抗流感病毒鸡卵黄免疫球蛋白IgY的制备和性质

用流感病毒免疫产蛋鸡,获得的免疫卵黄经两步盐析和一步凝胶过滤分离得到的IgY经SDS-PAGE分析其纯度在95%以上,纯化的IgY经胃蛋白酶(pH=4 0,37℃)酶解后,得到的片段抗体为Fab。采用竞争抑制ELISA法对IgY和Fab的免疫反应活性进行了对比,表明IgY经胃酶切解后保留了约70%的反应活性。     

硫糖铝对抗幽门螺杆菌重组VacA卵黄抗体的保护作用

目的观察硫糖铝对抗幽门螺杆菌重组细胞空泡毒素抗原(VacA)卵黄抗体(IgY)的保护作用,为制备能耐受胃酸和蛋白酶的IgY制剂奠定基础。方法诱导重组菌DH5α-vacA-pQE30,大量表达并纯化VacA重组蛋白,免疫洛曼母鸡,制备VacAIgY,并进行纯化。在不同pH值的IgY液中加入不同浓度的硫糖铝和不同浓度的胃蛋白酶,将含不同浓度硫糖铝的IgY反复冻融7次,将含30%硫糖铝的IgY室温放置1d～4周,ELISA法测定各实验组IgY的相对抗体活性(AT/AC)。结果在pH1.5、2.0和3.0的条件下,含30%～60%硫糖铝的IgY的相对抗体活性高于不加硫糖铝的IgY;在pH1.5条件下,60%硫糖铝可使IgY的相对抗体活性保持68.7%;在pH2.0和3.0条件下,50%和40%以上的硫糖铝几乎可完全保持IgY的相对抗体活性。在pH值为2.0和3.0时,正常胃蛋白酶浓度(0.02mg/ml)下,30%以上的硫糖铝均可有效保护IgY的相对抗体活性。30%以上的硫糖铝可增强IgY的抗冻融能力。室温放置4周后,含30%硫糖铝的IgY仍能保持80%以上的相对抗体活性。结论30%以上的硫糖铝可增强VacAIgY对低pH和胃蛋白酶的耐受能力及抗冻融能力,是较理想的IgY保护剂。     

抗轮状病毒IgY和Fab'的分离与纯化

抗轮状病毒IgY可用两步盐析结合凝胶过滤从蛋黄中分离出来,用SDS—PAGE检测其纯度可达到95％以上。纯的IgY经胃蛋白酶分解得到的抗体片断（Fab’）,经SDS-PAGE和MALDI质谱法测定,其纯度达到99％以上。结果表明,所设计的分离抗轮状病毒IsY和Fab’的方法简单、有效。经ELISA法检测,Fab’的活性仍保持在IgY原始活性的70％以上。     

人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的表达和鉴定

目的对人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体A12进行可溶性表达及特异性和中和活性检测。方法表达人源单链抗体A12的菌株,经诱导后进行SDS-PAGE及Western blot检测,用流式细胞仪(FACS)检测表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染Vero细胞的能力,用快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测表达产物的中和活性。结果Western blot显示表达产物与抗C-myc抗体在相对分子质量约30 000处出现强阳性表达带。FACS表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染的Vero细胞出现特异性反应。RFFIT表明,A12 ScFv在1∶27倍稀释时能完全中和病毒。结论已获得了A12可溶性表达,表达产物能与狂犬病毒G蛋白特异性结合,并对狂犬病毒具有一定的中和活性。     

鸡卵抗体(IgY)理化特性的研究

本文研究了抗脊髓灰质炎病毒Ⅲ型鸡卵抗体（IgY）的理化特性，实验证明IgY在室温条件下能保持活性6个月，经巴氏消毒后抗体活性不丧失，并且具有很好的耐酸性，研究结果提示特异性IgY可作为良好的婴幼儿食品添加剂。     

