B型肉毒毒素轻链蛋白的原核表达及纯化

目的克隆B型肉毒毒素轻链Bont-B基因,使其在大肠杆菌内表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法设计并人工合成Bont-B基因,克隆入表达载体pMD19-T中,构建质粒pMD19-T-Bont-B,经酶切后与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-28a-Bont-B,将重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,经金属螯合层析Cu2+柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度。结果重组表达质粒pET-28a-Bont-B经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约50 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的6%;纯化后的重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达了Bont-B轻链基因,为制备抗Bont-B轻链单克隆抗体及研究肉毒中毒机制和治疗奠定了基础。     

重组人干扰素β1a的纯化及其理化性质

目的纯化重组人干扰素β1a(recombinant human interferonβ1a,rhIFNβ1a),并分析其理化性质。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体培养表达rhIFNβ1a的重组CHO细胞,细胞培养收获液经超滤浓缩、蓝胶亲和层析、脱盐和CM离子交换层析纯化后,采用水泡性口炎病毒抑制法测定rhIFNβ1a的效价;Lowry法测定蛋白含量;等电聚焦电泳法测定其等电点;SDS-PAGE和高效液相色谱法测定其纯度;Western blot法分析其免疫活性;SDS-PAGE和质谱仪测定其相对分子质量;圆二色谱法分析其二级结构。结果共纯化了3批样品,纯化的rhIFNβ1a平均蛋白浓度为0.284 0 mg/ml,平均比活可达1.06×108IU/mg,纯度达95%以上,蛋白质平均回收率为58.36%,蛋白质相对分子质量为20 445.0,等电点约为6.6,免疫活性良好,二级结构与国家标准品基本一致。结论成功纯化了rhIFNβ1a,并检测了其理化性质,为建立大规模制备rhIFNβ1a的生产工艺和制造检定规程,实现产业化奠定了基础。     

人源化抗CD20单克隆抗体的理化性质及结晶条件的筛选

目的分析人源化抗CD20单克隆抗体的理化性质,并初步筛选其结晶条件。方法分别采用还原、非还原SDS-PAGE及高效液相体积排阻色谱(size exclusive chromatography-HPLC,SEC-HPLC)法检测抗体纯度;还原SDSPAGE测定抗体轻重链相对分子质量;毛细管电泳测定抗体等电点;高效液相阳离子交换色谱(ion exchange chromatographyHPLC,IEC-HPLC)法检测抗体电荷异质体含量;悬滴气相扩散法初步筛选抗体的结晶条件。结果人源化抗CD20单克隆抗体的非还原SDS-PAGE纯度为100%,还原SDS-PAGE纯度(轻链+重链)为100%,重链、轻链相对分子质量分别为58 000和27 000,SFC-HPLC纯度为99.2%;等电点为9.2;抗体表面电荷分布较均一;得到的蛋白晶体为孪晶,分辨率约为8埃。结论该抗体的纯度达到结晶要求,以其理化性质为基础,初步筛选出了结晶条件,为其结构和功能的研究奠定了基础。     

艰难梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶的原核表达、纯化及其酶活性

目的原核表达艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile,CD)谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH),纯化重组蛋白,并检测其酶活性。方法采用PCR法从标准株ATCC BAA-1805中扩增GDH基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28-GDH,转化感受态大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,并通过Ni-NAT层析柱分离纯化后,根据脱氢酶酶活测定方法,测定纯化蛋白的酶活性。结果重组表达质粒pET-28-GDH经双酶切及测序,证实构建正确,重组蛋白的相对分子质量约46 000,可与抗His单抗特异性结合,主要以可溶性形式表达。纯化的目的蛋白纯度可达90%,浓度为1.7 mg/ml。纯化蛋白GDH以NADPH和NADP为辅酶,酶活性分别为42.6和63.3 U/L。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CD GDH,纯化的目的蛋白纯度高,具有GDH酶活性,为制备GDH单克隆抗体奠定了基础。     

抗菌肽Cecropin B-人溶菌酶重组蛋白的表达及纯化

对抗菌肽Cecropin B-人溶菌酶(CB-hLy)的重组大肠杆菌进行了诱导表达,并对影响该重组蛋白表达的培养条件进行了优化,最后对表达出的重组蛋白进行了分离纯化.由上述方法得到的重组CB-hLy蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析表明,其纯度可达90%,且具有良好的抑制真菌生长的生物活性.     

