土霉素完全抗原的制备及ELISA检测方法的建立

为制备土霉素(Oxytetracycline,OTC)完全抗原,获得免疫学特性良好的土霉素鼠源多抗血清并建立OTC免疫学检测方法,采用重氮化法在OTC分子上引入羧基,进而利用改进碳二亚胺法将其与载体蛋白偶联制备完全抗原,通过红外扫描、紫外扫描和凝胶电泳鉴定其偶联效果,然后将完全抗原免疫BLAB/c小鼠获得多抗血清(pAb)并对其免疫学特性进行鉴定,通过优化条件建立OTC间接竞争ELISA检测方法。结果表明,偶联效果良好,免疫的4只小鼠多抗血清效价均达到1∶12 800;4只小鼠多抗血清均有抑制效果,其中2号小鼠产生的多抗血清效果最佳,基于该多抗血清建立的OTC间接竞争ELISA检测方法半数抑制浓度(IC_(50))为32.92ng/mL,检测限(LOD)为1.3ng/mL,牛奶样品中添加回收率在84.70%～87.45%,与金霉素、四环素的交叉反应率分别为5.27%,4.10%,与其他竞争物交叉反应率0.4%。该试验成功合成了OTC完全抗原,获得了免疫学特性良好的OTC多抗血清,并建立了OTC免疫学检测方法。     

醋酸甲羟孕酮完全抗原制备及ELISA检测

本实验采用碳二亚胺法合成完全抗原MPA-BSA,并采用紫外分光光度法及SDS-PAGE凝胶电泳鉴定对偶合物进行鉴定,使用合成抗原对兔子进行免疫,得到抗血清,在此基础上建立醋酸甲羟孕酮酶联免疫检测方法,检测限为1.8μg/ml,线性范围为2.5～50μg/ml(r2=0.9936)。     

新霉素ELISA检测方法的建立

目的：比较直接和间接竞争酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的优缺点,建立新霉素残留ELISA检测方法。方法：利用自制的新霉素多克隆抗体,采用直接竞争和间接竞争ELISA方法检测新霉素残留,并比较两种方法的优缺点。结果：新霉素抗血清和庆大霉素的交叉反应率为2.04%,和卡那霉素的交叉反应率为0.02%,和氨苄青霉素、红霉素、四环素的交叉反应率均小于0.01%。初步测试新霉素间接竞争ELISA法的准确性和回收率。板内误差小于4%,板间误差小于11%,回收率为135.5%～191.3%。直接竞争和间接竞争ELISA方法的检测极限分别为28.58ng/mL和51.74ng/mL,达到了国家对新霉素规定的500μg/kg MRL检测限。结论：建立了直接竞争和间接ELISA吸附检测方法,条件优化更成功的间接竞争ELISA可用于开发新霉素检测试剂盒。     

对硫磷快速ELISA检测方法的建立

由于对硫磷的残留问题及其危害,迫切需要建立一种快速有效的农药检测方法。将对硫磷苯环上的硝基还原为氨基,得到了具有氨基活性的半抗原化合物———氨基对硫磷,然后采用重氮法将氨基-对硫磷与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)相偶联,分别合成了免疫原和包被抗原:氨基对硫磷-BSA、氨基对硫磷-OVA。对合成的抗原进行紫外可见扫描,确证偶联成功。用合成的免疫抗原免疫实验用大白兔,制备对硫磷的多克隆抗血清,效价达到1∶1×106以上。对硫磷抗体除了与甲基对硫磷具有极其微弱的交叉反应以外,与甲胺磷和毒死蜱交叉反应低于0.1%,最低检测限2.0ngg,回收率为93.3%。该方法简便、快速、灵敏,适用性强。     

基于Arah6的花生间接竞争ELISA检测方法的建立

建立了基于花生主要过敏原蛋白Arah6的间接竞争酶联免疫检测法,实现了对食物中花生的定量检测。利用花生过敏原Arah6纯品免疫新西兰大白兔,制得兔抗Arah6的多克隆抗体,以Arah6纯品作为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,确定了包被抗原质量浓度为1μg/mL,一抗最佳稀释度为1:50000,酶标二抗稀释度为1:5000。此检测方法对Arah6的定量检测范围为16.5～10000ng/mL（折合成含花生的含量,约为165ng/mL～100μg/mL）,抑制方程为抑制率I=21.418lgC-6.0633（C为Arah6的质量浓度,单位ng/mL）,IC50为414.6ng/mL,相关系数R2=0.9989。该检测方法灵敏度高,检测范围广,适用于食品中花生现场快速检测。      

