猪脑乙酰胆碱酯酶的分离纯化和性质研究

通过离心、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose和Superdex-200层析等步骤,从猪脑中获得电泳纯乙酰胆碱酯酶,该酶比活力和纯化倍数分别为2.05 U/mg和26.97,酶活回收率为11.95%;该酶分子质量为257.30 kD,亚基为66.94 kD;以碘化硫代乙酰胆碱为底物时,酶的最适反应温度为37 ℃,最适pH值为7.4,且在40 ℃以下,pH 6.0～8.0有较好的稳定性;最适底物浓度为4.0 mmol/L,Km为0.94 mmol/L。Ba2+和Zn2+对该酶有强烈的抑制作用,而低浓度Mg2+对该酶有激活作用。     

马血清中胆碱酯酶的分离纯化及其性质研究

传统对血清中胆碱酯酶的分离纯化步骤繁琐且纯化倍数低,本实验采用硫酸铵分级沉淀、透析,再经DEAE-52离子交换层析和SephadexG-100凝胶过滤层析的方法,对马血清中胆碱酯酶进行分离纯化,得到胆碱酯酶纯品,纯化倍数达101.3倍。经SDS-PAGE不连续凝胶电泳显示为单一条带,并测定其相对分子量为72000Da。胆碱酯酶性质研究的实验结果表明,该酶最适温度为35℃,最适pH为7.4,对底物氯化乙酰胆碱的Km值为0.192mmol/L,最适底物浓度为4mmol/L,高浓度底物对酶有抑制作用,该酶对热不稳定。     

毛云芝菌固体发酵产漆酶的分离纯化及酶学性质

作者对毛云芝菌利用桑叶和麸皮固体发酵所产漆酶进行了分离纯化,并研究了纯化后漆酶的酶学性质。将毛云芝菌固体发酵漆酶粗提液通过离心、过滤、大孔树脂脱色、硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose fast flow层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析,结果得到电泳纯的漆酶,纯化倍数15.53,酶活回收率51.21%。用SDS-PAGE测得该酶相对分子质量62 600;该酶反应的最适温度为50℃,在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中最适pH值为4.0,在醋酸缓冲液中最适pH值3.0;氧化ABTS的Km为0.093 mmol/L,对邻苯二酚的Km为3.71 mmol/L。     

鲜食玉米脂氧合酶的酶学性质

本实验研究鲜食玉米脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的酶学性质。以新鲜甜玉米、糯玉米籽粒及其胚为试材,采用紫外分光光度法,以亚油酸为底物,探讨了酶提取部位、酶促反应温度、pH值及底物浓度对LOX活性的影响。结果表明,鲜食玉米胚中LOX活性显著高于鲜食玉米籽粒,其最适反应温度为55℃,最适反应pH值为6.0,最适底物浓度为8.0mmol/L,提高温度和延长处理时间能有效地钝化LOX。     

猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域的表达、纯化及其酶学性质分析

研究脂肪氧合酶（lipoxygenase,LOX）在猪肉贮藏、加工过程中对脂肪氧化及风味形成的作用机制。通过序列分析和聚合酶链式反应扩增获得了猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域（12-lipoxygenase catalytic domain,12-LOXcd）的编码基因,采用大肠杆菌表达系统,经镍柱亲和层析和Superdex G200凝胶过滤层析纯化得到12-LOXcd蛋白,并研究其酶学性质。结果表明,构建的原核表达载体pMBP-12-LOXcd在大肠杆菌中成功可溶性表达了猪肉12-LOXcd,该重组蛋白经纯化可达电泳纯。12-LOXcd以亚油酸为底物的比活力为2 826.7 U/mg,最适pH值为6.0,最适作用温度为30 ℃。亚油酸Km为0.40 mmol/L,亚麻酸Km为0.55 mmol/L,花生四烯酸Km为4.15 mmol/L,表明最适底物为亚油酸。与大豆LOX相比,该酶在较高NaCl质量分数（9%）时仍保持活性稳定;对热较不稳定,在60 ℃条件下失活,但优于大豆LOX的热稳定性;此外,12-LOXcd的pH值稳定性也优于大豆LOX,在碱性条件下仍能保留部分活力。     