重组人生长激素的原核分泌表达及其活性分析

目的构建重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)分泌表达质粒,进行原核表达,并分析其活性。方法人工合成包含phoA启动子、STⅡ信号肽序列及hGH基因优化序列的目的基因,与pBR322载体连接,构建重组克隆质粒pBR322-hGH;再将目的基因亚克隆至pACYC184载体,构建重组表达质粒pAC-hGH,进行酶切鉴定及测序分析。将鉴定正确的重组表达质粒pAC-hGH转化至感受态大肠埃希菌W3110中,构建重组工程菌,经诱导表达后进行DEAE-Sepharose FF纯化,纯化产物经SDS-PAGE、分子排阻色谱、N-末端氨基酸序列及活性分析。结果重组表达质粒经酶切及测序鉴定,构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析可见相对分子质量约22 000的目的条带,菌体相对表达量达30%以上;纯化产物电泳纯度达95%以上,分子排阻色谱保留时间及N-末端15个氨基酸均与国家标准品一致,比活性大于3.0 IU/mg。结论成功构建了分泌表达rhGH的重组质粒,且获得了纯度及活性均较高的rhGH,为其产品的开发奠定了基础。     

日本血吸虫亮氨酸氨基肽酶的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化日本血吸虫亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase of Schistosoma japonicum,SjLAP)。方法从日本血吸虫成虫中RT-PCR扩增LAP基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组SjLAP蛋白(rSjLAP)经SDS-PAGE和Western blot分析后,经His Binding Purification Kit层析纯化,纯化的rSjLAP蛋白经SDS-PAGE分析纯度,Bradford法测定浓度。结果克隆的SjLAP基因与GenBank中登录的基因序列比较有2个碱基发生置换,导致对应的2个氨基酸发生置换,但均不在关键区域;重组表达质粒pET-28a/SjLAP经双酶切鉴定证实构建正确;表达的rSjLAP蛋白相对分子质量约45 000,诱导4 h表达量最高;纯化的rSjLAP蛋白纯度较高,浓度达5.0 mg/ml,并可被抗小鼠His-tag单抗及血吸虫感染的患者血清和兔血清特异性识别,具有良好的反应原性。结论成功在大肠杆菌中表达了rSjLAP蛋白,纯化的rSjLAP纯度较高,为血吸虫病的诊断和预防等研究奠定了基础。     

人重组催乳素蛋白的原核表达、纯化及其稳定性分析

目的 表达并纯化重组人催乳素(prolactin,PRL)蛋白,并检测其抗原性及稳定性。方法 以商品化的PRL c DNA为模板,PCR扩增目的基因,定向克隆至质粒p ET25中,构建重组原核表达质粒PRL-p ET25b,转化大肠埃希菌后诱导表达,产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE鉴定后,采用Bradford法测定蛋白浓度,PRL定量试剂盒分析抗原性,置-20、4和37℃9 d后,分析稳定性。结果 重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组PRL蛋白相对分子质量约30 000,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%,纯度大于90%,总蛋白浓度为0.796 mg/ml。重组PRL蛋白于-20、4和37℃放置9 d,浓度变化较小,偏差在10%以内。结论 获得了高纯度的重组PRL融合蛋白,抗原性及稳定性均较好,可应用于试剂盒标准品或校准品的制备。     

B型肉毒神经毒素的纯化及胰蛋白酶对其作用分析

目的纯化B型肉毒神经毒素,并比较未激活和用胰蛋白酶激活的B型肉毒神经毒素的分子特性,分析在酸性和碱性条件下B型肉毒毒素复合物的完整性。方法取未激活、胰蛋白酶激活和热处理激活的B型肉毒毒素复合物,采用阴离子交换柱层析纯化神经毒素(分别为A、B和C组)。在酸性条件下溶解激活的B型肉毒毒素复合物(D组)。对各组进行纯度(特异毒性)测定和SDS-PAGE分析。结果柱层析后,神经毒素纯度均比复合物的纯度高,激活的神经毒素比未激活的高2～3倍;在非还原和还原条件下,A组的SDS-PAGE显示神经毒素、重链和轻链3条带;B组显示重链和轻链2条带;C组在非还原条件下显示重链和轻链2条带,在还原条件下只显示轻链1条带。在酸性条件下,B型肉毒毒素复合物由神经毒素与非毒性成分构成,在碱性条件下,神经毒素与非毒性成分分离。结论已成功纯化了B型肉毒神经毒素,经胰蛋白酶处理后,单链裂解为双链,比活性提高。     

