中间代谢产物对白色链霉菌ε-聚赖氨酸合成的影响

探讨白色链霉菌ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)生物合成过程中,中间代谢产物柠檬酸、L-天冬氨酸和L-赖氨酸对ε-PL合成的影响。单因素实验结果表明,在摇瓶发酵开始(0 h)添加柠檬酸至终质量浓度为1.0g/L,培养到12 h分别添加终质量浓度为0.3 g/L的L-天冬氨酸和终质量浓度为1.0 g/L的L-赖氨酸,可分别提高ε-PL产量42.5%、28.7%和44.1%。正交试验显示,只有柠檬酸和L-赖氨酸对ε-PL合成影响显著(P0.05),而L-天冬氨酸影响不显著;在培养基中添加1.0 g/L的柠檬酸和L-赖氨酸ε-PL产量可提高60.1%。在破碎的无细胞体系中,只有添加L-赖氨酸可以检测到ε-PL的生成,进一步证实了L-赖氨酸是ε-PL合成的直接前体。因此,通过添加合适的中间代谢产物,可以有效提高ε-PL产量。     

过表达pls基因结合前体流加提高小白链霉菌ε-聚赖氨酸产量

为了提高小白链霉菌(Streptomyces albulus)的ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)发酵产量,以进一步降低其生产成本,该研究通过过表达ε-PL合成酶基因pls增强S. albulus合成ε-PL能力,并结合前体和能量辅因子流加强化其发酵过程。研究结果显示,过表达菌株S. albulus M-Z18/p IB139-pls的pls基因转录上调了16. 8倍,摇瓶ε-PL产量达到(2. 74±0. 23) g/L,5 L发酵罐ε-PL产量达到40. 62 g/L(144 h)。为进一步满足过表达菌株合成ε-PL过程中对前体和能量辅因子的需求,通过优化L-赖氨酸和ATP外源添加浓度,最终建立S. albulus M-Z18/p IB139-pls在5 L发酵罐中同时流加5. 0 g/L的L-赖氨酸和1. 0 mmol/L ATP的补料分批发酵方式,实现ε-PL产量达到45. 09 g/L(144 h),较对照菌株S. albulus M-Z18/p IB139提高了20. 8%。因此,采用过表达pls基因并结合补充前体L-赖氨酸和能量辅因子ATP是一种有效...     

辅助能量物质柠檬酸促进ε-聚赖氨酸的合成

为提高ε-聚赖氨酸(ε-PL)合成能力,考察了柠檬酸对Streptomyces sp.M-Z18菌体生长和ε-PL合成的影响。研究发现,柠檬酸作为辅助能量物质,对ε-PL发酵过程影响显著。通过对柠檬酸添加时间、添加量和pH值的优化,确定了最佳柠檬酸添加方式,结合补料-分批发酵工艺,显著提高了ε-PL的产量。实验结果表明,在5L发酵罐中,维持pH为3.8,初始柠檬酸添加量为20 g/L时,分批发酵ε-PL的产量达到9.50 g/L,产率达到4.40 g/(L.d),较未添加柠檬酸发酵分别提高了46.4%和48.1%。采用添加柠檬酸的补料-分批发酵工艺,发酵168 h后ε-PL的产量达到22.89 g/L,是分批发酵的2.41倍。     

碳源和氮源流加方式对ε-聚赖氨酸补料-分批发酵过程的影响

为实现Streptomyces sp.M-Z18补料-分批发酵甘油生产ε-聚赖氨酸(ε-PL)的自动流加碳源和解决因发酵中后期菌体生长速率下降/停滞引起ε-PL合成速率下降的问题,该文首先借助DO-stat反馈补料方法,考察了补料阶段甘油控制在不同浓度范围内对ε-PL合成的影响;然后,通过在发酵中期分别流加牛肉膏和酵母粉,研究了2种有机氮源对发酵中后期菌体生长和ε-PL合成的影响;最后,在2阶段pH调控策略基础上,评价了上述最优控制条件下对Streptomyces sp.M-Z18合成ε-PL的促进作用。实验结果表明,依靠DO-stat反馈补料方式将补料阶段甘油浓度稳定控制在0¹0 g/L,并在发酵96 h开始流加酵母粉和(NH4)2SO4混合液,结合pH值2阶段调控策略(3.5→3.8),经过192 h发酵,可以实现ε-PL产量达到38.77 g/L,产率达到4.85 g/(L·d)。基于碳源和氮源流加方式的优化,建立的DO-stat反馈流加甘油策略和提出的发酵中期流加酵母粉和(NH4)2SO4混合液的方法是提高ε-PL发酵水平的有效方法之一。     

