非洲绿猴肾细胞(Vero)无血清细胞库的建立

目的建立Vero细胞无血清细胞库。方法采用序贯适应和直接适应方法,将Vero细胞从有血清培养适应到无血清培养,建立Vero细胞无血清细胞主库和工作库,采用STR图谱并结合染色体计数对Vero细胞进行鉴别,并对Vero细胞无血清细胞库进行致瘤性和病毒外源因子检定。结果两种方法均能使Vero细胞适应到无血清培养,其中直接适应法可大大缩短适应代次,因此选择其作为建立Vero细胞无血清细胞库的方法。Vero细胞无血清主库和工作库的STR图谱与日本细胞库公布的Vero细胞STR图谱完全一致,Vero细胞库无外源因子污染,无致瘤性。结论Vero细胞无血清细胞库可用作生物制品生产用候选细胞基质。     

基于Vero细胞的流感病毒高产株的研究进展

流感是由流感病毒引起的严重急性呼吸道疾病,目前,接种疫苗是预防流感的最有效手段。Vero细胞是WHO推荐用于生物制品的细胞系,大多数流感病毒在Vero细胞上生长性能较差,因此筛选一株具有Vero细胞稳定高产特性的流感病毒母本株是Vero细胞流感疫苗研发及生产的关键环节。本文对流感病毒Vero细胞高产株几种选育方法的研究进展及影响流感病毒Vero细胞产量的相关因素作一综述。     

SARS病毒NS-1株三级毒种库的建立

目的建立SARS病毒NS1株三级毒种库。方法SARS病毒NS1株在Vero细胞上传代扩增,并经各项检定合格后,建立SARS病毒NS1株三级毒种库。结果工作种子批病毒滴度均在8.2LgCCID50ml以上;无菌试验、支原体检查均合格;鉴别试验中,经与SARS病人恢复期高效价血清中和,中和指数均在955以上;外源因子检查中,小鼠和乳鼠存活率均在86%以上;血吸附和非血吸附检查均为阴性;免疫原性检查中,病毒原液和1∶5倍稀释病毒液免疫小鼠,其血清中和效价分别达1∶54和1∶15。结论SARS病毒NS1株各项指标均符合《SARS病毒灭活疫苗临床前研究技术要点》和《中国生物制品规程》2000年版要求,可作为SARS灭活疫苗生产用毒种。     

Vero细胞森林脑炎疫苗毒种的选育及其生物学特性检测

目的选育Vero细胞森林脑炎疫苗适应毒种。方法将森林脑炎疫苗鼠脑病毒“森张”株在Vero细胞上连续传代适应,并对不同代次收获的病毒液的病毒滴度、免疫原性、稳定性等进行检测。结果“森张”株病毒在Vero细胞上传代适应后,病毒滴度达8·5LgLD50/ml;免疫血清中和抗体效价高于1∶20,其它检测项目均符合疫苗生产用毒种的要求。结论Vero细胞适应的“森张”株毒种的初步特性显示可作为制备Vero细胞森林脑炎疫苗用毒种。     

中国生产用细胞基质污染支原体类型的分析及猪鼻支原体特异性检测方法的初步建立

目的分析我国生物制品生产用细胞基质中污染的支原体的类型,并建立猪鼻支原体感染特异性检测方法。方法对半巢式PCR法的退火温度及引物进行优化,利用优化后方法对70份经培养法及染色法确证为支原体阳性的生产用细胞基质培养上清进行PCR检测及序列分析;用支原体特异的抗生素Plasmocin TM处理猪鼻支原体阳性细胞株NCI-H1703 1~3周后,收集上清,进行优化后方法的特异性验证。使用猪鼻支原体特异抗体PD-4对感染不同类型支原体及不同稀释度的猪鼻支原体的Vero细胞进行检测验证。结果 70份样本中60份PCR检测阳性,其中猪鼻支原体(44份)占62.9%,其他分别为口腔支原体(6份)、精氨酸支原体(3份)、肺支原体(2份)、人型支原体(2份)、滑液囊支原体(1份)、发酵支原体(1份)、牛鼻支原体(1份);优化后的方法检测支原体为阴性,且阴性结果随药物持续作用而维持不变,可特异地监控支原体增殖活性。猪鼻支原体特异抗体PD-4可特异地检测猪鼻支原体污染。结论猪鼻支原体是中国生物制品生产用细胞基质的主要支原体污染源,初步建立的猪鼻支原体感染的有效特异检测方法,可明显提高与支原体污染相关的质量控制能力。     

