基于Arah6的花生间接竞争ELISA检测方法的建立

建立了基于花生主要过敏原蛋白Arah6的间接竞争酶联免疫检测法,实现了对食物中花生的定量检测。利用花生过敏原Arah6纯品免疫新西兰大白兔,制得兔抗Arah6的多克隆抗体,以Arah6纯品作为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,确定了包被抗原质量浓度为1μg/mL,一抗最佳稀释度为1:50000,酶标二抗稀释度为1:5000。此检测方法对Arah6的定量检测范围为16.5～10000ng/mL（折合成含花生的含量,约为165ng/mL～100μg/mL）,抑制方程为抑制率I=21.418lgC-6.0633（C为Arah6的质量浓度,单位ng/mL）,IC50为414.6ng/mL,相关系数R2=0.9989。该检测方法灵敏度高,检测范围广,适用于食品中花生现场快速检测。      

葡聚糖多克隆抗体制备与纯化

以DextranT40和BSA的交联物为抗原,多次免疫新西兰白兔,收集血清,并用rProteinA亲和层析柱纯化抗体,成功获得较高纯度的兔抗葡聚糖多克隆抗体。用ELISA法测定其效价,抗体效价为1∶32000以上。     

β-伴大豆球蛋白间接竞争ELISA检测方法建立

β–伴大豆球蛋白是引起过敏现象发生的主要大豆蛋白过敏原之一,建立β–伴大豆球蛋白过敏原的检测为研究大豆中过敏原降低程度奠定了良好的基础。采用自制的兔抗β–伴大豆球蛋白多克隆抗体,并以标准β–伴大豆球蛋白为抗原、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标二抗,建立了定量检测β–伴大豆球蛋白的间接竞争ELISA方法。并对该方法进行了条件优化及精密度的测定。结果为:抗原包被浓度为0.3μg/mL,一抗最佳稀释度为1∶3200,酶标二抗稀释度为1∶10000;板内误差2.19%,板间误差9.61%。回归直线方程为y=–2.439 2x–1.871 8,相关系数R2=0.995 7,其检测的线性范围为0.1²μg/mL。表明所建方法具有一定的重复性和灵敏度,可用于大豆制品过敏原的检测。     

基于Arah6的花生问接竞争ELISA检测方法的建立

建立了基于花生主要过敏原蛋白Arah6的间接竞争酶联免疫检测法,实现了对食物中花生的定量检测。利用花生过敏原Arah6纯品免疫新西兰大白兔,制得兔抗Arah6的多克隆抗体,以Arah6纯品作为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,确定了包被抗原质量浓度为1μg／mL,一抗最佳稀释度为1：50000,酶标二抗稀释度为1：5000。此检测方法对Arah6的定量检测范围为16．5～10000ng/mL（折合成舍花生的含量,约为165ng／mL～100μg／mL）,抑制方程为抑制率I=21．4181gC-6．0633（c为Amh6的质量浓度,单位ng／mL）,IC50为414．6ng/mL,相关系数R2=0．9989。该检测方法灵敏度高,检测范围广,适用于食品中花生现场快速检测。     

新霉素ELISA检测方法的建立

目的：比较直接和间接竞争酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的优缺点,建立新霉素残留ELISA检测方法。方法：利用自制的新霉素多克隆抗体,采用直接竞争和间接竞争ELISA方法检测新霉素残留,并比较两种方法的优缺点。结果：新霉素抗血清和庆大霉素的交叉反应率为2.04%,和卡那霉素的交叉反应率为0.02%,和氨苄青霉素、红霉素、四环素的交叉反应率均小于0.01%。初步测试新霉素间接竞争ELISA法的准确性和回收率。板内误差小于4%,板间误差小于11%,回收率为135.5%～191.3%。直接竞争和间接竞争ELISA方法的检测极限分别为28.58ng/mL和51.74ng/mL,达到了国家对新霉素规定的500μg/kg MRL检测限。结论：建立了直接竞争和间接ELISA吸附检测方法,条件优化更成功的间接竞争ELISA可用于开发新霉素检测试剂盒。     