沙丁胺醇单克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立

制备抗沙丁胺醇单克隆抗体,鉴定其特异性并建立间接竞争ELISA检测方法。以合成的沙丁胺醇完全抗原免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选克隆得到稳定分泌抗沙丁胺醇抗体的单克隆杂交瘤细胞,命名为4E4和3A2。经鉴定,两个抗体亚类都为IgG1,其腹水纯化后效价分别达到2·56×105和1·28×105。以效价高且特异性较好的4E4细胞株获得的抗体建立间接竞争ELISA方法,经条件优化后得到标准曲线,检测范围为4·76~84·99ng/mL,IC50为20·12ng/mL,检测限为3·25ng/mL,与克伦特罗交叉反应率为253·62%,与其它结构类似物没有明显交叉反应。本研究制备的单克隆抗体和建立的间接ELISA方法,可用于开发同时检测沙丁胺醇和克伦特罗的试剂盒。      

沙丁胺醇单克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立

制备抗沙丁胺醇单克隆抗体,鉴定其特异性并建立间接竞争ELISA检测方法.以合成的沙丁胺醇完全抗原免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选克隆得到稳定分泌抗沙丁胺醇抗体的单克隆杂交瘤细胞,命名为4E4和3A2.经鉴定,两个抗体亚类都为IgG,,其腹水纯化后效价分别达到2.56 ×105和1.28 ×105.以效价高且特异性较好的4E4细胞株获得的抗体建立间接竞争ELISA方法,经条件优化后得到标准曲线,检测范围为4.76～84.99ng/mL,IC50为20.12ng/mL,检测限为3.25ng/mL,与克伦特罗交叉反应率为253.62%,与其它结构类似物没有明显交叉反应.本研究制备的单克隆抗体和建立的间接ELISA方法,可用于开发同时检测沙丁胺醇和克伦特罗的试剂盒.     

雷洛昔芬抗体的制备及ELISA方法的初步建立

本文主要研究了雷洛昔芬抗体的制备和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)方法的初步建立。实验中采用丁二酸酐对雷洛昔芬进行衍生,合成了雷洛昔芬半抗原。采用碳二亚胺法,将雷洛昔芬半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成免疫原和包被抗原,并通过紫外光谱进行鉴定,结果显示雷洛昔芬与载体蛋白偶联成功。免疫大白兔制备了雷洛昔芬抗体,抗体效价达1.28×10~5,半数抑制浓度(half inhibit concentration,IC50)15.4μg/L,与其他类似抗雌激素药物没有交叉反应,说明所制备的抗体特异性好。通过优化抗原抗体反应浓度初步建立了雷洛昔芬ELISA方法,结果显示最佳抗原浓度为300μg/L,最佳抗体工作浓度为1:1.0×10~5,标准曲线在0.4~102.4μg/L范围内线性关系好,R~2=0.9853,最低检测能力0.4μg/L。本研究为进一步开发雷洛昔芬快速检测试剂盒提供了技术参考。     

基于Arah6的花生问接竞争ELISA检测方法的建立

建立了基于花生主要过敏原蛋白Arah6的间接竞争酶联免疫检测法,实现了对食物中花生的定量检测。利用花生过敏原Arah6纯品免疫新西兰大白兔,制得兔抗Arah6的多克隆抗体,以Arah6纯品作为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,确定了包被抗原质量浓度为1μg／mL,一抗最佳稀释度为1：50000,酶标二抗稀释度为1：5000。此检测方法对Arah6的定量检测范围为16．5～10000ng/mL（折合成舍花生的含量,约为165ng／mL～100μg／mL）,抑制方程为抑制率I=21．4181gC-6．0633（c为Amh6的质量浓度,单位ng／mL）,IC50为414．6ng/mL,相关系数R2=0．9989。该检测方法灵敏度高,检测范围广,适用于食品中花生现场快速检测。     

基于单克隆抗体的三聚氰胺ELISA检测方法的建立

建立三聚氰胺直接和间接竞争ELISA检测方法.三聚氰胺(melamine)-BSA免疫BALB/c小鼠,通过融合小鼠脾细胞与SP2/0细胞,制备分泌MEL单克隆抗体(monoclonal antibody)的细胞株;体内诱生腹水制备MEL-mAb.用高碘酸钠法制备MEL-OVA-HRP偶联物并对其活性进行鉴定.分别用M...     

