双亲灭活原生质体融合选育高性能酒精酵母菌的研究

为了选育高性能的酒精酵母菌,利用双亲灭活和PEG诱导,对酿酒酵母GGFS16和GJ2008单倍体细胞进行了原生质体融合。从42株融合子中筛选得到了2株融合菌株RH3和RH5,分别适合于木薯粉和甘蔗汁酒精发酵,且较好的保持了亲本的特性。其中RH3在耐酸能力上,RH5在酒精耐受能力上要优于亲本,RH3的遗传稳定性要优于RH5。     

原生质体融合构建耐高温高产酒精酵母

选择化学药物和紫外灭活单亲原生质体为遗传标记,以0．01%的三唑酮和紫外照射h-1原生质体2min为遗传标记,采用四因素三水平正交试验确定了融合子LZ-3的浓醪酒精发酵工艺。浓醪发酵的最佳工艺条件是:料水比为1:2,糖化酶用量为400U/g原料,接种量为9%(V/V),初始pH值为5．5,在此条件下,以玉米粉的糖化醪为培养基,发酵72h,LZ-3的酒精产率为9．0%。     

酒精发酵酵母与产黄酮类色素酵母原生质体融合研究

以酒精发酵酵母K211和产黄酮类色素酵母PY-1两酵母菌株为亲本,进行双亲灭活原生质体融合育种实验;以期得到既带色素又有一定产酒力的酒精发酵酵母新菌株.另,过程中对于灭活参数进行初步优化,得到:85℃下对酵母菌K211灭活35min,85℃下对酵母菌PY-1灭活30min,为最佳条件.在融合子初步筛选过程中,通过感官评价进行反复比较筛选,最终得剑6株产酒、产色明显的融合子.通过发酵实验及传代培养,成功地分离出1株产酒力较高的融合子KP8-2.     

Co60诱变原生质体选育高产酒精酵母

将较高产酒精酵母制备成原生质体,经Co^60诱变后,采用四级筛选,得到高产酒精酵母菌株Co-158,其遗传性状稳定。以玉米粉糖化醪为基质发酵72h,成熟醪酒精体积分数为17～％（v／v）,残还原糖为0．0137％。Co-158菌;洙成熟醪酒精体积分数比出发菌株提高了16．34％,比ADY提高了24．48％,残还原糖含量亦远远低于出发菌株和ADY。     

紫外诱变选育高产酯酵母

对从酒曲中筛选出的原生香酵母Y菌液经紫外线照射处理后倾注平板培养,挑选长出的直径较大的菌落接种到试管培养,用杜氏发酵管通过产二氧化碳体积进行初筛,再进行发酵总酯复筛获得1株优良菌株Y-16,其发酵产总酯量可达5.12g/L.原始Y的发酵产总酯量为3.24g/L,诱变后产酯总量提高了58％左右,产酯酵母紫外处理的最佳时间为2min.     

利用紫外线致死原生质体融合技术选育嗜杀啤酒酵母

本文利用紫外线致死原生质体融合技术,在对酿酒酵母(Sacchromyces cereuisiae)亲株CD4-W不做任何遗传标记的条件下,成功地将对紫外线敏感的嗜杀酵母(killer yeast)5174(α.radl ural[KIL-kd,crz~ro~r])菌株的嗜杀质粒转移到CD4—W中,并对5174菌株原生质体的形成及紫外线致死等条件进行了研究。 以PEG—6000作为融合促进剂,促使两种原生质体融合,获得的大量融合子经嗜杀活性检出实验、小型酿造实验、遗传稳定性实验、细胞形态及大小的测定、dsRNA质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳等实验,最终选出5株遗传性能稳定的融合子:FP3—13,FP3—28,FP5—23,FP5—24,FP9—3。对实验结果的进一步分析表明:融合子遗传性状稳定,不仅含有供体菌5174的嗜杀质粒,而且还含有受体菌CD4—W良好的核基因,是遗传稳定的异质体。小型啤酒酿造实验表明:将融合子FP5—24用于啤酒酿造中,对于抵抗野生酵母的污染、净化发酵体系,保证啤酒纯种酿造的进行有明显效果。     

甜高粱秆汁高产酒精酵母原生质体的诱变选育

以南阳酵母菌为出发菌株,采用紫外线对其原生质体进行物理诱变和TTC法初筛,并以甜高粱秆汁为发酵底物进行发酵试验,最终选育出高产酒精的NY-09菌株。试验结果表明,经紫外线照射20s～30s,致死率为78.7%～86.56%,发酵48h后发酵液残糖为2.09g/mL,酒精度为11.2%,较出发菌株提高了23.3%。经过连续转接10代,NY-09的发酵性能无明显变化,表现稳定。     