葡萄糖发酵生产ε-聚赖氨酸工艺优化

为建立Streptomyces albulus M-Z18以葡萄糖为碳源的ε-聚赖氨酸(ε-PL)高效发酵工艺,对葡萄糖和硫酸铵的流加方式和控制浓度、pH控制条件和溶氧控制水平进行了系统研究。研究结果表明,葡萄糖补料采用脉冲补料方式控制维持在10~30 g/L范围,氨氮补料采用脉冲补料方式维持在0.1~0.5 g/L范围,pH冲击时间为9 h、恢复pH为3.85,发酵中后期最佳溶氧水平为20%左右为最优ε-PL发酵工艺控制条件。经过8天补料-分批发酵,实现ε-PL产量达到47.13 g/L,菌体量为57.08 g/L,相比于优化前,ε-PL产量和菌体量分别提高了27.34%和19.61%。上述研究结果为ε-PL工业化生产奠定了基础。     

添加ATP和生物素优化ε-聚赖氨酸发酵的研究

以白色链霉菌（Streptomyces albulus）突变株为研究对象,研究不同发酵时间在发酵培养基中添加ATP、生物素对ε-聚赖氨酸产量的影响。结果表明,在发酵36h时添加2mmol/L的ATP的产量比对照组提高了21.88%,达到1.17g/L;在0h、36h添加400μg/L生物素的ε-PL产量分别比对照组提升了30.88%和18.52%;通过进一步正交试验发现,在36h时添加300μg//L的生物素以及2mmol/L的ATP对该白色链霉菌ε-PL产量提升最大,比对照组提高了34.04%,产量达到1.193g/L,说明外源添加ATP和生物素对白色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸有促进作用。     

外源氧载体和前体L-谷氨酸添加策略提高Bacillus subtilis HB-1发酵产γ-聚谷氨酸

为了提高外源L-谷氨酸依赖性菌株枯草芽孢杆菌HB-1产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的能力,采用添加氧载体和前体L-谷氨酸的策略,研究其对菌体生长和γ-PGA产量的影响。摇瓶单因素结果表明,最佳氧载体为聚二甲氧基硅烷(PDMS),在原始培养基中添加体积分数为10%的PDMS,菌体OD600提高了3～5倍;前体L-谷氨酸的最适添加时间为18 h,最适添加质量浓度为10 g/L。在3 L发酵罐扩大培养后,γ-PGA产量提高到45 g/L;在发酵30 h流加碳源和前体L-谷氨酸,γ-PGA质量浓度达到52 g/L。发酵产物经红外,氨基酸分析仪等证实其为多肽类化合物,相对分子质量高达1 000万。     

柠檬酸钠和生物素对白色链霉菌发酵产ε-聚赖氨酸的影响

本文研究了不同生长期在培养基中添加柠檬酸钠和生物素对白色链霉菌生长及产ε-PL的影响,结果表明添加不同浓度柠檬酸钠对菌体生长的影响不明显,但对白色链霉菌ε-PL合成有正向促进作用。0 h添加2 g/L的柠檬酸钠可获得最大的ε-PL产量0.92g/L。随着柠檬酸钠浓度的增加,ε-PL产量先增加后降低。在0 h添加2 g/L柠檬酸钠并在36 h添加300μg/L生物素,发酵72 h后菌体干重和ε-PL产量分别达到了7.86 g/L和1.10 g/L,是空白对照组的1.30倍和1.93倍,说明外源添加柠檬酸钠和生物素对白色链霉菌发酵生产ε-PL有促进作用。     