巴斯德梭菌甘油脱水酶基因的克隆表达、纯化及酶学性质的研究

用聚合酶链反应(PCR)技术,从巴斯德梭菌(C lostridium pasteurianum)扩增出甘油脱水酶基因(dhaBCE),在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳结果显示,分别有相对分子质量为66、21、16 kD三条特异性蛋白表达条带。用金属镍亲和层析及S-300H凝胶层析将重组蛋白进行分离纯化,所得纯酶的比活为4.26 U/mg。重组酶的最适反应温度42~44℃,最适作用pH=9.10~9.50,它对三个底物结构类似物的米氏常数(Km)值分别是:1,2-丙二醇0.38 mmol/L,甘油0.29 mmol/L,1,2-乙二醇2.0 mmol/L;对辅酶B12的Km值为0.22μmol/L。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌高密度发酵及表达产物的纯化

目的 研究重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌高密度发酵和表达产物的纯化工艺。方法采用最适基质浓度、pH、溶氧量、培养温度等发酵表达条件及产物提纯方法。结果 菌体密度A6000达40.8,表达量达160mg/L。提纯的bFGF回收率为40％,生物学活性（ED50）为 0.21ng/mL,比活性达4.76×106U/mg,其纯度、分子量、残余DNA等各项检测结果均符合“重组 DNA制品质量控制要点”。结论 为hbFGF工业化生产和临床应用提供了依据。     

人α_1型基因工程干扰素的中间试制

带有杂交质粒pBV867的大肠杆菌BMH 71-18株,用高密度发酵培养法进行发酵,3批中试的平均菌产量为100.25克/升,粗制干扰素的表达量平均为8.39mg/升。3批粗制干扰素的数量分别为35000,30000和36000 ml。经初步提纯,分别浓缩10.4、10和11.29倍,比活性上升10、33和30倍,初步提纯的得率为34.33％。经高度提纯、浓缩23.8、16.7和26.1倍,比活明显增加至24.38、20.80和21.43×10~6 IU/mg蛋白,平均得率为35.92％,总得率为11.82％,平均提纯倍数为1757倍。 3批中试产品按WHO规程的标准进行检定,经SDS-PAGE银染色法测定,呈一条带,其分子量约为21000,无论在还原或非还原的条件下干扰素纯度均在95％以上。用HPLC检定均为单一峰形,纯度在95％以上。其它检定项目如等电聚焦、效价、热原、残余DNA、鼠IgG含量测定和全波长扫描等均合乎规程要求。     

产肠毒素大肠杆菌987P菌毛蛋白FasA亚单位的原核表达及其免疫原性

目的表达、纯化产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)987P菌毛蛋白FasA亚单位,并检测其免疫原性。方法将去掉5′端信号肽序列的fasA基因克隆至原核表达载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-fasA,转化E.coli M15,0.5 mmol/L IPTG诱导表达。表达的融合蛋白6×His-FasA经Ni-Agarose His纯化和复性后,经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,每次100μg,共免疫3次,间隔2周,末次免疫10 d后,摘除小鼠眼球取血,分离血清,采用间接ELISA法检测抗血清效价。结果重组表达质粒pQE-30-fasA经PCR、双酶切和测序证实构建正确;表达的6×His-FasA融合蛋白相对分子质量约为18 500,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%;纯化的蛋白纯度可达95%,浓度为0.6 mg/ml,免疫小鼠所得抗血清效价为1∶125 000。结论已成功在E.coli M15中表达了6×His-FasA融合蛋白,纯化的融合蛋白免疫原性良好,为进一步研制以双歧杆菌为表达系统的新型ETEC亚单位口服疫苗奠定了基础。     