利用单灭活原生质体融合技术选育降酸能力强的葡萄酒酵母

目的:选育既有较好的发酵性能,又有较强的降酸能力的葡萄酒酵母菌种用于葡萄酒的生产。方法:通过发酵性能好的长城葡萄酒酵母单倍体L13(Lys-)(赖氨酸缺陷型)的原生质体与灭活的降酸能力强的粟酒裂殖酵母1685(Ino-)(肌醇缺陷型)的原生质体进行融合实验,然后通过传代稳定性、降酸鉴定及发酵实验,选育既有较好的发酵性能,又有较强的降酸能力的葡萄酒酵母菌种。结果:得到28株融合子,融合率为6.8×10-7,最终获得了1株传代稳定的融合子G8,降酸率为30.4%。结论:利用单灭活原生质体融合技术,选育出1株发酵力强、降酸性能好葡萄酒酵母菌株。     

高产酒精絮凝酵母SY-130菌株的选育

以絮凝性强的葡萄汁酵母SN—154和高产酒精酵母菌种NHY4—36做亲本，通过原生质体融合技术，获得1株发酵速度快、高产酒精且絮凝性强的酵母菌株SY—130，以玉米淀粉为原料，32Y发酵60—68h，可产酒精17．5％—18．5％(v／v)，耐酒精度可达20％以上，酵母絮凝性能良好。     

紫外灭活原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究

对米曲霉AS3.951和CICC2339的原生质体进行紫外灭活,然后对灭活双亲用PEG作融合剂进行原生质体融合。从融合子中选出10株生长速度快、菌落直径大的融合株,接种到酪素平板上测其Hc值,并与亲本菌株进行比较。结果发现,10株融合株的Hc值均比生长速度快而产酶量低的亲本菌株AS3.951大,菌株AC211、AC214、AC215、AC217、AC219的Hc值还超过了产酶量高的亲本菌株CICC2339。      

紫外灭活原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究

对米曲霉AS3.951和CICC2339的原生质体进行紫外灭活,然后对灭活双亲用PEG作融合剂进行原生质体融合。从融合子中选出10株生长速度快、菌落直径大的融合株,接种到酪素平板上测其Hc值,并与亲本菌株进行比较。结果发现,10株融合株的Hc值均比生长速度快而产酶量低的亲本菌株AS3.951大,菌株AC211、AC214、AC215、AC217、AC219的Hc值还超过了产酶量高的亲本菌株CICC2339。     

利用电场诱导原生质体融合技术选育高产耐高温酵母融合株

本实验以酒精生产菌株ｓｂ７２４的呼吸缺陷突变株ｒｈｏ－和１３００（Ｈｉｓ－）及耐高温菌株ｙ－ｗ（Ａｐｓ－）（假丝酵母）为出发菌株，采用电场诱导原生质体融合技术，经发酵筛选获得了２株稳定的单核融合子Ｆ１６和Ｆ１９。同时对两株融合子的生物学特性、倍性遗传稳定性及耐高温和发酵性能的测试结果表明：Ｆ１６为三倍体，不生假丝；Ｆ１９为非整倍体，也不生假丝。它们在３８℃下比生产菌株ｓｂ７２４的酒精生产率分别增加１２２％和４６７％。     

微波-紫外灭活原生质体融合选育米曲霉菌株的研究

实验对生长速度较快但产酶能力较低的米曲霉CICC2339的原生质体采用700W微波灭活12s,对产酶能力较高但生长速度较慢的米曲霉AS3.951的原生质体采用15W紫外灭活5min,然后对灭活双亲用PEG作融合剂进行原生质体融合,融合率达到了7.6%。通过测定Hc值以及蛋白酶活力大小,最终筛选出编号为CAW202、CAW205和CAW210的三株融合株,其生长速度快且蛋白酶活力还高于产酶能力较高的亲本菌株CICC2339;三株融合株的蛋白酶活力分别为10450U/g、9730U/g、10780U/g,其中融合株CAW202和CAW210的蛋白酶活力比亲本菌株CICC2339有了显著的增加,分别提高了7.8%和11.25%。     