优化有机氮源提高小白链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸效率

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是小白链霉菌(Streptomyces albulus)分泌产生的一种同型氨基酸聚合物,具有广泛的抑菌活性,目前被多个国家批准使用,是一种优良天然食品防腐剂。为了进一步提高S. albulus GS114的ε-PL发酵产量,对其发酵培养基中有机氮源的种类及浓度进行了系统优化,并对ε-PL产量提高的原因从氨基酸方面进行了初步解析。研究结果显示,S. albulus GS114的最佳有机氮源为酵母浸粉FM760,最佳添加质量浓度为9.27 g/L,在此条件下,摇瓶自然发酵中ε-PL产量达到(2.60±0.02) g/L,较对照有机氮源提高了22.07%;在pH受控的分批发酵中,ε-PL产量达到(6.41±0.23) g/L,较对照提高42.64%;在补料分批发酵中,ε-PL产量达到62.38 g/L,较对照提高了18.80%,葡萄糖转化率提高了25.77%。同时,通过氨基酸添加实验,初步发现酵母浸粉FM760提高ε-PL产量可能与异亮氨酸、亮氨酸和丙氨酸有关。该研究结果对工业发酵生产ε-PL的有机氮源选择具有重要指导意义。     

外源添加维生素C对链霉菌ε-聚赖氨酸发酵的影响

采用荧光染色分析ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)产生菌Streptomyces sp. AF3-44在摇瓶发酵过程中胞内活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平与菌体活力,比较添加Vc对ε-PL产量、抗氧化酶类活性、总抗氧化能力、细胞膜脂成分及细胞氧化损伤的影响,并在5 L发酵罐上对比了添加Vc后分批发酵过程参数的变化。在摇瓶发酵过程中,随着p H值降低和ε-PL浓度的上升,Streptomyces sp. AF3-44胞内ROS累积,菌体活力下降;而Vc的添加提高了细胞的总抗氧化能力及膜脂中不饱和脂肪酸所占比例,减少了氧化损伤;在5 L发酵罐中添加Vc,分批发酵44 h,ε-PL产量为7. 73 g/L,为不添加Vc发酵的1. 5倍。通过外源添加抗氧化剂,增强菌体抗氧化能力,减少氧化损伤,为提升链霉菌ε-PL的发酵水平提供了一种新的策略。     

动态pH值调控策略提高ε-聚赖氨酸发酵产量及其原因解析

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一种通过微生物发酵法生产的同型氨基酸聚合物。为了提高Streptomyces albulus GS114的ε-PL发酵产量,建立了一种基于动态pH值调控溶氧水平的发酵策略,并从氧化损伤与抗氧化角度对该策略提高ε-PL发酵产量的原因进行了初步解析。研究发现,在发酵中后期通过调节pH值来控制溶氧水平保持在20%～40%,实现了菌体干重达到62.03 g/L,ε-PL产量达到60.2 g/L,分别比未调控提高了59%和36%。对S.albulus GS114胞内氧化损伤和抗氧化能力进行分析发现,采用该调控策略一方面增加了菌体胞内活性氧水平,另一方面也增强了菌体的总抗氧化能力。不同pH发酵过程的菌体胞内活性氧水平、氧化损伤程度和总抗氧化能力分析发现,菌体生长、活性氧水平、氧化损伤程度和总抗氧化能力均与pH值呈正相关。因此,动态调节pH值策略显著增强菌体生长的同时,带来了菌体胞内活性氧水平、氧化损伤程度和总抗氧化能力的提高,但菌体的总抗氧化能力实现了活性氧水平和氧化损伤维持在适当水平,进而促进了ε-PL在发酵中后期的生物合成。该研究不仅对...     

菌丝体形态对淀粉酶产色链霉菌CGMCC3145发酵生产ε-聚赖氨酸的影响

采用淀粉酶产色链霉菌CGMCC3145发酵生产ε-聚赖氨酸(ε-PL),考察Mg2+和孢子浓度对菌丝体形态和ε-PL的影响。结果表明,Mg2+可以使菌丝体更好地分散,培养基中添加0.5 g/L Mg2+,ε-PL比对照组提高了30.91%;发酵初始时添加Mg2+对ε-PL的生物合成最有利。当接种1.0×105 cfu/mL孢子悬液时,菌丝球直径为1.0×108 cfu/mL的2.66倍。相反,ε-PL产量、生物量、菌丝球的体积和菌丝球个数/mL与孢子接种浓度呈正相关,当接种1.0×108 cfu/mL孢子悬液时,上述4个指标分别比接种1.0×105 cfu/mL时提高68.2%、58.8%、126.2%和114.9%。     

