抗人细胞间粘附分子-1嵌合抗体的制备及其生物学活性

目的构建抗人细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)嵌合抗体的真核表达质粒,在CHO-dhfr-细胞中进行表达,并检测其生物学活性。方法采用RT-PCR法从特异性分泌抗人ICAM-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F2中扩增抗体VH和VL基因,从人淋巴细胞RNA中扩增人κ、IgG1的轻、重链恒定区序列,再通过重叠延伸PCR连接鼠源性可变区基因片段与人源性恒定区基因片段,获得人-鼠嵌合抗体基因;将轻、重链基因连接至pIRES双表达载体,构建嵌合抗体真核表达质粒;将质粒在脂质体LipofectAMINE介导下转染CHO-dhfr-细胞进行表达,表达的嵌合抗体经Protein A-Sepharose 4B亲和层析柱纯化后,紫外分光光度法测定抗体浓度,ELISA法检测嵌合抗体的特异性抗原结合活性及人源性,并进行还原性SDS-PAGE分析、Western blot分析及抑制细胞间黏附活性分析。结果嵌合抗体真核表达质粒pIRES-anti-ICAM-1经双酶切鉴定构建正确;嵌合抗体在真核细胞CHO-dhfr-中高效表达,培养上清中表达量可达0.5 mg/L;纯化的嵌合抗体经10%还原性SDS-PAGE分析,可见相对分子质量分别约为25 000的IgG轻链和50 000的IgG重链,相对分子质量约25 000的蛋白可被羊抗人IgGκ链所识别,而相对分子质量约50 000的蛋白可被羊抗人IgGγ链所识别;纯化的嵌合抗体可与羊抗人κ链或羊抗人IgG多抗呈强阳性反应,可与人ICAM-1抗原特异结合;该嵌和抗体具有良好的抑制内皮细胞与单核细胞黏附的活性。结论成功制备了抗人ICAM-1嵌合抗体,并在真核细胞中实现高表达,该抗体减少了鼠源性成分,降低了其免疫原性,为ICAM-1相关的炎性疾病的抗体治疗奠定了基础。     

抗转铁蛋白受体鼠源性单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的　利用基因工程技术将鼠源性单克隆抗体WuT9改造成单链抗体。方法　从分泌抗CD71单克隆抗体的杂交瘤细胞WuT9中提取总RNA ,采用OligodT为逆转录引物 ,逆转录合成cDNA第一链 ,然后分别采用VL 和VH 框架区的PCR引物 ,扩增VH(重链可变区 )和VL(轻链可变区 )DNA片段 ,利用事先合成的存在于VL 下游引物和VH 上游引物的部分人工连接子重叠互补序列 ,将VL 和VH 的PCR回收产物进行部分重叠PCR(SOE) ,形成单链抗体基因。最后将此基因重组进表达载体pBAD gIII C中 ,经L arabinose(左旋阿拉伯糖 )诱导表达并初步鉴定。结果　构建出 70 0bp左右的单链基因 ,并获得阳性重组表达载体克隆 ,表达产物为相对分子质量 2 70 0 0左右的蛋白分子。结论　经因特网查询表明 ,单链抗体基因重链部分属于小鼠H链可变区ⅠA亚组 ;轻链属于小鼠κ轻链可变区Ⅱ亚组 ,此单链抗体基因的表达产物具有一定的特异结合活性。本研究为抗CD71单链抗体的临床应用打下了基础。     

抗乙型肝炎病毒表面抗原的IgG全抗体表达载体的构建

目的构建抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的IgG全抗体杆状病毒表达载体。方法用PCR方法扩增抗HBsAg抗体Fab片段的轻链(L)及重链Fd段(VH+CH1)基因片段,将杆状病毒载体pAC-k-Fc与L基因连接,重组为过渡表达载体pAC-k-L-Fc,再与Fd基因连接,构建重组表达载体pAC-HBs-Fc,并进行酶切鉴定及DNA测序分析。确定正确后,转染昆虫细胞sf9,用免疫荧光检测IgG的表达。结果PCR扩增的片段约650bp,与预期值一致。载体pAC-k-L-Fc和pAC-HBs-Fc的酶切片段和DNA序列与预期结果一致。转染sf9细胞呈阳性荧光反应,未转染细胞呈阴性荧光反应。结论已成功构建表达载体pAC-HBs-Fc,为表达抗人HBsAg的IgG全抗体奠定了基础。     

