副溶血弧菌间接ELISA快速检测法的建立

以副溶血弧菌1.2164作为抗原,免疫新西兰兔,获得效价为1.6×105的多克隆抗体;以此多克隆抗体作为一抗,山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗,建立副溶血弧菌的间接ELISA快速检测法。采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为107cfu·mL-1和1∶4000;酶标二抗最适工作浓度为1∶1000。将该方法标准化后进行检测实验,交叉实验表明,此多克隆抗体与其它菌株交叉反应结果为阴性;阻断实验表明,其具有较高的特异性,阻断率高达86.53%。结果表明:此法在6h内即可检测出浓度为104cfu·mL-的副溶血弧菌,且与其它菌株均无交叉反应。      

副溶血弧菌间接ELISA快速检测法的建立

以副溶血弧菌1.2164作为抗原,免疫新西兰兔,获得效价为1.6×105的多克隆抗体;以此多克隆抗体作为一抗,山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗,建立副溶血弧菌的间接ELISA快速检测法。采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为107cfu·mL-1和1∶4000;酶标二抗最适工作浓度为1∶1000。将该方法标准化后进行检测实验,交叉实验表明,此多克隆抗体与其它菌株交叉反应结果为阴性;阻断实验表明,其具有较高的特异性,阻断率高达86.53%。结果表明:此法在6h内即可检测出浓度为104cfu·mL-的副溶血弧菌,且与其它菌株均无交叉反应。     

副溶血性弧菌多克隆抗体制备及应用

以热灭活副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP ATCC17802)免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,用间接酶联免疫吸附法测定抗血清效价,纯化后的多克隆抗体效价为512000。该抗体与5株副溶血性弧菌均能特异性结合,但与其他12株非副溶血性弧菌无交叉反应。在此基础之上建立了间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA),并优化了抗原抗体浓度、二抗浓度、封闭液等条件。结果表明,该法的线性范围为5×10^4~107CFU/m L,线性回归方程为y=0.21x-0.74(R2=0.99),IC50为106CFU/m L,最低检出限为1.7×10^4CFU/m L,板内变异系数为2.61%~4.15%,板间变异系数为4.71%~8.74%。用建立的ic-ELISA检测市场中鱼、贝类养殖水和实验室用水中的VP,实验结果与国标检测方法的结果一致。该方法快速便捷,灵敏度高,准确性好,为进一步研究VP的快速检测奠定了基础。     

抗副溶血弧菌OMPK单克隆抗体的制备及其ELISA双抗体夹心检测方法建立

制备全长和截短的弧菌外膜蛋白K（outer membrane protein K,OMPK）,纯化后的OMPK免疫6～8 周雌性BALB/c小鼠,间接夹心酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测小鼠的血清效价,结果表明全长OMPK重组蛋白制备的血清效价是截短OMPK1重组蛋白制备血清效价的128 倍。通过全长的OMPK重组蛋白制备多株用于检测副溶血弧菌的单克隆抗体,用生物素（biotin）和辣根过氧化物酶对单克隆抗体进行标记。间接夹心ELISA实验结果表明：只有VP3-biotin和VP16-biotin与其他单克隆抗体配对检测不同的副溶血弧菌菌株表现出较高的灵敏度及良好的特异性,并且在检测其他种属20 株菌时无交叉反应。VP16(Fab)-biotin/VP3检测副溶血弧菌时较VP16-biotin/VP3具有更高的灵敏度,该方法用于检测海鲜样品时,VP16-biotin/VP3检测三文鱼（5～10 CFU/25 g）和血蚶样品为副溶血弧菌阳性。本研究开发了一种快速、灵敏、简便的副溶血弧菌间接夹心ELISA检测方法。     

副溶血弧菌的磁珠捕获及检测

建立结合免疫磁珠和PCR快速检测副溶血性弧菌的新方法。本研究选用副溶血弧菌作为抗原免疫日本大耳兔制备了多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价。利用辛酸硫酸铵沉淀结合逆向吸附对多抗血清进行纯化,经SDS-PAGE和斑点杂交检测验证纯化后抗体的特异性。将纯化后的抗体偶联于羧基化修饰的纳米磁珠表面,用来进行菌体的捕获。结果表明,抗体的效价达到106,纯化获得只与副溶血弧菌发生反应的高纯度抗体。制备的免疫磁珠捕获率在55%～70%之间,且稳定性较好,盐离子浓度（3.5%NaCl、4.5%NaCl）对捕获率的影响不大,在pH5～9之间,磁珠捕获差异也较小。在对纯培养物的检测实验中,本方法最低检测限为102cfu/mL;而在鱼肉糜样本中的检测限为103cfu/mL,且样品中高浓度杂菌的存在不影响检测灵敏度。免疫磁珠结合PCR用于副溶血性弧菌的检测具有很高的灵敏度和特异性,具有广阔的前景。      

