

为了降低龙眼果汁中的蔗糖含量和制备一种富含低聚果糖的龙眼果汁,本研究以龙眼果汁为原料,探讨底物浓度、底物pH、果糖基转移酶添加量、酶处理温度和时间等单因素对果汁中蔗糖的转化和生成低聚果糖的影响。采用液相色谱法(HPLC)分析酶转化前后果汁中蔗糖、果糖、葡萄糖、低聚果糖含量的变化。结果表明,底物浓度、pH、酶用量、温度和处理时间等因素对龙眼果汁蔗糖转化和低聚果糖的生成有显著影响(p0.05)。在底物浓度30 oBrix、pH 6.0、酶用量9 U/g、55℃下转化7 h的龙眼果汁,蔗糖含量从164.36 mg/m L减少至22.34 mg/m L,生成的低聚果糖含量为97.88 mg/mL,占果汁中总糖的38.21%。利用果糖基转移酶处理龙眼果汁,能有效降低果汁中的蔗糖含量,获得一种低热量且富含低聚果糖的功能性果汁。     

海藻酸钠固定细胞产D-阿洛酮糖的研究

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)是一种能催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的异构酶。本实验采用海藻酸钠作为载体,包埋重组大肠杆菌催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。以固定化细胞的酶活活力回收率为指标,优化出最佳固定化条件为:海藻酸钠浓度3%,细胞包埋量60g/L,Ca Cl2浓度2%,固定化时间4h,0.01%浓度戊二醛溶液中交联4h。该条件下所得固定化细胞的酶活回收率高达76%,且具有较好的操作稳定性,重复操作8次后酶活回收率仍然保持61%。固定化后DPE细胞的最适酶反应温度提高了5℃、最适pH与游离细胞基本一致,耐热性明显提高,p H稳定性与游离细胞一致。     

L-鼠李树胶糖激酶在D-阿洛酮糖合成中的应用

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（D-psicose-3-epimerase,DPE）可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的可逆反应,但D-阿洛酮糖的产率较低。L-鼠李树胶糖激酶（L-rhamnulose kinase,RhaB）具有磷酸化酮糖类物质的活性,将其与DPE偶联,可以打破DPE的可逆平衡,从而提高D-阿洛酮糖的产率。在反应体系中引入多聚磷酸盐激酶（polyphosphate kinase,PPK）,可实现ATP的再生,降低反应的成本。本实验在大肠杆菌Rosetta（DE3）中分别过表达DPE、RhaB和PPK,优化其反应条件,计算产物得率。结果表明,RhaB的相对分子质量约为5.3×104,最适pH和温度为8.0和35 ℃。将DPE和RhaB偶联,最适条件如下：pH 8.5,温度35 ℃,最适金属离子Mg2+,DPE和RhaB酶量比（质量比）1∶2,产物得率为70%。将DPE、RhaB和PPK偶联,ATP浓度降为D-果糖的1/5,D-阿洛酮糖得率为50%。本研究为工业化生产D-阿洛酮糖提供理论依据。     

生物转化生成D-阿洛酮糖的类球红细菌的筛选

对鱼塘淤泥、水样中富集分离的27株光合细菌的静止细胞反应产物,采用高效液相色谱进行分析,从中筛选到1株D-阿洛酮糖产率较高的菌株,在形态和常规生理生化方面鉴定的基础上,结合16S rDNA序列分析鉴定为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides),定名为类球红细菌SK011。SK011利用D-果糖(36 g/L,pH7.5)为底物进行静止细胞转化,45℃,5 h,D-阿洛酮糖产率达到6.54%。     

应用膜技术制备高纯度低聚果糖

研究了低聚果糖纳滤条件(操作压差、料液浓度、温度、循环流量、pH)对渗透通量和各糖组分截留率的影响,其最佳纳滤条件为:操作压差1.1MPa,料液浓度10%,温度40℃,循环流量为6L/min,pH6.0。应用纳滤提纯低聚果糖,其纯度达到85.05%。然而该纳滤膜对蔗糖具有较高的截留率,从而限制了低聚果糖纯度的提高空间。为了进一步提高低聚果糖纯度,研究尝试了将膜分离和酶反应耦联的技术,利用其边反应边分离的特性,滤除单糖,转化普通级低聚果糖中的蔗糖,最终获得高纯度低聚果糖,其纯度达到95.79%。     