以重配技术制备H1N1流感病毒Vero细胞适应株

目的以重配技术制备H1N1流感病毒Vero细胞适应株,为以Vero细胞为基质生产流感疫苗奠定基础。方法以流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)为母本株,与WHO推荐的2007～2008年度北半球流感疫苗生产用毒株A/Caledonia/20/99(H1N1)共同感染SPF鸡胚和Vero细胞,用抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)抗体筛选重配病毒,在Vero细胞连续传12代,采用血凝抑制试验和RT-PCR鉴定病毒型别。将重配病毒经Vero细胞大量培养,重配前的病毒经鸡胚大量培养,分别经甲醛灭活,制备灭活疫苗,免疫ICR小鼠,检测其免疫原性。结果获得了1株Vero细胞适应的高产H1N1流感病毒株,连续传9代后,病毒血凝滴度维持在512,免疫原性与重配前的毒株相比,差异无统计学意义。结论通过流感病毒Vero细胞适应株与流行株的重配和抗体筛选,可以获得H1N1流感病毒Vero细胞适应株。     

Vero细胞培养轮状病毒关键条件的优化

目的优化轮状病毒基因重配株(UD株)在Vero细胞上培养的关键条件。方法将轮状病毒基因重配株(UD株)分别以0.01、0.03、0.05和0.10 MOI接种Vero细胞,分别于接种病毒后6、12、24、36、48、72、84、96、108、120 h取样,观察细胞病变(CPE)情况,计算半数感染剂量(CCID50/ml)。以0.05 MOI接种Vero细胞,分别加入含1、2、3、5、8和10μg/ml胰蛋白酶的M199培养液,于接种病毒后12~48 h,观察CPE情况,检测病毒滴度。结果以0.05 MOI接种Vero细胞后,维持液中胰蛋白酶浓度为5μg/ml,培养时间为48 h时,滴度达到最高,为6.5 lgCCID50/ml,且对Vero细胞的分裂增殖无不良影响。结论通过对Vero细胞培养轮状病毒关键条件的优化,获得了提高病毒滴度的有效方法,为使用Vero细胞培养轮状病毒制备轮状病毒减毒活疫苗奠定了基础。     

用微载体系统培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液

目的　采用生物反应器微载体培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液。方法　用 5L生物反应器培养Vero细胞 ,培养至 4d时接种CTN株狂犬病毒 ,在培养全程对细胞生长所消耗的营养物质及代谢产物进行监测及分析。结果　培养 4d后细胞浓度可达 1 2× 10 7cells ml,培养 3周后的病毒液经ELISA检测A值可达 0 2 1～1 0 6。病毒滴度达 10 - 6 0 ～ 10 - 8 0 LogLD50 ml。病毒液可连续收获 5次。结论　用微载体系统培养Vero细胞可生产高滴度的狂犬病毒液。     

黄热疫苗病毒17D株在Vero细胞上的适应性传代

目的建立黄热疫苗病毒17D株的Vero细胞适应株。方法将2批鸡胚黄热疫苗病毒在Vero细胞上进行2次蚀斑筛选,并连续传代培养,然后对获得的4株Vero细胞适应株病毒YFV-Vero(5)-A1、YFV-Vero(5)-A2、YFV-Vero(5)-B1和YFV-Vero(5)-B2进行稳定性和免疫原性检测。结果4株Vero细胞适应株病毒可被黄热病毒(17D)猴免疫血清中和。在传代过程中,不同代次的病毒滴度稳定在6·90LgPFU/ml以上,高峰病变出现时间为5~7d。家兔和小鼠的免疫血清中和抗体效价分别为1∶640~1∶5120和1∶640~1∶2560。结论4株Vero细胞适应株病毒生物学性状稳定,免疫原性良好。     