大容量人源天然噬菌体抗体库的构建

目的构建大容量(>108)的人源天然噬菌体抗体库。方法提取人外周血淋巴细胞mRNA,反转录出cDNA第一链,以此为模板,PCR扩增重链(VH)和轻链(VL)基因片段。将VL基因PCR产物插入含Loxp和Loxp511序列的pDF载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建轻链库,再将VH基因PCR产物插入轻链库载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建初级库。进一步用初级库超感染BS1365菌,使其VH与VL发生重组,获得重组库,再利用重组库感染大肠杆菌XL1-Blue,构建工作库。结果所有VH和VL亚类基因的扩增产物片段大小均与理论值相符,轻重链基因的克隆效率均为100%。初级库容量为108,滴度为6×1013;重组后的工作库有效容量为8×1010,滴度至少为1×1013。结论已构建容量为1010的人源天然噬菌体抗体库。     

小鼠MUC1基因的克隆及其在大肠杆菌DH5α中的表达

目的构建表达小鼠MUC1基因的工程菌,并纯化重组小鼠MUC1融合蛋白。方法通过RT-PCR扩增小鼠MUC1基因片段,连入pMAL-p2原核表达载体,并转化大肠杆菌DH5,αIPTG诱导表达,经Western blot鉴定,Amylose Resin亲和层析纯化。结果获得了小鼠MUC1 708bp DNA片段,并构建了pMAL-mMUC1表达载体。表达产物相对分子质量约为67000,经Western blot鉴定,与兔抗MBP多克隆抗体产生特异性反应。纯化的融合蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带。结论成功构建了表达小鼠MUC1蛋白的工程菌。     

肺炎链球菌DnaJ蛋白的原核表达及其免疫保护效果

目的原核表达肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)热休克蛋白40(heat shock protein 40,HSP40,DnaJ),并探讨其免疫保护效果。方法从2、3、6B、14、19F、R6型肺炎链球菌基因组DNA中扩增DnaJ基因,插入原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-DnaJ,转化大肠埃西菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组DnaJ蛋白经Ni-NTA树脂纯化后,分别经腹腔和鼻黏膜免疫小鼠,采用ELISA法检测小鼠血清和唾液中特异性IgG和IgA抗体滴度;用重组蛋白刺激小鼠脾细胞,ELISA法检测细胞因子水平的变化;流式细胞术检测特异性抗DnaJ血清结合到肺炎链球菌表面的能力;检测抗DnaJ血清抑制R6型肺炎链球菌黏附A549细胞的能力。结果 6株肺炎链球菌的PCR扩增产物均可见1 119 bp的DnaJ基因片段,测序结果与GenBank中登录的序列一致;重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确;纯化的重组DnaJ蛋白相对分子质量约为38 000,纯度达90%以上,可与DnaJ小鼠免疫血清发生特异性反应。腹腔免疫DnaJ可使小鼠血清产生高滴度的特异性抗DnaJ抗体,鼻黏膜免疫DnaJ可增加小鼠血清和黏膜中抗DnaJ IgG和IgA抗体水平(P<0.01);鼻黏膜免疫DnaJ可使小鼠脾细胞释放高水平的细胞因子IL-10、IFNγ和IL-17A;抗DnaJ血清对肺炎链球菌具有更强的结合能力,且可抑制肺炎链球菌黏附肺癌上皮细胞A549。结论 DnaJ可诱导小鼠产生保护性免疫应答,提示其具有作为肺炎链球菌蛋白疫苗抗原的潜力。     

人Bik基因的克隆、表达与纯化

目的克隆人Bik基因,并进行表达及纯化。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增Bik基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物进行GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到483bp的DNA片段,重组质粒pGEX-6p-1-Bik经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体总蛋白的38%,纯化后蛋白纯度达96%。结论已成功克隆并利用原核表达系统表达了人Bik基因,为进一步研究Bik蛋白结构和功能奠定了基础。     