检测阪崎肠杆菌间接ELISA方法的建立

建立阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii,ES)特异性抗体间接ELISA检测方法,以期作为融合后杂交瘤细胞株的筛选体系。应用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,筛选最佳反应条件,建立检测该病原菌的酶联免疫吸附检测方法。通过对ELISA反应条件优化,确定菌体抗原包被的最适工作浓度为2×105mL-1,4℃包被过夜;5%脱脂奶粉进行封闭;血清最佳稀释比为1∶2 000;酶标抗体最适稀释度为1∶1 000倍;最后确定37℃显色10 min,检测灵敏度达到103mL-1。该方法的建立为阪崎肠杆菌单克隆抗体制备过程中阳性杂交瘤细胞株的筛选提供有效手段和奠定实验基础。     

沙丁胺醇ELISA方法的建立及应用

为建立1种快速检测沙丁胺醇的ELISA方法,以制备的抗沙丁胺醇(salbutamol,SAL)高亲和力单克隆抗体为基础,从影响ELISA检测结果的因素出发,优化间接竞争ELISA条件。通过添加标准沙丁胺醇溶液进行验证。试验结果表明:ELISA反应的最佳反应条件:包被温度37℃,包被时间1 h,竞争时间0.5 h,包被质量浓度1μg/mL,抗体稀释度1∶32 000。在此条件下建立标准曲线。该方法对沙丁胺醇的检测线性范围为0.1~128μg/L,IC50为1.35μg/L,最低检测限(LOD)为0.2μg/L,添加回收率83.8%~89.7%,变异系数均小于11%。采用该方法检测喂药动物尿液中的沙丁胺醇残留,特异性高,适用于猪尿中沙丁胺醇残留的初步筛选。     

肉及肉制品中莱克多巴胺的ELISA检测方法的建立

建立一种肉及其制品中莱克多巴胺的酶联免疫分析方法。对莱克多巴胺残留量进行选择性(交叉反应)、特异性与检测限以及回收率和精密度测试。结果显示,选择酶联免疫法来检测样品中的莱克多巴胺准确性较好,其对莱克多巴胺结构类似物的交叉反应率都小于1%,出口猪肉罐头和牛肉中的检测限(LOD)分别为(0.28±0.30)μg/kg和(0.26±0.21)μg/kg,样品平均回收率在82.9%～91.1%之间,相对标准偏差为4.3%～8.7%,经高效液相色谱(HPLC)确证假阳性率小于等于2.0%,表明酶联免疫分析定量法可快速、准确实现对食品中莱克多巴胺残留量的快速筛选。     

动物性食品中盐酸克伦特罗ELISA检测方法的建立及应用

目的:建立动物性食品中盐酸克伦特罗残留快速检测技术,确保食品安全.方法:以盐酸克伦特罗重氮化后分别连接到牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上制得免疫原BSA-CL和包被抗原OVA-CL.通过免疫得到多抗血清,经硫酸铵沉淀,Sephrose 4B-proteinA对抗体进行纯化,在此基础上建立间接竞争ELISA方法.结果表明:包被抗原的最适质量浓度为10 μg/mL,抗体的最佳稀释度为1∶1000;该方法的IC50为2.18 ng/mL,最低检测限达0.05 ng/mL,与沙丁胺醇和妥洛特罗的交叉反应率分别为8.28％和7.75％,平均加标回收率为90.78％.结论:该法灵敏度高,样品前处理简便、快速,适用于动物源性食品中盐酸克伦特罗残留的大批量现场检测.     

CP4-EPSPS蛋白抗体的制备及其夹心ELISA定量检测方法的建立

为了快速高效地检测转Cp4 epsps基因抗除草剂大豆,本研究利用已制备的CP4-EPSPS蛋白免疫实验动物,获得5株CP4-EPSPS蛋白鼠单克隆抗体及3份羊抗血清,建立了CP4-EPSPS蛋白双抗夹心酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法,同时利用该方法对结荚期的Cp4 epsps转基因抗除草剂大豆的根、茎、叶、种子进行定量检测。结果显示,最佳检测条件为捕获抗体1D12,工作浓度1.25 μg/mL,包被酶标板,4 ℃静置过夜,检测样品20 ℃孵育45 min,检测抗体8092,工作浓度2.5 μg/mL,20 ℃孵育30 min;CP4-EPSPS蛋白在模拟大豆环境中最低检测限为3.6 ng/mL,检测范围为7.5~125 ng/mL;重复性变异系数小于15%。利用上述检测条件,在转Cp4 epsps基因抗除草剂大豆的根、茎、叶、种子中均检测到CP4-EPSPS蛋白的表达,且各组织部位表达量差异显著,其中CP4-EPSPS蛋白在叶片中表达量最高,茎、种子、根中CP4-EPSPS蛋白表达量逐渐降低。     