感染复数对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响

目的观察不同感染复数(MOI)对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响。方法分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒感染Vero细胞,观察不同MOI致细胞病变情况,并检测病毒滴度。结果病毒感染Vero细胞后48h,3组MOI(0.001、0.01、0.1)细胞病变均达莞。Ⅰ型病毒增殖高峰出现在接种后72h,3组MOI病毒滴度分别为(8.690±0.190)、(8.690±0.190)和(8.315±0.185)lgCCID50/ml;Ⅱ型病毒增殖高峰出现在接种后96h,3组MOI病毒滴度分别为(8.355±0.097)、(8.440±0.310)和(8.285±0.155)lgCCID50/ml;Ⅲ型病毒增殖高峰出现在接种后48～96h,3组MOI病毒最高滴度分别为(7.500±0.250)、(7.500±0.250)和(7.750±0.250)lgCCID50/ml。结论不同MOI对3型病毒增殖影响不大,可以采用低MO(I0.001)制备疫苗。     

SPF金黄仓鼠原代肾细胞的安全性

目的验证SPF金黄仓鼠原代肾细胞的安全性。方法采用ELISA法检测10种鼠源病毒血清抗体。通过细胞直接观察、细胞培养试验和血吸附病毒试验检测外源因子。并用直接XC蚀斑法、S+L检验法、电镜观察和双模板法以及联合培养与F-PERT法检测逆转录病毒及逆转录酶活性。结果10种鼠源病毒抗体为阴性,未检出外源因子、逆转录病毒和逆转录酶。结论SPF金黄仓鼠原代肾细胞作为乙型脑炎减毒活疫苗的生物原材料安全可靠。     

肠道病毒71型在Cellspin系统中无血清微载体培养工艺的建立

目的建立肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)在Cellspin系统中无血清微载体培养工艺,为生物反应器培养EV71工艺的建立奠定基础。方法在Cellspin培养系统中对Vero细胞进行微载体培养,考察不同种类培养基MEM、DMEM/F12、VP-SFM、Opti-SFM、Opti-pro、MD505-199及不同微载体浓度3、5、10 g/L对细胞密度的影响。分别以MOI为0.2及2.0接种EV71至Vero细胞,考察病毒接种量对病毒增殖的影响。分别按培养上清、微载体洗脱液模式收毒,比较不同组分中EV71的抗原含量及TCID50。结果采用5 g/L微载体、VP-SFM培养基时,Vero细胞的密度达4.40×106个/ml;按MOI为2.0染毒,72 h后即可收毒,较MOI为0.2的收毒时间早48 h,按MOI为0.2染毒,收获液上清中的抗原含量达193.5 U/ml,病毒滴度达8.43 Log10TCID50/ml;按上清加洗脱液模式收毒,抗原含量可达573 U/ml。结论成功建立了无血清微载体培养Vero细胞生产EV71的方法,为生物反应器培养EV71工艺的建立奠定了基础。     

Vero细胞制备流感病毒疫苗

目的利用转瓶培养Vero细胞制备流感病毒疫苗。方法将流感病毒接种于Vero细胞上培养,优化培养条件,收获的病毒液经灭活、超滤浓缩和层析纯化,检测病毒的血凝素(HA)滴度及血凝素含量。按此工艺制备流感疫苗,根据血凝素含量稀释为不同浓度,免疫小鼠,观察不良反应,并通过血凝抑制(HI)试验检测抗体水平。结果Vero细胞培养流感病毒的最佳条件为:维持液中胰酶浓度12.5～15μg/ml,pH值7.4～7.6,Vero细胞经多次洗换后再接种病毒,病毒在细胞上培养72～96h收毒。所有免疫小鼠均未出现不良反应,小鼠抗体阳转率均为100%,HI抗体滴度均不低于同剂量的阳性对照组。结论Vero细胞可用于流感病毒的培养和制备疫苗。     