50L自控式发酵罐中ε-聚赖氨酸发酵条件的优化

在50L自控式发酵罐上进行了ε-聚赖氨酸(ε-PL)发酵条件的优化研究,主要考察了分批发酵和补料分批发酵过程中pH、搅拌转速对ε-PL发酵和菌体生长的影响。结果表明,当控制pH在5.0以上时有利于菌体的生长,但ε-PL基本不合成,甚至出现降解现象;当维持pH在4.0左右时,能促进ε-PL的合成。搅拌转速为300 r/min时,有利于溶氧和传质,400r/min时,由于剪切力过大,导致菌丝断裂,ε-PL产量下降。通过控制发酵中后期pH4.0和搅拌转速300r/min的pH反馈控制自动流加补料培养,可获得最大的ε-PL产量7.36g/L,产率0.072g/g,产量较优化前提高近10倍,产率提高2倍。     

pH-DO组合调控策略提高小白链霉菌ε-聚赖氨酸的生物合成

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是一种主要由小白链霉菌生产的广谱性天然食品防腐剂，具有广泛的工业应用价值。该研究对ε-PL高产菌Streptomyces albulus WG-608在5 L罐发酵不同阶段的pH与溶解氧(dissolved oxygen, DO)进行了系统优化，并构建了一种新的pH-DO组合调控策略。该策略将发酵分为2个阶段：第一阶段DO被控制在40%,pH维持在4.0;第二阶段DO被控制在20%,pH维持在4.3。经240 h的补料-分批发酵，WG-608的ε-PL产量与平均比生产速率为(68.77±2.53) g/L和(2.33±0.08) d^-1,比对照策略分别提高了28.23%和12.02%。为进一步探究该策略提高WG-608 ε-PL产量的细胞生理代谢差异的原因，对不同时期细胞的关键酶活力、呼吸链活力和辅因子水平等进行了分析。结果表明，葡萄糖消耗、中心碳代谢途径、L-赖氨酸生物合成途径、呼吸链活性和胞内辅因子的增强是pH-DO组合调控策略增强ε-PL产量的原因。总之，pH-DO组合调控策略是一种通过增强碳代谢和能...     

α-酮戊二酸对L-羟脯氨酸产量的影响

微生物合成L-羟脯氨酸时需要α-酮戊二酸的参与,而细胞内α-酮戊二酸的含量有限,限制了L-羟脯氨酸的高效合成。 因此该实 验通过在L-羟脯氨酸发酵过程中外源添加α-酮戊二酸,来考察α-酮戊二酸对发酵菌体生长、L-羟脯氨酸产量、糖酸转化率和代谢流的 影响。 结果表明,α-酮戊二酸对菌体生长有一定的抑制作用,但在一定浓度范围内,外源添加α-酮戊二酸能有效提高L-羟脯氨酸的产量和 糖酸转化率,当随糖流加5 g/L（初始发酵液）α-酮戊二酸时,L-羟脯氨酸产量能够达到最大值62.14 g/L,糖酸转化率为22.37%,与不添加 α-酮戊二酸相比,分别提高了47.85%和13.04%,同时,L-羟脯氨酸的合成代谢流提高了11.98%,副产物乙酸合成代谢流减少了29.42%。     

50L自控式发酵罐中ε-聚赖氨酸发酵条件的优化

在50L自控式发酵罐上进行ε-聚赖氨酸发酵条件优化研究,主要考察了分批发酵和补料分批发酵过程中pH、搅拌转速对ε-PL发酵和菌体生长的影响。结果表明,当控制pH在5.0以上时有利于菌体的生长,但ε-聚赖氨酸基本不合成,甚至出现降解现象;当pH维持在4.0左右时,能促进ε-聚赖氨酸的合成。搅拌转速为300r/min时,有利于溶氧和传质,400r/min时,由于剪切力过大,导致菌丝断裂,ε-PL产量下降。通过控制发酵中后期pH4.0和搅拌转速300r/min的pH反馈控制自动流加补料培养,可获得最大的ε-PL产量7.36g/L,产率0.072g/g,产量较优化前提高近10倍,产率提高2倍。     