酒精酵母原生质体制备与再生条件研究

对南阳酒精酵母(Saccharomycescerevisiae)1308原生质体制备和再生条件进行了研究。结果表明,取对数中期的酵母细胞,用0.1%-β巯基乙醇进行预处理后,再用5mL内含4mg/mL蜗牛酶和4mg/mL纤维素酶的混合酶液酶解1.5h,酒精酵母1308的原生质体制备率达93.6%,再生率达15.9%。     

紫外诱变原生质体选育发酵乳清高产酒精的克鲁维酵母

以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克鲁维酵母菌株ZR-20。采用3因素3水平的正交试验对发酵条件进行优化,结果表明,其适宜的发酵工艺条件为:温度28℃,pH值4.9,接种量2×107个/mL;该条件下发酵96 h酒精产率达到4.2%,比优化前的酒精产率提高10.5%,较出发菌株提高了68%。     

产酯酵母和耐高温酵母原生质体形成与再生条件研究

选取脱壁预处理时间、蜗牛酶浓度、酶解时间三因素设计三因素三水平正交试验来研究产酯酵母和耐高温酵母原生质体形成与再生条件。结果表明,产酯酵母原生质体形成与再生最佳条件为：预处理20min、1%蜗牛酶酶解30min;耐高温酵母为：预处理10min,1.5%蜗牛酶酶解60min。     

高活性高酒精产率产酯酵母菌株的选育

本文通过测定选择Ａａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ１３００和Ｈａｎｓｅｎｕｌａａｒｏｍａｌａ１３１２做为亲本，利用细胞融合技术使其杂交获得成功。利用不可逆生化抑制剂碘乙酸（０．１％）处理Ｈ．ａｒｏｍａｌａ１３１２的原生质体４０分钟，使其１００％不能再生，与Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ１３００（ａ）融合后，在融合子中表达了Ｈ．ａｎｏｍａｌａ１３１２的性状，如同化ＫＮＯ＿３等。融合子ＦＳＨ－１２在１２Ｂｘ米曲汁发酵中酒精为６．２％（ｗ／ｖ），产乙酸乙酯０．４０９％（ｗ／ｖ），同化硝酸盐。在产孢培养基上不形成孢子。酒精的耐受力为１０．５％（ｖ／ｖ），在ｐＨ３时生长良好，并能产酯。经固态发酵实验，证明该融合子能够适应酒醅中的环境，因此，ＦＳＨ－１２具有一定的实用意义。     

热-紫外灭活双亲原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究

对米曲霉（AS3．951）GIM3．13和CICC2339的原生质体分别进行热灭活及紫外灭活,然后对灭活双亲用PEG（6000）作融合剂进行原生质体融合。融合实验最佳PEG（6000）浓度为35％,溶液pH值为7．5,融合率为4．24％。从融合子中选出17株生长速度快、菌落直径大的融合株,接种到酪素平板上测其Hc值,并与亲本菌株进行比较。结果发现,其中8株融合株的Hc值明显比生长速度快而产酶量低的亲本菌株GIM3．13大,菌株16号的Hc值还超过了产酶量高的亲本菌株CICC2339。     

利用原生质体融合技术构建梨酒酵母工程菌

以菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae YDJ05及产香酵母Issatchenkia orientalis YS03为融合亲本X和Y,通过原生质体融合技术构建适合梨酒酿造的酵母工程菌,研究结果表明:利用EMS诱变亲本菌株Y,得到了一株精氨酸营养缺陷型菌株,亲本菌株X和Y采用蜗牛酶液在35℃下处理100min,得到菌株X、Y的原生质体融合率分别为93.6％、94.2％,再生率分别为27.8％、31.6％.以加热的方式灭活亲本菌株X,灭活时间为14min.在以PEG为促融剂的条件下对两株菌进行原生质体融合,经过优选得到融合子D J02,其产酒精率、产香率等指标最优,分别达到了9.87％、0.37g/L.     

产酯酵母的选育及鉴定

为了寻找适合于浓香型曲酒酿造的产酯酵母,提高名优酒比率,自1986年8月起,我们先后在四川部份名优酒厂采集了窖泥、母糟、曲药等近400个样品,进行了产酯酵母的分离选育,经过两年多的精心筛选,选育出产酯量达800mg/100ml的产酯酵母菌株,其产酯能力高于国内已有菌株,在生产中应用有明显的效果。为了对菌株有详细准确的认识,参照国际上惯用的荷兰Lodde博士提出的酵母鉴定方法及检索表,对该菌株进行了鉴定。