抗ICAM-1单克隆抗体的制备及其活性

目的制备具有生物活性的抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体。方法以人ICAM-1为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术并经HAT选择培养和克隆化,筛选出稳定分泌抗人ICAM-1 McAb的杂交瘤细胞株,并对McAb进行纯化。用ELISA间接法测定效价并鉴定其亚类,Western blot鉴定其抗原特异性,细胞黏附试验检测其中和活性。结果筛选出1株可稳定分泌抗人ICAM-1抗体的杂交瘤细胞株3F2,杂交瘤染色体众数为98~104。纯化后的单抗蛋白浓度为1.253 mg/ml,纯度达83.6%,效价可达2.56×105。其分泌的抗体亚型为IgG1,腹水效价达5.12×105,可与ICAM-1特异性结合,可抑制ICAM-1与淋巴瘤细胞间的黏附,具有明显的中和ICAM-1的活性。结论已成功制备出抗ICAM-1的McAb,为其进一步的研究和应用奠定了基础。     

人源核糖体展示单链抗体库的构建

目的构建人源核糖体展示单链抗体(scFV)库。方法从人外周血单个核细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以此为模板,设计多对具有简并性特点的引物,PCR扩增人免疫球蛋白重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在其两端加上核糖体展示所需元件,并通过重叠PCR法将VH和VL经(Gly4Ser)3短肽连接成单链抗体,构建核糖体展示库。结果利用不同引物进行PCR时,绝大多数引物能扩增出300～400 bp的VH和VL片段;通过大引物扩增成功加上了核糖体展示所需元件,重叠PCR体外连接成约900 bp大小的scFv基因,大量扩增得到核糖体展示库。结论已成功构建了人源核糖体展示scFv库,为人源抗体药物的开发奠定了基础。     

人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的表达和鉴定

目的对人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体A12进行可溶性表达及特异性和中和活性检测。方法表达人源单链抗体A12的菌株,经诱导后进行SDS-PAGE及Western blot检测,用流式细胞仪(FACS)检测表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染Vero细胞的能力,用快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测表达产物的中和活性。结果Western blot显示表达产物与抗C-myc抗体在相对分子质量约30 000处出现强阳性表达带。FACS表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染的Vero细胞出现特异性反应。RFFIT表明,A12 ScFv在1∶27倍稀释时能完全中和病毒。结论已获得了A12可溶性表达,表达产物能与狂犬病毒G蛋白特异性结合,并对狂犬病毒具有一定的中和活性。     

百日咳毒素S1亚基片段在大肠杆菌中的表达

目的构建百日咳毒素(PT)S1亚基片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的百日咳毒素S1亚基基因序列,人工合成密码子优化的S1基因,利用重叠PCR技术将S1基因上的两段DNA序列拼接在一起,形成一个新的基因序列S1′。将该序列与7ZTS表达载体连接,构建重组原核表达质粒7ZTS-S1′,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果S1′基因经PCR鉴定及测序证明与预期相符;重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达蛋白的相对分子质量约17400,表达量约占菌体总蛋白的8%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建百日咳毒素S1亚基片段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为PT单抗及其检测试剂盒的研制奠定了基础。     

HCV核心抗原N-端片段生物素化表达质粒的构建及表达

目的构建HCV核心(C)抗原N-端1～130aa片段的生物素化表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达。方法PCR扩增HCV C抗原N-端1～130aa片段的编码基因,拼接上生物素-蛋白连接酶底物肽序列(BSP),构建重组原核表达质粒pGEX4T-1-CN130BSP,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE后,电转至硝酸纤维素膜上,以抗HCVC抗原的单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素对表达产物进行分析。结果PCR扩增出约466bp的目的基因片段;质粒pGEX4T-1-CN130BSP经PCR及双酶切鉴定,与预期结果一致,测序鉴定基因无突变;SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为42000,22℃诱导16h可溶性表达产物含量较高;表达的重组蛋白可被抗HCV C抗原的单克隆抗体所识别,并能特异性结合辣根过氧化物酶标记的亲和素。结论已成功构建了HCV C抗原N-端1～130aa片段生物素化表达质粒,并表达出带生物素标签的GST融合蛋白,为进一步研制HCV双抗原夹心检测试剂奠定了基础。     