鸡肉中金刚烷胺间接竞争ELISA检测方法的建立

建立检测鸡肉中金刚烷胺的间接竞争酶联免疫吸附分析(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)法。利用N-(1-金刚烷胺基)肼甲酰胺与乙醛酸合成新式金刚烷胺半抗原,采用活泼酯法将金刚烷胺半抗原分别与血蓝蛋白、牛血清白蛋白偶联合成免疫原和包被原,将所制备的人工抗原免疫BALB/c小鼠,并制备特异性识别金刚烷胺的单克隆抗体。ic-ELISA法经系统优化后,最佳包被原稀释倍数为80 000,抗体工作质量浓度为122.50μg/L,对金刚烷胺的IC50为0.69μg/L,检出限为0.21μg/L,在0.07～6.15μg/L之间线性良好,鸡肉样品中添加回收率为101.69%～108.71%,变异系数均低于15%,且实际样品检测结果与高效液相色谱-质谱联用测定结果相关性良好(R2=0.97),表明建立的ic-ELISA具有良好的准确度和可靠性。利用该特异性抗体建立的方法适用于实际鸡肉样品中金刚烷胺的快速检测。     

葡萄球菌A型肠毒素检测竞争ELISA方法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测食品中金黄色葡萄球菌A型肠毒素的方法,应用构建的pGEX-6P-SEA、pET28α-SEA重组质粒表达带有不同融合肽的葡萄球菌A型肠毒素,分别通过谷胱甘肽亲和纯化、镍螯合纯化获得SEA的重组融合表达蛋白HIS-SEA、GST-SEA,以HIS-SEA为包被抗原,以GST-SEA、天然SEA肠毒素为竞争抗原,确立了SEA型肠毒素ELISA检测的工作条件:包被浓度为2.5μg/mL,阳性血清稀释度为1∶50,辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡免疫球蛋白工作浓度为1∶2000。建立了以重组肠毒素GST-SEA作为竞争抗原检测葡萄球菌肠毒素SEA的间接竞争ELISA（ciELISA）方法,竞争肠毒素GST-SEA蛋白浓度x与P/N值y的关系式:x（GST-SEA）=1.99-y/0.34,R2（GST-SEA）=0.9964,线性检测范围均为1～62.5ng/mL,最低检测量为1ng/mL,此方法丰富了食品中A型肠毒素的检测手段。      

出口肉及制品中盐酸克伦特罗的ELISA检测方法的建立

介绍了酶联免疫吸附法测定出口肉及制品中的盐酸克伦特罗的方法。利用盐酸克伦特罗试剂盒对出口肉及制品中残留的盐酸克伦特罗用酶标仪进行测定分析,结果显示,盐酸克伦特罗的交叉反应为100%,猪肉罐头和牛肉中的检测限(LOD)为0.026(μg/kg)和0.028(μg/kg),样品的平均回收率在83.6%～91.3%之间,相对标准偏差为3.5%～5.6%,经HPLC确证假阳性率≤2.0%。表明酶联免疫分析定量法可快速、准确实现对食品中盐酸克伦特罗残留量的快速筛选。     

乳制品中牛IgG含量间接竞争性ELISA检测方法的研究

建立了牛初乳制品和添加了牛初乳成分的乳制品中牛IgG含量间接竞争性酶联免疫吸附测定方法,主要研究步骤包括:制备牛IgG保守区(Fc段),以Fc段为免疫原免疫Balb/C小鼠,取其脾细胞进行细胞融合,制备特异性单克隆抗体及合成适合实际测定用途的ELISA试剂盒。应用本研究建立的方法对标准品和实际样品进行牛IgG含量检测的结果表明,该方法回收率在78.9%～117.5%,批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,检测结果稳定可靠,可满足目前国内牛初乳制品和添加了牛初乳成分的乳制品品质监控的需要。      

乳制品中牛IgG含量间接竞争性ELISA检测方法的研究

建立了牛初乳制品和添加了牛初乳成分的乳制品中牛IgG含量间接竞争性酶联免疫吸附测定方法,主要研究步骤包括:制备牛IgG保守区(Fc段),以Fc段为免疫原免疫Balb/C小鼠,取其脾细胞进行细胞融合,制备特异性单克隆抗体及合成适合实际测定用途的ELISA试剂盒。应用本研究建立的方法对标准品和实际样品进行牛IgG含量检测的结果表明,该方法回收率在78.9%～117.5%,批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,检测结果稳定可靠,可满足目前国内牛初乳制品和添加了牛初乳成分的乳制品品质监控的需要。