露湿漆斑菌胆红素氧化酶的分离纯化及其性质

露湿漆斑菌产生的胆红素氧化酶粗酶液通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephadex G-100 纯化,得到纯化152.54 倍胆红素氧化酶,得率19.14%;用PAGE 检测为单一条带,活性电泳证实该单一蛋白质组分为胆红素氧化酶, SDS-PAGE 证明该酶的相对分子质量为64 000.该酶最适反应温度为55 ℃,以胆红素为底物时最适pH值为7.5,而以ABTS为底物时最适pH值为4,该酶在pH 3～8之间都能够检测到酶活.以胆红素为底物,胆红素氧化酶的Km值和Vmax分别为552.06 μmol/L和38.91 μmol/(L·min);而以ABTSA为底物,胆红素氧化酶的Km值和Vmax分别为631.84 μmol/L和12.79 μmol/(L·min).     

米糠脂肪氧化酶活力的快速测定及其酶学特性研究

紫外分光光度法是测定脂肪氧化酶活力的常用方法,但其测定准确度受到底物溶液透明度和酶液纯度的制约,尤其在反应缓冲体系的pH低于7.0的条件下,难以进行粗酶液中LOX活力的直接测定。为克服现有方法的不足,本文建立一种改良的米糠中LOX紫外光谱检测方法。首先对米糠进行脱脂处理,提高方法的检测限与精确度;采用"磷酸盐溶液-亚油酸-吐温20"体系,简单、快速地获得透明的底物溶液;在获取米糠粗酶液LOX酶学特性的基础上,通过选择合适pH的缓冲体系,确保底物溶液的相对稳定;以"磷酸盐缓冲液+底物溶液+钝化的LOX溶液"为参比,省去繁杂的酶纯化步骤。结果表明:部分脱脂对米糠中脂肪氧化酶起到激活作用,其活力最高增加了46.33%;米糠LOX最适pH7.5,最适温度35℃;其活力测定的条件为:反应缓冲体系为2.0mL0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.5)、200μL底物溶液,其中亚油酸和吐温-20浓度分别是2.53×10-3mol/L、1.68×10-3mol/L,测定温度25℃。此优化条件下,粗酶液添加量在10～40μL范围,反应速率与酶浓度呈正比,△OD234/min=0.001V-0.0026(R2=0.9996);米糠LOX酶促反应最大速率Vmax=0.136△A/min,米氏常量Km=11.592×10-3mol/L。该方法能简便、快速和准确地进行米糠中LOX的活力测定以及酶钝化动力学研究。     

鲜枣脂氧合酶酶学特性及热失活动力学研究

以亚油酸为底物,采用紫外分光光度法测定鲜枣脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的酶学特性及热失活动力学性质。考察了温度、p H、金属离子及络合物对LOX活性的影响,并建立了LOX酶促反应动力学及热失活动力学参数。结果表明:鲜枣LOX的最大吸收波长为265 nm;最适温度和p H分别为40℃、7.0;在p H值为5.0~6.0的环境中,LOX活性保持相对稳定;酶促反应动力学符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学,其Km和Vmax分别为0.14 mmol/L、0.26 U/min,鲜枣LOX与底物亚油酸的亲和力较好;且LOX的热失活遵循一级反应动力学规律,反应活化能为105.20 k J/mol;2 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Cu2+、Ca2+、Mn2+对LOX酶活力有激活作用(P0.05),而2 mmol/L Mn2+、Zn2+、Mg2+和10 mmol/L Mg2+,EDTA对LOX活性具有抑制作用(P0.05)。该试验为鲜枣加工贮藏中LOX活性控制提供了有益的数据参考。     