谷氨酸全营养流加发酵新工艺

全营养流加主要是选择适当的全营养培养,在合适的时间进行营养的补加,通过补加的营养来弥补菌体因生长代谢而消耗的营养物质,同时也可以降低发酵培养基的浓度,避免富营养对于菌体活力的抑制。因此,采用全营养流加策略能够解决L-谷氨酸发酵后期菌体活力不足和产酸能力下降等问题。实验结果表明,最佳流加条件为从发酵2 h开始流加,持续24 h流加体积分数为60%的流加培养基。在此条件进行L-谷氨酸发酵,生物量(OD 600)达到了66,提升了29.4%,菌体转型时间提前了2 h,L-谷氨酸产量为168 g/L,提高了22.6%,乳酸含量为3.1 g/L,降低了13.8%,丙氨酸含量为2.06 g/L,降低了17.6%,糖酸转化率为63%,提高了1.5%。全营养流加发酵对于加快菌体转型,提高菌体活力、谷氨酸产量及糖酸转化率均有积极作用。     

全营养流加对谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸的影响

在谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸的过程中,发酵后期菌体活力变弱,副产物增多,是限制L-异亮氨酸产业化的主要因素。研究通过3个阶段全营养流加策略探究最适发酵条件。首先,为解决L-异亮氨酸发酵中后期菌种活力下降的问题,实验通过利用发酵中后期全营养培养基流加策略,使得L-异亮氨酸达到了33.0 g/L。其次,为了解决初始发酵培养基高营养抑制问题,采用低浓度初始发酵培养基偶联发酵过程流加全营养控制策略,L-异亮氨酸达到了36.8 g/L。最后,由于玉米浆的高用量造成发酵染菌、起泡过多及后提取困难等产生的问题,通过清洁氮源丝肽粉等比例替换玉米浆全营养流加实验,使得副产物缬氨酸(valine,Val),亮氨酸(leucine,Leu),丙氨酸(alanine,Ala)分别降低到1.4、0.8、0.5 g/L,比初始降低了82.5%、86.7%和88.9%。通过上述3个阶段全营养流加策略,使得L-异亮氨酸产量提升的同时,副产物生成也得到有效的抑制。     

基于两阶段氨基酸添加的谷胱甘肽发酵高产方法

为提高产朊假丝酵母(Candida utilis SZU 07-01)发酵生产谷胱甘肽(glutathione,GSH)的产量,分别考察L-蛋氨酸和L-半胱氨酸在GSH分批发酵和流加发酵中的作用,结果发现L-蛋氨酸提升了酵母细胞在生长期的GSH合成能力,而L-半胱氨酸显著提高了细胞生长结束后的GSH产量。在此基础上,提出了两阶段氨基酸添加策略,即在分批发酵初始时(0 h)添加60 mmol/L L-蛋氨酸,在流加发酵过程中细胞干质量达到最大值时(第27小时)一次性添加30 mmol/L L-半胱氨酸。最终,GSH产量和胞内GSH含量进一步提高,分别达到1 247.1 mg/L和24.1 mg/g。该两阶段氨基酸添加策略在GSH发酵高产中的成功应用,对其他类似化合物的高效生产具有一定的借鉴意义。     

谷氨酸合成途径基因缺失对大肠杆菌发酵L-色氨酸的影响

降低谷氨酸的积累可提高L-色氨酸产量及糖酸转化率。敲除Escherichia coli TRTH中的谷氨酸脱氢酶及谷氨酸合成酶编码基因gdh A、glt B,构建TRTHA(TRTH,Δgdh A)、TRTHB(TRTH,Δglt B),考察gdh A、glt B缺失对L-色氨酸发酵的影响。结果表明,gdh A及glt B缺失能有效降低谷氨酸的积累,但会降低细胞生长及色氨酸合成;培养基中谷氨酸的添加可恢复TRTHA及TRTHB的生长及色氨酸合成能力。在含1 g/L谷氨酸培养基中,利用TRTHB发酵L-色氨酸,L-色氨酸产量(41.23 g/L)及糖酸转化率(15.45%)最高,较TRTH分别提高了10.92%和7.89%;谷氨酸生成量(5.72 g/L)及乙酸积累量(1.73 g/L)分别较TRTH降低了25.23%及提高了10.19%。TRTH和TRTHB代谢流分析结果表明,glt B缺失会降低谷氨酸合成代谢流并提高乙酸合成代谢流;TRTHB的色氨酸合成代谢流(11.4%)较TRTH提高了40.74%。