抗金黄色葡萄球菌IgY的功能性试验

目的　观察抗金黄色葡萄球菌IgY的生物学效应及稳定性。方法　将金黄色葡萄球菌稀释至适宜浓度 ,用微量凝集法测定IgY抗体的生物学效应及稳定性。结果　抗体IgY(10mg ml)溶液能明显抑制金黄色葡萄球菌生长 ,且能使感染性病灶症状消失 ,治愈病灶局部未检出葡萄球菌。抗体IgY在 2 5℃、37℃条件下活性稳定 ;巴氏消毒 6 4℃条件下 15min活性下降 4 0 % ,15min以后迅速下降 ;70℃作用 15min活性下降 70 % ;在pH4 0～ 7 9环境中活性改变不显著。结论　抗金黄色葡萄球菌IgY具有很好的生物学效应和高度稳定性。     

抗甲型肝炎病毒卵黄免疫球蛋白的制备及应用

目的制备抗甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,IgY),并建立双抗体夹心ELISA法,用于测定甲肝疫苗中的HAV抗原含量。方法用纯化的HAV免疫健康产蛋母鸡,制备抗HAV IgY,采用多步骤分离纯化IgY,紫外分光光度法测定纯化IgY的蛋白含量,还原型SDS-PAGE分析IgY的相对分子质量及纯度,间接ELISA法检测IgY的效价、特异性及其热稳定性和酸碱稳定性。以纯化的IgY作为包被抗体,HRP标记的抗HAV单克隆抗体作为二抗,建立双抗体夹心ELISA法,对疫苗生产过程中的HAV抗原含量进行测定,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较。结果亲和层析纯化后的抗HAV IgY浓度为3.67 mg/ml;重链和轻链的相对分子质量分别为66 000和27 000,纯度为96.78%;效价最高为1∶16 000;纯化的抗HAV IgY只与HAV呈阳性反应,与脊髓灰质炎病毒和肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)均不反应;纯化的抗HAV IgY在25⁷0℃条件下处理15 min及经pH 3.070℃条件下处理15 min及经pH 3.0¹0.0的Tris-HCL缓冲液处理2 h,其抗体效价基本无影响。建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.6210.0的Tris-HCL缓冲液处理2 h,其抗体效价基本无影响。建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.62² 000.00 ng/ml范围内,HAV浓度的对数值与A450值之间呈线性相关,R2=0.935,最低检测量为7.81 ng/ml,与市售试剂盒检测结果具有良好的相关性,相关系数为0.952 7。结论制备的抗HAV IgY浓度、纯度、效价均较高,特异性较强,稳定性良好,建立的双抗体夹心ELISA法可用于检测甲肝疫苗生产过程中HAV的抗原含量。     

抗人肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体在CHO细胞中的表达及鉴定

目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofectamine TM 2000转染CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选和单克隆筛选,获得分泌表达抗h TNF-α人源单克隆抗体的CHO细胞株。应用Mab Select Su Re和Capto adhere两步层析纯化抗体后,分析抗体的纯度、N-末端序列、结合动力学平衡常数及中和活性。结果经两步层析后,抗h TNF-α人源单抗经SDS-PAGE分析,可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带,SEC-HPLC纯度为98.79%;抗体的轻、重链N-末端氨基酸序列与预期一致,其结合动力学平衡常数(KD)为1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用,对TNF-α细胞毒的中和率达90%左右。结论在CHO细胞中成功表达了具有较好中和活性的抗h TNF-α人源单克隆抗体。     

肠道病毒71型多克隆抗体F(ab’)2片段的制备及其体外中和效果评价

目的制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)多克隆抗体F(ab’)2片段,并评价其体外中和效果。方法采用硫酸铵分级沉淀法从EV71感染的兔血清中提取Ig G,用胃蛋白酶进行酶解,正交试验确定最佳酶解条件;使用阴离子交换层析(Q Sepharose Fast Flow)纯化得到F(ab’)2片段,采用体外中和试验检测其对EV71的中和效果。结果硫酸铵分级沉淀法得到电泳纯的Ig G;最佳酶解条件为:胃蛋白酶与Ig G按1∶10的质量比混合,47℃反应4 h,在此条件下,F(ab’)2的产率最大值为79.51%,且方差分析表明,酶切比例对F(ab’)2产率的影响最大,温度次之,时间对F(ab’)2产率的影响不明显;经阴离子交换层析纯化,可有效去除Fc片段,得到电泳纯的F(ab’)2;F(ab’)2具有与Ig G、正常血清同等的中和效果。结论成功制备了EV71兔多克隆抗体F(ab’)2片段,初步确定该F(ab’)2片段具有良好的体外中和效果。     