香葱中蒜氨酸酶的分离纯化及其酶学性质

对香葱中蒜氨酸酶进行分离纯化并研究其酶学性质。通过均浆、离心、硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52离子交换层析和Sephadex G200凝胶过滤层析技术分离纯化得到纯度较高的蒜氨酸酶,并利用SDS-PAGE电泳对其纯度进行鉴定。结果表明,经分离纯化可得纯化倍数为19.6倍的蒜氨酸酶,酶比活力为11.44U/mg,酶活回收率为32.1%,达到电泳纯,其亚基的分子质量约为54.5ku。纯酶的最适反应温度为45℃,最适pH7.0,以S-甲基-L-半胱氨酸亚砜为底物,蒜氨酸酶的Km为45.31mmol/L,Vmax为40.32μmol/(mg·min)。     

粪肠球菌SK32.001精氨酸脱亚胺酶的分离纯化及酶学性质研究

对Enterococcus faecalis SK32.001所产的精氨酸脱亚胺酶(ADI)进行分离纯化并对其酶学性质进行研究。实验结果表明,通过细胞破碎,硫酸铵沉淀,Hi Prep Q FF 16/10阴离子交换层析,Sephadex G-75等纯化方法获得电泳纯精氨酸脱亚胺酶,分子量约为42ku,催化最适温度和p H分别为50℃和6.5,在30~40℃和p H5.5~7.5时较稳定。不同浓度的Zn2+对酶活性影响较大。1mmol/L的Zn2+和10mmol/L的Co2+、Ca2+、Mg2+对酶活有较大的促进作用,10mmol/L的Cu2+对酶的抑制作用最强。精氨酸脱亚胺酶在最适反应条件测定其米氏常数为1.33mmol/L,最大反应速度为2.41μmol/min。     

重组水稻 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

对重组水稻α- 半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质进行研究。结果表明：该重组酶分子质量约为59kD;最适酶反应温度为45℃,最适pH 值为5.0;酶活力在0～20℃,pH4.0～7.0 最为稳定;酶学动力学常数Km 为0.78mmol/L,Vmax 为10.16mmol/(mg·min)。多数的金属离子和有机离子对酶催化作用没有影响,Hg2+、Ag+及－ SH 基团抑制剂p-chloromercuribenzoic acid(pCMB)对酶活性有强烈抑制作用。     

大豆脂肪氧合酶的提取纯化及其特性研究

本实验以大豆为原料,经硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶柱G200分离沉淀,得到2种脂肪氧合酶（L0x）：LOX．1,LOX．2。对这两种同工酶的部分特性进行研究。其中LOX-1的反应最适pH为7．0,在pH9．0时无活性。而LOX-2最适pH为9．0,在pH7．0时也表现出较强活性。最适温度均为25℃。两种同工酶的热稳定性结果表明,LOX．1和LOX．2在40℃活性稳定,加热温度高于50℃时,活性急剧下降。在亚油酸为底物的反应体系中,LOX．1和LOX．2的K。值分别为8．2、12．2mmol／L。并对Ca2＋、Na＋、Cu2＋、和Fe3＋等不同的金属离子表现出不同的反应活性。     

物理因子与无机盐对阴香果实花色苷稳定性影响的研究

以半制备HPLC 纯化制备的阴香果实花色苷为样品,研究物理因子及无机盐与阴香花色苷溶液稳定性的关系。结果表明：阴香花色苷溶液100℃条件下的半衰期为4.7h,室内散射光下贮存40d 的保存率为92.702%,pH1.0～6.0 溶液贮存40d,阴香花色苷时的保存率高于90.0%;0.001～0.01mol/L 的NaCl 溶液、FeSO4 溶液对阴香花色苷具有护色或增色效果,0.001～0.1mol/L 的CuSO4 溶液或KCl 溶液对阴香花色苷具加速降解的作用,阴香花色苷在0.001～0.01mol/L 的ZnSO4、Mg(NO3)2 及0.001～0.05mol/L 的Ca(NO3)2 溶液中,保存率与不含无机盐的保存率无显著差异,但高浓度的ZnSO4、Mg(NO3)2 及Ca(NO3)2 溶液有促进阴香花色苷降解的作用。研究表明阴香花色苷的稳定性较高。     