HPV16 MuE6/E7嵌合蛋白的原核表达、纯化及其免疫效果

目的表达HPV16型MuE6/E7嵌合蛋白,并检测其免疫原性及抗肿瘤活性。方法将构建的重组MuE6/E7蛋白的表达载体转化大肠杆菌BL21(λDE3)进行诱导表达,表达的包涵体蛋白经分离、纯化、变性及复性后,通过离子交换和分子筛层析进行纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot、HPLC和质谱分析鉴定,并免疫C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性。结果重组MuE6/E7蛋白相对分子质量约为21 000,表达量约为23.06%,表达形式为包涵体,经复性、纯化后,纯度达97.17%。免疫3针后,小鼠可产生高滴度的HPV特异性抗体,并且与注射剂量呈正相关。免疫小鼠能抵抗TC-1肿瘤细胞的攻击,并可延长TC-1致瘤小鼠的存活期。结论已表达并纯化了重组MuE6/E7蛋白,其对TC-1致瘤小鼠具有一定的免疫治疗作用,为进一步研制HPV治疗性疫苗奠定了基础。     

重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。     

重组蜂毒素-基因变构IL-2的纯化与生物活性

目的制备纯化重组蜂毒素-基因变构IL-2(Melittin-88ArgIL-2)嵌合蛋白,并检测其生物活性。方法将含表达载体的大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达。表达产物经离子交换层析与亲和层析进行纯化,SDS-PAGE鉴定,MTT染色法检测嵌合蛋白对Hela细胞增殖的抑制作用。结果所表达的可溶性蛋白,纯化后纯度达95%,蛋白浓度0.5g/L。纯化后的嵌合蛋白在体外能抑制Hela细胞的增殖。结论已成功地制备并纯化了重组melittin-88ArgIL-2嵌合蛋白,该蛋白具有生物活性,为中试放大和纯化工艺研究奠定了基础。     

重组类人胶原蛋白的分离纯化

目的 建立重组类人胶原蛋白分离及纯化工艺。方法 将工程菌株E.coli BL21 3.1在L1523型12.8L自控发酵罐中培养14h,发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后,依次经DEAE-52和Sephadex G-100柱层析分离纯化。结果 发酵菌体干重达到71g/L,表达量为菌体蛋白量的29.4％,最终产物纯度达98％,回收率为80.5％,纯化倍数为3.4。结论 纯化的类人胶原蛋白达电泳纯,相对分子质量为90 000,N端序列为NH_2-H-D-P-V-V-L-Q-R-R-D-W-E-N-P-G,均与其因序列设计一致。     

大肠杆菌表达的破伤风毒素C片段的免疫原性分析

目的　分析大肠杆菌表达的破伤风毒素C片段 (简称TTC)的免疫原性。方法　利用分子生物学技术在大肠杆菌中表达破伤风毒素C片段 ,用阴离子交换层析和金属离子螯合亲和层析方法进行蛋白纯化。参照2 0 0 0年版《中国生物制品规程》的方法检测表达产物的效价。用间接血凝实验检测免疫动物血清中的破伤风抗体单位。结果　重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的 15 %。纯化后蛋白纯度达到 96 5 %。免疫效价为 18 70 6IU mg ,ED50 为 2 0 μg。 1μgTTC经 4次免疫能诱导机体产生足够的抗体 ,保护动物免受破伤风毒素的攻击。 结论　重组蛋白具有良好的免疫原性 ,为开发基因工程疫苗奠定了基础     

疏水作用层析在重组大肠杆菌表达的rProEMAPⅡ/P43蛋白纯化中的作用

目的建立rProEMAPⅡ/P43蛋白的纯化工艺,明确疏水作用层析(HIC)在纯化中的作用。方法采用由疏水作用层析、离子交换层析、亲和肝素层析组成的工艺对rProEMAPⅡ/P43蛋白进行纯化,并与由离子交换层析和亲和肝素层析组成的工艺相比较,分别进行总蛋白含量测定、SDS-PAGE分析目的蛋白含量及纯度检测。结果在pH为7·4~7·5时,采用HIC方法纯化的蛋白较不采用HIC法回收率提高了28·4%,纯化后rProEMAPⅡ/P43蛋白纯度为92%。结论在rProEMAPⅡ/P43蛋白纯化过程中增加疏水作用层析,可以提高rProEMAPⅡ/P43蛋白收率。