抗咽喉炎常见菌IgY抗体的制备及其特性的研究

目的制备抗β-溶血性链球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌3种咽喉炎常见菌IgY抗体,并分析其特性。方法采用超声波破碎法将3种咽喉菌制备成可溶性抗原液,免疫产蛋母鸡,从鸡蛋黄中提取IgY抗体,应用免疫电泳、ELISA、SDS-PAGE检测抗3种咽喉菌IgY抗体的特性及热稳定性。结果抗原免疫母鸡10d后,鸡蛋黄中即有抗3种咽喉菌的IgY抗体产生,60d时抗体滴度高达1∶102400,IgY抗体滴度在室温可保持5~6个月不变。结论制备的抗3种咽喉菌IgY抗体滴度高,特异性强,稳定性好。     

抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂的制备

目的制备检测抗狂犬病马血清效价的ELISA试剂。方法采用ELISA间接法。先用抗狂犬病病毒IgY包被酶标板,并确定其最适包被浓度;制备酶标二抗,并确定其最佳使用浓度。对试剂的灵敏度、特异性、精密性、稳定性及与小鼠中和试验结果的相关性进行考核。结果抗狂犬病病毒IgY和酶标二抗的最适浓度分别为10!g/ml和1∶1500,试剂灵敏度为0.072IU/ml,特异性良好,批间及试验间变异系数均小于11%,37℃放置3和5d检测样品结果与放置前差异无显著意义,与小鼠中和试验结果呈正相关。结论所制备的抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂盒,可用于抗狂犬病马血清效价的检测。     

人用狂犬病脂质体疫苗的免疫效果

目的对狂犬病脂质体疫苗进行免疫效果评价。方法用狂犬病脂质体疫苗和无佐剂疫苗分别免疫小鼠,以NIH法检测保护效力,RFFIT法检测中和抗体,流式细胞仪检测淋巴细胞表面标记,体外实验法检测淋巴细胞增殖能力,乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞活性,ELISA检测试剂盒检测免疫后小鼠IL-2和IFN水平。结果狂犬病脂质体疫苗与无佐剂疫苗相比,可提高效力2~3倍,脂质体疫苗组中和抗体水平明显高于无佐剂疫苗组,两组之间差异有显著意义。狂犬病脂质体疫苗可增强细胞免疫,小鼠CD4+/CD8+比例、淋巴细胞增殖指数、NK细胞活性、IL-2及IFN活性与无佐剂疫苗相比,差异均有显著意义。结论狂犬病脂质体疫苗可同时增强细胞免疫和体液免疫。     

抗狂犬病病毒中和抗体效价快速荧光灶抑制试验(RFFIT)的建立及应用

目的建立抗狂犬病病毒中和抗体效价的快速荧光灶抑制试验(RFFIT),验证其与小鼠脑内中和法(MNT)的相关性,并用于马抗狂犬病病毒血清(ERIG)和人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)及狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体效价的测定。方法待测血清或免疫球蛋白在96孔板中作3倍系列稀释,与能感染80%～95%细胞量的攻击病毒混合后,37℃体外中和1h,接种BSR细胞,培养24h后荧光染色,荧光显微镜下读取结果。用建立的RFFIT法与MNT法同时标定狂犬病免疫球蛋白国家标准品,并检测ERIG和HRIG以及疫苗免疫后血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价,以比较两种方法的精密度和相关性。结果采用MNT法和RFFIT法检测我国抗狂犬病免疫球蛋白国家标准品的GMT分别为21.4和23.8IU/ml,两种方法的变异系数分别为62.3%和13.3%;两个实验室用RFFIT法测定我国国家标准品的结果分别为21.71和23.81IU/ml。两种方法测定ERIG和HRIG及疫苗免疫后血清中和抗体效价的结果差异无统计学意义,相关系数为0.976,两种方法的检测结果之间呈良好的正相关性。结论RFFIT法可替代MNT法检测抗狂犬病病毒中和抗体效价。     