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)鞭毛蛋白FlaA的重组表达与多克隆抗体制备

副溶血性弧菌是广泛存在于水产品中的革兰阴性致病菌。鞭毛蛋白FlaA是副溶血性弧菌的一种特异性的蛋白质,以该蛋白质作为抗原所制备到的抗体可以作为检测副溶血性弧菌的探针。该研究通过分子生物学方法构建了重组FlaA的表达载体pET28a-flaA,并采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导实现FlaA的大量表达。该重组蛋白以可溶性形式存在,经Ni-NTA亲和柱纯化后对家兔进行免疫,得到浓度为24.32 mg/mL、效价为1∶125,000的抗FlaA抗体。通过间接ELISA实验,测得该抗体与副溶血性弧菌反应的灵敏度为1.0×104CFU/mL,且该抗体与5种其他常见致病菌无明显交叉反应。     

副溶血弧菌胶体金检测试纸条的改进

研制一种快速、灵敏、简便的胶体金免疫试纸条,用于改进副溶血弧菌的检测。通过胶体金与特异性针对于副溶血弧菌的单抗偶联,同时在NC膜上包被兔多抗、驴抗鼠的IgG分别作为检测线和质控线,制备免疫层系试纸条,测定试纸条的灵敏性与特异性。结果表明,当加入由胶体金标记的羊抗鼠二抗,能将显色强度提高5倍,明显有利于肉眼的观察。在纯培养物中试纸条的灵敏度为106CFU/mL,且与3株不同的副溶血弧菌均有阳性反应,与26株常见的菌均无交叉反应。同时在添加阪崎肠杆菌、志贺氏菌的鱼肉样本中,检测限为107CFU/mL。改良的副溶血弧菌胶体金免疫层系试纸条的建立,有助于加强食品中该菌的检测,提供了一种快速、灵敏、简便的方法。     

对虾副溶血弧菌的风险评估

对虾作为一种营养美味的食物频繁地出现在大众的餐桌上,但因为食用了不洁对虾而造成的食物中毒现象屡有发生.副溶血弧菌作为对虾体内最常见的细菌成为食物中毒的重点检测对象.我们参照国际上风险评估的经验,在查阅大量资料的基础上,对对虾的生长、捕捞、运输、销售、加工食用等5个环节进行暴露量评估,得出结论:对虾确实会感染副溶血弧菌,但只要食用方法得当,就不会造成食物中毒.     

弧菌外膜蛋白Ompk基因序列分析及其多克隆抗体的制备

弧菌外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）OmpK不仅可激发机体的体液免疫和细胞免疫,而且可在不同血清型菌株之间产生免疫交叉反应。本研究利用克隆测序和查找GenBank获得20 株弧菌的Ompk基因序列并构建Ompk系统进化树,对比分析20 株弧菌Ompk基因序列;利用原核表达系统表达野生株Vibrio parahaemolyticus B的OmpK,纯化OmpK后制备兔多克隆抗体;采用酶联免疫吸附分析法和蛋白质印迹法（Western-blotting）分别检测抗体效价和特异性。系统进化树和基因序列比对结果显示Ompk基因在弧菌中高度保守,核苷酸序列相似性在77%以上;原核表达系统成功表达了弧菌OmpK,蛋白经纯化后成功制备的兔多抗效价达1∶16 000;Western-blotting实验证实抗体具有很好的特异性;OmpK多克隆抗体在弧菌中普遍存在免疫交叉性。因此,弧菌Ompk基因序列分析及其抗体研制,不仅为弧菌快速免疫学检测提供可能性,也为以OmpK为靶点的水产疫苗研制奠定了基础。     

淬灭副溶血弧菌群体感应的乳酸菌益生特性研究

以副溶血弧菌的群体感应为靶标,筛选对副溶血弧菌群体感应和生物被膜形成具有抑制作用的乳酸菌菌株,分析其益生特性。采用哈维氏弧菌BB170生物发光法及结晶紫染色法测定10株乳酸菌淬灭副溶血弧菌群体感应和抑制生物被膜形成的效果,并分析其自聚性、共聚性、疏水性、生物被膜形成能力以及抗菌谱。结果表明,10株乳酸菌对副溶血弧菌生物被膜形成的抑制作用存在明显差异,乳酸菌抑制副溶血弧菌AI-2活性与抑制生物被膜形成具有相关性,其中菌株A10对副溶血弧菌AI-2和生物被膜的抑制率分别为82.92%和87.70%,对副溶血弧菌AI-2活性有促进作用的菌株B11、L18基本对生物被膜形成没有抑制作用;菌株MS1的自聚率和疏水率均达到80%以上,成膜能力强,且其淬灭副溶血弧菌群体感应和抑制生物被膜形成的作用明显,抑制率分别为69.54%和77.32%,抗菌作用强。本研究为乳酸菌源群体感应抑制剂的研究开发提供参考,对乳酸菌资源的充分开发利用具有积极意义。     

ELISA法快速检测水产品中副溶血性弧菌

以副熔血性弧菌抗原免疫新西兰大白兔获得特异性抗体,利用此抗体,进行间接竞争ELISA法实验,确定了抗原抗体最佳反应浓度和一抗稀释度分别为107cfu/mL和1:4000,酶标二抗IgG-HRP最佳工作稀释度为1:1000.以此方法分别对人工染菌水产品及实际水产品进行检测,检测下限为104cfu/mL,检测时间为8h;而经8h增菌后,其检测下限为103cfu/mL.此法与常规方法检测结果完全一致,具有很高的实际应用价值.     

链霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

通过研究链霉素(SM)人工抗原的合成和多克隆抗体的制备,建立链霉素残留的免疫分析方法。以氧-缩甲基羟胺肟化链霉素的醛基,引入羧基,再用碳二亚胺法将半抗原与蛋白质载体连接,合成免疫原SM-cBSA。用戊二醛法合成包被原SM-OVA。用紫外扫描、SDS-PAGE分析偶联情况,计算得链霉素与cBSA、OVA的分子偶联比分别为7.6:1与17.7:1。经动物免疫获得效价为1:40000的链霉素多克隆抗体,采用间接竞争ELISA测定IC50为3.32ng/mL,与双氢链霉素的交叉反应率为105.21%,与同类的其他药物均无交叉反应。     

抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备

为了制备赭曲霉毒素A多克隆抗体,采用戊二醛法合成赭曲霉毒素A-BSA人工抗原,通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白偶联效果.合成的人工抗原用弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小白鼠,4次免疫后眼球下缘采血,分离血清.试验结果表明,免疫后产生了抗赭曲霉毒素A-BSA的特异性多克隆抗体,抗体效价为1:8100,赭曲霉毒素A的最低...     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。     

隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备及鉴定

研究制备孔雀石绿(MG)代谢物隐性孔雀石绿(LMG)多克隆抗体进而间接鉴定鱼体中孔雀石绿的残留。首先利用化学方法合成含羧基的隐性孔雀石绿衍生物(CLMG),然后采用碳化二亚胺法偶联牛血清白蛋白(BSA)合成免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA,按照常规免疫程序免疫新西兰大白兔制备抗隐性孔雀石绿多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附实验(iELISA)测定抗血清中抗隐性孔雀石绿多克隆抗体效价。结果表明：抗隐性孔雀石绿的抗体效价为1: 32000,可用于隐性孔雀石绿的免疫学检测。     

重金属铅多克隆抗体的制备及鉴定

目的：合成铅离子完全抗原,并对其进行鉴定;用合成的完全抗原免疫Balb/c 小鼠制备多克隆抗体,鉴定效价和特异性。方法：用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA 将Pb2+ 与载体蛋白BSA 和OVA 偶联在一起,合成免疫抗原(Pb-DTPA-BSA)和检测抗原(Pb-DTPA-OVA),并通过SDS-PAGE、紫外扫描、电感耦合等离子体(ICP) 检测抗原中Pb2+ 含量,以及通过免疫Balb/c 小鼠,采集血清进行间接ELISA 和竞争ELISA 检测。结果：两种合成的抗原相对于各自的载体蛋白均出现了蛋白条带滞后,紫外吸收峰偏移等现象;免疫的4 号和5 号Balb/c 小鼠的抗血清效价达1:400000;与OVA 无交叉反应,ELISA 检测IC50 值为1.5ng/mL,与Fe3+ 有近5% 的交叉反应,与其他重金属离子的交叉反应均小于1%。结论：铅离子多克隆抗体制备成功。     

卡巴氧的代谢物喹喔啉-2-羧酸人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

实验采用碳二亚胺法将卡巴氧代谢物喹喔啉-2-羧酸（QCA）与牛血清白蛋白（BSA）偶联,采用用混合酸酐法将其与卵清白蛋白（OVA）偶联,分别将其作为免疫原（QCA-BSA）和包被原（QCA-OVA）进行抗血清的制备及ELISA实验。经过多次动物免疫及EILSA实验,结果表明,获得了高效价的特异性抗体。     

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原的合成及其多克隆抗体制备

本研究采用肟化法用羧甲基羟胺半盐酸盐对链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸(Tenuaconic acid,TA)进行衍生后引入连接臂,得到了半抗原TAO。通过活性酯法将半抗原TAO分别与牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)偶联制备得到免疫原TAO-BSA、与血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)偶联制备得到包被原TAO-KLH。经透析纯化后分别采用紫外光谱、红外光谱扫描法对合成的人工抗原进行初步鉴定,制备得到的人工抗原的偶联比分别为18.3:1、38.7:1。此人工抗原免疫Balb/c小鼠后获得的鼠源抗血清进一步验证了人工抗原合成成功,制备得到特异性识别TA的多克隆抗体。通过ELISA棋盘法确定了最佳包被原浓度以及最佳抗体稀释度并建立了TA间接竞争ELISA检测方法,其灵敏度以半抑制浓度IC50表示为335.55 ng/m L,最低检出限(LOD)为19.00 ng/m L,定量线性检测范围为200.00~1563.00 ng/m L。