间接竞争ELISA检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯

以4-氨基邻苯二甲酸为原料,通过酯化反应合成半抗原4-氨基邻苯二甲酸二丁酯,将合成的半抗原通过重氮化反应与钥孔血蓝蛋白(KLH)进行偶联制备免疫抗原,与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联制备包被抗原。通过免疫新西兰大白兔获得邻苯二甲酸二丁酯抗血清,利用纯化获得的抗体和包被抗原建立邻苯二甲酸二丁酯间接竞争酶联免疫检测方法(ELISA)。该方法的IC50为40.68μg/L,最低检测限IC_(15)为1.98μg/L,方法对邻苯二甲酸二丁酯具有较好的特异性。经对白酒、牛奶、食用油样品进行检测,添加回收率为84.57%～102.40%,用气相色谱—质谱法(GC-MS)进行验证,两种方法均呈现良好的线性相关性(R~2=0.990 8)。研究建立的方法可以被应用于食品中塑化剂邻苯二甲酸二丁酯的快速检测。     

赭曲霉毒素A直接竞争ELISA试剂盒的研制

在多克隆抗体的基础上研制了赭曲霉毒素A(OTA)直接竞争酶联免疫检测(cd-ELISA)试剂盒.在0 ～ 10 ng/mL范围内,该试剂盒50％抑制率(IC50)为1.09 ng/mL,检测灵敏度(IC15)为0.08 ng/mL;与赭曲霉毒素B、C的交叉反应率分别为6.28％和0.16％,而与黄曲霉毒素B1等生物毒素未见有交叉反应;板内与板间平均变异系数分别为2.21％和2.79％;花生、玉米和玉米粉3种样品中OTA的检测低限分别为1.71,1.26和1.85 μg/kg,平均添加回收率在83.80％～ 91.40％;与HPLC检测方法具有较高的相关性,相关系数(R2)分别为0.94、0.88和0.90;检测时间只需20 min,可用于花生、玉米及玉米粉中OTA的批量快速筛查.     

己烯雌酚残留检测ELISA试剂盒的研制及应用

在实验室前期制备的己烯雌酚多克隆抗体基础上建立间接竞争ELISA检测方法,研制出己烯雌酚残留ELISA快速检测试剂盒,并对其性能参数进行测定。结果表明,所选用的抗体对己烯雌酚亲和力高,除了与双烯雌酚、己烷雌酚的交叉反应率分别为6.83%和2.56%外,与其他结构类似物或功能类似物交叉反应率均小于0.01%;己烯雌酚残留检测的标准曲线为y=-28.71x+59.37,R2为0.9895,线性范围为0.08~8.17ng/mL,检测限IC10为0.05ng/mL,灵敏度IC50为1.09ng/mL,样品的加标回收率为80.04%~107.91%,平均批内和批间变异系数分别为6.41%和8.83%;与HPLC测定方法比对具有较高的相符性,相关系数R2为0.9882;该试剂盒在4℃下至少可保存6个月,可用于批量猪肉、鸡肉、鱼肉、饲料等样品中己烯雌酚残留的检测。     

金黄色葡萄球菌B型肠毒素间接竞争ELISA 检测方法的建立

以金黄色葡萄球菌B型肠毒素免疫Balb/c小鼠,待血清效价达到要求后,腹腔注射骨髓瘤细胞,制备抗金黄色葡萄球菌B型肠毒素抗体,并建立快速检测金黄色葡萄球菌B型肠毒素的间接竞争ELISA(ciELISA)方法。经方阵滴定确定B型肠毒素的最佳包被浓度为0.31μg/ml,抗B型肠毒素抗体的稀释度为1:1.2×104,羊抗鼠IgG-HRP的稀释度为1:103。本实验建立的B型肠毒素的间接竞争ELISA检测方法的最低检测量为1ng/ml,线性检测范围为1～103ng/ml,相关系数R2=0.9951,人工污染样品的平均回收率为94.5%。     