Detection of Mycoplasma Contamination in Transplanted Retinal Cells by Rapid and Sensitive Polymerase Chain Reaction Test

Contamination of cells/tissues by infectious pathogens (e.g., fungi, viruses, or bacteria, including mycoplasma) is a major problem in cell-based transplantation. In this study, we tested a polymerase chain reaction (PCR) method to provide rapid, simple, and sensitive detection of mycoplasma contamination in laboratory cultures for clinical use. This mycoplasma PCR system covers the Mycoplasma species (spp.) listed for testing in the 17th revision of the Japanese Pharmacopoeia, and we designed it for use in transplantable retinal cells. Here, we analyzed mycoplasma contamination in induced pluripotent stem cell (iPS cell)-derived transplantable retinal pigment epithelium (RPE) cells. In the spike tests to RPE cells with nine species of class Mollicutes bacteria, including seven Mycoplasma spp. and one of each Acholeplasma spp. and Ureaplasma spp., contamination at the concentration of 100 and 10 CFU/mL were detected with 100% probability in all cases, while 1 CFU/mL had a detection rate of 0–75%. DNA prepared from bacteria species other than class Mollicutes species was not detectable, indicating the specificity of this PCR. While iPS cells and iPS-RPE cells established in our laboratory were all negative by this PCR, some of the commercially available cell lines were positive. Cells for transplantation should never have infection, as once pathogens are implanted into the eyes, they can cause severe intraocular inflammation. Thus, it is imperative to monitor for infections in the transplants, although generally, mycoplasma infection is difficult to detect.     

SV40感染滴度测定方法的建立及高滴度病毒的制备

目的建立稳定的SV40感染滴度测定方法,制备高滴度SV40,用于生物制品病毒清除/灭活工艺的验证。方法通过分析不同细胞感染SV40后出现病变的时间、病变程度及产毒量,确定SV40敏感细胞株。分析维持液、细胞培养时间、病毒吸附时间等对病毒滴定测定的影响,建立SV40滴度测定的方法。并分析病毒感染后不同时间及细胞不同部位SV40滴度的差异,制备大量的高滴度SV40。结果与Vero、Vero76及VeroE6细胞相比,CV-1细胞对SV40高度敏感,细胞病变出现时间最早,病变最明显,产毒量最高。SV40滴度与病毒接种前细胞的培养时间、细胞接种量和维持液无明显相关,但吸附时间对病毒滴度有一定的影响。病毒的最佳吸附时间为120 min。接种病毒后48 h收集细胞沉淀,所获得的SV40滴度最高,平均为8.81 lg CCID50/ml。结论已建立了稳定的SV40滴度测定方法,并制备了高滴度SV40,为病毒清除/灭活工艺验证研究奠定了基础。     

病毒类疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒的适用性验证

目的对病毒类疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒进行适用性验证。方法将不同细胞基质制备的乙型脑炎灭活疫苗、人用狂犬病病毒疫苗共16批编盲后,每批疫苗均质等量分为44份,分别分发给3个实验室,用同批ELISA-Vero细胞宿主蛋白检测试剂盒进行检测,对试剂盒进行适用性验证,考核试剂盒的专属性、精密性、线性和范围等指标。结果3个实验室检测每批样品44次,原代地鼠肾细胞和鸡胚细胞为基质的疫苗检测结果均为阴性,以Vero细胞为基质的疫苗检测结果均为阳性。16份样本44次检测结果的变异系数在7.34%～14.77%之间,均低于15%;相对线性范围在12.5～400 ng/ml之间。16份疫苗中6批Vero细胞乙脑疫苗和5批人用狂犬病病毒疫苗检出的细胞宿主蛋白残留量分别在153.3～5 850.9 ng/ml和1 895.7~40 625.1 ng/ml之间。结论疫苗中Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒具有较好的专属性、精密性和线性,可用于Vero细胞为基质的病毒类疫苗宿主蛋白残留量的检测。