鼬獾狂犬病病毒分离株的培养及其免疫原性

目的对分离的鼬獾狂犬病病毒BHK-21细胞适应株进行毒力和免疫原性检测,为兽用狂犬病疫苗的生产奠定基础。方法将分离获得的鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在BHK-21细胞上连续传代,采用直接免疫荧光法测定病毒滴度(TCID50);PCR法检测外源病毒和支原体。以β-丙内酯灭活病毒液,将灭活的病毒液免疫犬,采用FAVN法检测狂犬病病毒中和抗体水平,分析其免疫原性。结果鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在体外培养至130代时,病毒滴度可达1.0×107.75 TCID50/ml;未从狂犬病病毒JX08-45株中扩增出犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、腺病毒和支原体的特异性核酸;灭活的病毒液接种犬后产生的中和抗体可持续1年以上,且均在0.5 IU/ml以上。结论鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45经BHK-21细胞传代适应性较好,病毒滴度较高,且具有较好的免疫原性,已具备制备疫苗的基本条件。     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组逆转录病毒的构建及其免疫效果

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)基因的重组逆转录病毒,并检测其对小鼠的免疫效果。方法酶切含狂犬病病毒SRV9株GP基因的质粒pVAX-G,将其克隆至逆转录病毒载体,构建重组质粒pLNCX-G,以脂质体介导转染包装细胞系PA317,筛选阳性细胞克隆并扩大培养。将病毒颗粒感染BHK细胞,采用PCR和RT-PCR法检测GP基因在细胞中的整合及转录,在NIH3T3细胞上测定病毒滴度。以重组逆转录病毒免疫昆明小鼠,通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体效价。结果所构建的重组质粒pLNCX-G经酶切鉴定正确;狂犬病病毒GP基因已整合至BHK细胞基因组中并能正常转录;病毒滴度最高可达1.2×104CFU/ml;肌肉和腹腔注射均可使部分小鼠产生抗狂犬病病毒中和抗体,其阳转率分别为6.7%和86.7%,有效保护率分别为0和76.9%。结论已成功构建了狂犬病病毒SRV9株GP基因的重组逆转录病毒,并可诱导小鼠产生一定的中和抗体,为进一步研究奠定了基础。     

人用无佐剂狂犬病疫苗的接种反应及免疫效果

目的观察人用无佐剂狂犬病疫苗的接种反应及免疫效果。方法使用无佐剂CTN-IV株Vero细胞疫苗和无佐剂AG株原代地鼠肾细胞疫苗免疫健康成人,按暴露后全程免疫程序接种,Vero细胞疫苗接种41人,地鼠肾细胞疫苗接种32人,观察其接种反应及免疫效果。结果接种人用无佐剂狂犬病疫苗后,无严重局部或全身不良反应出现。首剂免疫后14d,两组疫苗抗体阳转率均达100%,中和抗体滴度分别为7.29和6.35IU/ml,二者差异无显著意义。结论无佐剂狂犬病疫苗接种后无严重不良反应出现,且免疫效果良好。     

人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人源抗狂犬病病毒单链抗体(Single-chain fragment variable,scFv)噬菌体抗体库,并进行筛选。方法以接种过狂犬病疫苗的21份高效价的健康人外周血为原料,提取淋巴细胞总RNA,PCR扩增VH、Vκ、Vλ基因,重叠延伸PCR扩增获得scFv基因,克隆入噬菌粒pS100,电转化E.coli TG1,建立scFv初级抗体库,并进行基因序列分析及鉴定。以灭活的狂犬病病毒为抗原,进行3轮scFv噬菌体抗体库的富集筛选,随机挑取单克隆,制备噬菌体抗体颗粒,并进行ELISA分析,阳性克隆进行序列分析,采用快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent facus inhibition test,RFFIT)检测噬菌体抗体颗粒的中和活性。结果获得了库容为1.7×108的人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,该抗体库具有较好的序列正确率和多样性,经3轮筛选后,ELISA分析显示,共获得24个序列各不相同的针对狂犬病病毒的阳性克隆,对其中7个克隆的噬菌体抗体颗粒进行RFFIT检测,均具有中和活性。结论已成功构建了人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,并建立了筛选方法。