重金属铅多克隆抗体的制备及鉴定

目的：合成铅离子完全抗原,并对其进行鉴定;用合成的完全抗原免疫Balb/c 小鼠制备多克隆抗体,鉴定效价和特异性。方法：用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA 将Pb2+ 与载体蛋白BSA 和OVA 偶联在一起,合成免疫抗原(Pb-DTPA-BSA)和检测抗原(Pb-DTPA-OVA),并通过SDS-PAGE、紫外扫描、电感耦合等离子体(ICP) 检测抗原中Pb2+ 含量,以及通过免疫Balb/c 小鼠,采集血清进行间接ELISA 和竞争ELISA 检测。结果：两种合成的抗原相对于各自的载体蛋白均出现了蛋白条带滞后,紫外吸收峰偏移等现象;免疫的4 号和5 号Balb/c 小鼠的抗血清效价达1:400000;与OVA 无交叉反应,ELISA 检测IC50 值为1.5ng/mL,与Fe3+ 有近5% 的交叉反应,与其他重金属离子的交叉反应均小于1%。结论：铅离子多克隆抗体制备成功。     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。     

葡聚糖抗体的制备及其Elisa检测方法的建立

制备并筛选葡聚糖拟糖蛋白抗原,通过动物免疫获得葡聚糖多克隆抗体并建立葡聚糖的Elisa检测方法,应用于实际样品检测。以还原胺化法制备大分子葡聚糖-牛血清蛋白(BSA)拟糖蛋白质,通过SDS-PAGE与自由氨基测定,优化葡聚糖拟糖蛋白抗原制备反应,建立直接竞争Elisa筛选抗原活性。以制得的葡聚糖T40-BSA拟糖蛋白抗原为免疫原,经过免疫白兔后获得高效价多抗;建立检测葡聚糖多抗的间接非竞争Elisa方法。确定拟糖蛋白抗原的最佳制备条件(n(葡聚糖)/n(氧化剂NaIO4)=1/120,偶联时间24 h);筛选获得不同制备条件下与标准抗体结合最强的抗原产物T40-BSA,动物免疫获得多抗,优化实验条件:以质量浓度10μg/mL的T40-BSA为包被抗原,37℃时血清多抗和酶标多抗的反应时间均为45 min,质量分数5%小牛血清为封闭液后洗板;建立了基于T40-BSA拟糖蛋白抗原的不同相对分子质量葡聚糖间接竞争Elisa检测方法,并应用于对市售白糖中葡聚糖T40的含量检测。研究结果表明,葡聚糖-BSA拟糖蛋白抗原制备条件不同,对其免疫活性有影响。建立的检测方法有良好的线性,能用于实际样品中葡聚糖含量的检测。     

ELISA法测定氨苄青霉素用多克隆抗体的制备与鉴定

采用戊二醛法和物理方法,分别以BSA、HSA、OVA为载体蛋白合成了免疫抗原和包被抗原,并通过紫外扫描法鉴定了合成的抗原为载体蛋白和氨苄青霉素的复合物。将偶联抗原用弗氏佐剂乳化后免疫新西兰大白兔,制备出多克隆抗体,并对ELISA检测条件进行了优化。实验得到酶标二抗的最佳稀释倍数为1600。Ag5、Ag6、Ag7包被抗原的最佳稀释倍数分别为6400、800和400,且在ELISA试验中,选择与免疫抗原合成方法不同的合成抗原作为包被抗原为佳。底物的最佳配方为10mL底物缓冲液+7μLH2O2+200μLTMB。酶标板选用Corning酶标板。在以上条件下测得6只兔子抗血清的效价在1×103～128×103之间。亲和性试验表明以物理方法直接合成的免疫抗原比戊二醛法合成的免疫抗原亲和性好。交叉反应实验证实,抗血清与阿莫西林有极高的交叉反应率(78%),而与其它结构相似的5种抗生素的交叉反应都很小。本检测方法的检测极限是4.17ng/mL。     