利用重组葡萄糖脱氢酶提高低聚果糖纯度

用IPTG（诱导基因工程菌）M15／pQE31-gdh表达葡萄糖脱氢酶，纯化，该重组葡萄糖脱氢酶用于高纯度低聚果糖生产研究。以含量为51．11％（低聚果糖／总糖）低聚果糖的产品为底物，葡萄糖脱氢酶（5U／g总糖）作用2h，将低聚果糖含量提高到61，37％，消除了48，81％的葡萄糖。以30％（w／v）蔗糖为底物，利用有果糖基转移酶活性的米曲霉GX0015（15U／g总糖）作用6h后，加入葡萄糖脱氢酶（5U／g总糖）协同作用4h，得到成分为：低聚果糖含量76．87％、葡萄糖11．05％、蔗糖含量5.21％的产品。由果糖基转移酶和葡萄糖脱氢酶组成的系统能够有效降低葡萄糖含量，提高低聚果糖含量。     

功能性甜味剂D-阿洛酮糖研究进展

高糖摄入引起的糖尿病、高血压等疾病严重危害着人类的生命健康,这一形势也促使人们对天然、低热量糖替代品的开发日益关注。作为一种近年发现的具有特殊生理功效的稀少糖,D-阿洛酮糖具有与蔗糖相近的口感及容积特性,被称为食品中蔗糖"理想替代品"。D-阿洛酮糖可以在D-阿洛酮糖3-差向异构酶的催化作用下进行生物合成,已被FDA批准为一般公认安全。D-阿洛酮糖因其优良的性能逐渐成为食品、保健和医疗领域的研究热点。本文综述了D-阿洛酮糖的理化性质、生理功能,及其最新的化学合成和生物制备方法,为D-阿洛酮糖在各大领域的应用做理论铺垫。     

β-D呋喃果糖苷酶合成低聚果糖的工艺研究

以蔗糖为底物 ,采用来源于米曲霉中的 β -D -呋喃果糖苷酶 (EC3 2 1 2 6)合成低聚果糖 ,酶反应最佳条件为 :反应温度 35℃ ,酶反应体系的pH为 8 0～ 8 2 ,酶浓度 2 7IU/ g(蔗糖 ) ,酶反应时间为 8h。低聚果糖的最大转化率为 5 4% ,82 %的蔗糖被转化     

唾液乳杆菌利用低聚果糖的代谢过程研究

对唾液乳杆菌代谢低聚果糖的代谢过程进行探讨,采用阴离子交换色谱检测唾液乳杆菌代谢低聚果糖时各组分的变化规律,采用高效液相色谱方法检测其代谢产物。结果表明:唾液乳杆菌能够代谢低聚果糖,发酵液OD600值达到0.303时,总糖质量浓度从最初的10.00g/L降至8.82g/L,pH值从7.00降至6.12。在与低聚果糖组分同时存在的情况下,唾液乳杆菌优先利用葡萄糖、果糖和蔗糖;低聚果糖组分中能快速利用蔗果三糖,蔗果四糖代谢效率不高,不能代谢蔗果五糖。代谢产物HPLC分析结果显示,唾液乳杆菌代谢低聚果糖的代谢产物主要有乳酸和乙酸。     

重组果聚糖蔗糖酶的发酵优化及应用

为了研究不同条件下重组短小芽孢杆菌产果聚糖蔗糖酶的最适条件以及利用重组酶转化蔗糖-乳糖制备低聚乳果糖的最适转化条件。以前期构建的产果聚糖蔗糖酶重组短小芽孢杆菌Brevibacillus brevis/pNCMO2-lsc作为菌种,通过单因素试验以及正交试验确定其最适产酶的发酵培养基为:葡萄糖20 g/L、氮源(工业酵母粉∶棉籽粉=2∶1,质量比)为40 g/L、CaCl_20.5 mmol/L,最适产酶温度30℃。在最优条件下发酵培养,果聚糖蔗糖酶的酶活可达62.1 U/mL,是优化前的3.69倍。利用该重组果聚糖蔗糖酶转化蔗糖-乳糖制备低聚乳果糖,在蔗糖和乳糖质量浓度均为200 g/L情况下,确定其最适转化条件:反应温度35℃,pH 6.0,加酶量为2 U/g底物,反应8 h后低聚乳果糖转化率可达39.1%。