HIV-1C亚型调控蛋白Nef在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型调控蛋白Nef,为研制HIV疫苗寻找新的途径。方法通过PCR扩增,获得HIV-1C亚型Nef基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。结果表达产物是相对分子质量为50000的GST融合蛋白,且能与p27单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Nef蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达。     

人类免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白(Gag)在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白Gag,为HIV感染的诊断和疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增获得HIV1gag基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX5X1的tac启动子下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westernblot分析验证其表达产物。结果表达产物是相对分子质量为82000的GST融合蛋白,且能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Gag蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达,且具有良好的抗原性,可进一步用于HIV感染及动物免疫等方面的研究。     

抗HIV-1gp120单链抗体的原核表达与初步纯化

目的 在原核细胞表达抗HIV-1gp120单链抗体基因,纯化后检测其活性。方法 将单链抗体基因插入pET28原核表达载体进行诱导表达,对包涵体进行变性复性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达的蛋白进行初步纯化,纯化后的单链抗体与gp120标准抗原膜条反应。结果 表达产物主要以包涵体形式存在,最高表达量占菌体总蛋白量的51％,金属螯合层析一步纯化后纯度超过85％。纯化后的单链抗体可以特异地识别gp120标准抗原。结论 在原核细胞表达的单链抗体,复性纯化后具有生物学活性。     

HIV-1 Vif基因的克隆与原核表达

目的克隆HIV-1Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600bp的Vif基因片段,测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫描分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1g/L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。     

CD25抗体轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析

目的 获得抗人ＣＤ２５分子单抗的轻链及重链可变区基因,并进行序列分析。方法 采用ＲＴ－ ＰＣＲ,从ＷｕＴａｃ细胞总ＲＮＡ中扩增出轻链、重链可变区基因,进行克隆并作核苷酸序列分析。结果　构建的ＰＭＤ１８ －Ｔ－ＶＬ和ＰＭＤ１８－Ｔ－ＶＨ重组克隆载体,酶切与预期结果相符。ＶＨ和ＶＬ基因序列与鼠抗体的同源性大于 ８０％。克隆的重链可变区基因长度为３５１ｂｐ,属于鼠重链Ⅲ（Ｃ）亚类。轻链可变区基因长度为３２４ｂｐ,属于鼠轻链 Ⅳ 亚类。结论 本研究采用ＲＴ－ＰＣＴ法扩增出轻链及重链可变区基因,并进行了序列测定和分析,为进一步构建嵌 合抗体以及单链抗体奠定了基础。     

人巨细胞病毒pp65基因片段的原核表达及鉴定

目的构建人巨细胞病毒(HCMV)pp65基因片段(363～505位氨基酸)的原核表达质粒,并鉴定所表达蛋白的反应原性。方法以含有HCMVpp65全长基因的pGEM-T-pp65质粒为模板,PCR扩增pp65基因第1087～1515位核苷酸片段,酶切后插入pET-21a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,纯化后进行Western blot鉴定。结果酶切分析和测序证明原核表达质粒pET-21a(+)-pp65构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,以1.0mmol/L IPTG诱导5h,目的蛋白的表达量最高。纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功构建了HCMV pp65基因片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了融合蛋白。     

人溶菌酶基因的原核表达及其生物学活性

目的在大肠杆菌中表达人溶菌酶(hLYZ)基因,并检测其生物学活性。方法将人溶菌酶基因克隆至带有GST融合标签的原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定,并用溶壁微球菌比浊法检测酶活性,热激法检测其生物学活性。结果经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重组表达质粒pGEX-4T-hLYZ构建正确。SDS-PAGE显示,在相对分子质量约40000处可见目的蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的46.5%,目的蛋白在裂解沉淀中占17.0%,在裂解上清中占58.3%,主要以可溶形式表达。纯化后,重组蛋白纯度可达95%以上,且具有良好的反应原性。重组hLYZ酶活性为2389U/mg,对金黄葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制作用。结论已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性重组人溶菌酶,且具有较高的生物学活性。