过敏原小麦醇溶蛋白的ELISA定量检测方法的建立

建立了检测小麦过敏原醇溶蛋白的定量ELISA抗体夹心法,以2μg/mL的鼠抗醇溶蛋白单抗包被酶标板,HRP标记兔抗醇溶蛋白抗体作为酶标抗体,工作浓度为1∶8000,将醇溶蛋白精确配制成一定浓度的标准品,检测醇溶蛋白的含量。最佳的线性范围是19.53~5000ng/mL,R2≥0.99,定量检测限为19.53ng/mL,对应的食品样品检测限为7.81ppm。样品的回收率在93.57%~105.72%之间,实验内CV为3.07%~5.91%,实验间CV为0.26%~5.24%,仅对大麦有一定的交叉反应,可在4℃放置两周。本法准确度和精密度高,重复性和稳定性好,特异性较强,适用于食品过敏原小麦醇溶蛋白的检测。      

孔雀石绿多克隆抗体的制备与筛选

设计并成功合成了三种孔雀石绿半抗原,所有半抗原均采用活化酯法分别与血匙兰蛋白(KLH)偶联制备成免疫抗原,与卵清蛋白(OVA)偶联制备成包被抗原。利用所制备的三种免疫原免疫新西兰大耳白兔都获得了高效价的抗孔雀石绿抗体,并将每一种抗体都与三种包被抗原进行组合配对,通过间接竞争酶联免疫吸附检测(ELISA)方法筛选出最佳的抗体-包被抗原组合,筛选出的抗体采用Sepharose FF-Protein A亲和层析柱纯化,采用间接ELISA法测定效价及鉴定特异性。经测定筛选出的抗体效价达到1:12000,IC50值为0.65 ng/mL,交叉反应表明该抗体有较好的特异性,与结构类似物结晶紫的交叉反应率为18.73%,与隐性孔雀石绿及隐性结晶紫的交叉反应率低于10%。本研究为建立快速检测食品中孔雀石绿残留的免疫分析方法奠定了基础。     

大豆过敏原夹心ELISA和竞争ELISA方法的建立及其在加工食品中应用研究

本文以大豆混合过敏原为目标,建立了快速、便捷检测大豆过敏原的夹心酶联免疫吸附方法（sandwich-enzyme linked immunosorbent assay）和间接竞争酶联免疫吸附方法（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay）,通过实际加工样品的回收实验、加标食品回收实验以及对真实食物样本的检测,对这两种方法进行了比较,确定了各自的适用范围。结果表明,夹心ELISA方法标准品浓度在0.0078~30 μg/mL范围内呈现出良好的线性关系,曲线方程为y=0.2333x+0.0692,决定系数R2=0.995。竞争ELISA方法的检测范围为10~100000 ng/mL,最低检测限为10 ng/mL。对购入橙汁进行加标回收实验,夹心ELISA检测后的回收率要高于竞争ELISA检测后的回收率,达100%以上;而对成分和加工方式都比较复杂的巧克力、牛肉酱、面包或蛋糕来说,竞争ELISA检测后的回收率要高于夹心ELISA检测后的回收率。对发酵类食物进行检测,竞争ELISA方法检测到的浓度要高于夹心ELISA,而对成分比较简单的食物比如芝麻糊、豆奶等进行检测时,夹心ELISA的检测浓度要略高于竞争ELISA。综上,竞争ELISA方法更适用于食物基质复杂,经过深度加工的食品,而夹心ELISA方法更适用于食物成分简单,轻加工后的食品,两种方法在各自的适用范围内均能实现较准确的检测。     

基于单克隆抗体的三聚氰胺ELISA检测方法的建立

建立三聚氰胺直接和间接竞争ELISA检测方法.三聚氰胺(melamine)-BSA免疫BALB/c小鼠,通过融合小鼠脾细胞与SP2/0细胞,制备分泌MEL单克隆抗体(monoclonal antibody)的细胞株;体内诱生腹水制备MEL-mAb.用高碘酸钠法制备MEL-OVA-HRP偶联物并对其活性进行鉴定.分别用M...     

链霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

通过研究链霉素(SM)人工抗原的合成和多克隆抗体的制备,建立链霉素残留的免疫分析方法。以氧-缩甲基羟胺肟化链霉素的醛基,引入羧基,再用碳二亚胺法将半抗原与蛋白质载体连接,合成免疫原SM-cBSA。用戊二醛法合成包被原SM-OVA。用紫外扫描、SDS-PAGE分析偶联情况,计算得链霉素与cBSA、OVA的分子偶联比分别为7.6:1与17.7:1。经动物免疫获得效价为1:40000的链霉素多克隆抗体,采用间接竞争ELISA测定IC50为3.32ng/mL,与双氢链霉素的交叉反应率为105.21%,与同类的其他药物均无交叉反应。     

三聚氰胺多克隆抗体的制备、分离纯化及ELISA方法的测试研究

目的:制备具有高特异性的三聚氰胺多克隆抗体,建立三聚氰胺快速检测方法.方法:通过抗原偶联嫁接技术,将不具备免疫原性的三聚氰胺与特定蛋白连接,制备免疫抗原(MB1st、MB2st、KM和ML2).对家兔进行皮下多点注射,初次免疫后取抗体血清,用SDS-PAGE检测血清中IgG的产生情况.采用酶联免疫吸附法测定各抗体血清的效价,最终以亲和层析法纯化血清,获得高特异性的抗体.将纯化后的抗体包被于酶标板上,建立三聚氰胺ELISA方法,并验证其有效性.结果:通过SDS-PAGE证明免疫前、后血清中IgG显著增长.进一步使用间接ELISA法测得各兔血清效价.MB1st免疫的效果最佳,其抗体血清对三聚氰胺的竞争率由纯化前的36.97％上升至纯化后的75.57％.MB2st免疫的抗体血清对三聚氰胺的竞争率由纯化前的30.80％上升至纯化后92.43％.KM免疫的抗体血清效价较低,其对三聚氰胺的竞争率由纯化前的11.95％上升至纯化后的96.09％.ML2免疫效价低,且其抗体血清在纯化前、后均对三聚氰胺没有显著的竞争性.由此建立ELISA方法,并初步验证了该方法的有效性.结论:本试验中制备的三聚氰胺抗体血清.经分离、纯化后得到对三聚氰胺具有较高竞争性的多克隆抗体,为建立酶联免疫方法,以检测食品中三聚氰胺含量提供了理论基础.     

灵芝酸A多克隆抗体制备及酶联免疫吸附测定法的建立

以牛血清白蛋白为载体,采用活化酯法合成灵芝酸A的偶联抗原作为免疫原,按照免疫程序接种试验兔,获得针对偶联抗原的多克隆抗体。对多克隆抗体的效价及靶向进行分析后,构建灵芝酸A的间接竞争酶联免疫吸附测定法。结果显示：多克隆抗体中存在靶向偶联抗原3个区域的独特型抗体,总效价为1∶78 125,其中抗灵芝酸A特异性抗体效价为1∶3 125。间接竞争酶联免疫吸附测定法的灵芝酸A检出限为0.3μg/L,半数抑制浓度为4.0μg/L,线性范围在0.6～27.3μg/L之间。样品测定批间变异系数低于10%,样品加标回收率在82.9%～118.6%之间,对22份灵芝粉剂产品的测定结果显示不同品牌产品中灵芝酸A含量的差异极显著,该法测定结果与高效液相色谱法的测定结果相比,相关系数为0.972。结果表明,间接竞争酶联免疫吸附法测定灵芝酸A可行,该方法能够为灵芝保健品市场中相关产品的质量监控提供一种辅助方案。