白鲢鱼背侧肌焦磷酸酶的纯化及酶学特性

通过粗分离、50%～80%饱和度硫酸铵分级沉降、DE-52阴离子交换柱层析等步骤,从白鲢鱼背侧肌中分离纯化出焦磷酸酶。通过变性凝胶电泳分析,该酶在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中仅有一个分子质量为40 kD的条带。酶学特性研究表明,白鲢鱼背侧肌焦磷酸酶可专一性地水解焦磷酸盐,反应初速率时间范围为0～15 min,最适反应温度为45 ℃,最适反应pH值为7.5。Mg2＋对该酶有明显的激活作用,在Mg2＋浓度为5 mmol/L时酶活力最高。5 mmol/L的Ca2＋、Zn2＋、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）-Na2、EDTA-Na4、KIO3和1 mmol/L的NaF均对该酶有强烈的抑制作用。该酶水解焦磷酸四钠的最大反应速率为0.051 U/mg,米氏常数为0.54 mmol/L。     

黑曲霉H1-9b 葡萄糖氧化酶的分离纯化及部分性质研究

采用研磨法破碎黑曲霉H1-9b 菌丝体,经pH5.7 磷酸缓冲液抽提获得粗酶液,粗酶液经DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200 凝胶过滤层析,得到葡萄糖氧化酶纯品。该酶的比活力为30569.7U/mg,回收率为30.2%,提纯倍数为41.4 倍,分子质量为94.1kD,为单亚基酶。该酶最适温度为37℃,最适pH 值为5.7,在30～40℃温度范围内稳定性较好,在pH4.0～8.0 范围内活性稳定。以不同浓度葡萄糖为底物在最适条件下测得该酶K_m 值为30.69mmol/L,V_max 为21.88μmol/L。Ag^+、Cu²⁺、Zn²⁺ 对该酶活性有较大抑制作用。结果表明,该酶稳定性较好,有一定的应用价值。     

韦伯灵芝漆酶的分离纯化及其性质

采用硫酸铵分级盐析、透析、聚乙二醇浓缩和高效液相色谱柱层析从韦伯灵芝TZC-1 发酵液中分离纯化得到电泳纯漆酶,其纯化倍数为37.1 倍,酶活性回收率为21.3%。活性-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果表明该漆酶由一种同工酶组成,纯化漆酶经SDS-PAGE 检测显示为单一条带,其分子质量约为40kD。该漆酶催化底物ABTS 的最适反应温度为50～60℃,最适反应pH 值为4.6,在60℃以下和pH3.0～5.0 范围内保持稳定,以ABTS为底物的表观Km 值为13.8μmol/L。Fe2+ 完全抑制酶活,Al3+ 和Mn2+ 对该漆酶也有明显抑制作用,Hg+、Cu2+ 和Mg2+ 对该酶有明显激活作用,而Zn2+、Ba2+ 及K+ 对该酶活性影响不大。     

韭菜过氧化物酶的分离纯化及性质

经匀浆、抽提、硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose 离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的韭菜过氧化物酶(POD)。该酶比活力达到14031.41U/mg,纯化倍数为102.96,回收率为10.85%。该酶分子质量约为28.4kD,最适温度40℃、最适pH值为4.6。该酶在20～40℃以及pH 4.0～8.0有较好的稳定性,在最适条件下测得其Km值为18.15mmol/L。低浓度草酸、Zn2+、Mg2+等对该酶有较强激活作用;甲醇、乙醇、异丙醇、SDS、抗坏血酸(AsA)以及Mn2+、Fe3+等对该酶有较强的抑制作用。     

气相色谱-质谱联用测定白酒中的氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯

建立一种测定白酒中的氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯的气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)方法。GC-MS条件为：色谱柱HP-55%苯甲基硅氧烷(30.0m×0.25mm,0.25μm),进样1μL(分流比50:1),柱温170℃,质谱离子源温度230℃,四极杆温度150℃,全扫描方式的质量扫描范围m/z 30～500,溶剂延迟3min。样品采用氨基固相小柱萃取净化、氮吹浓缩定容。结果表明：氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯在2～30μg/mL范围内线性关系良好,相关系数为0.9923和0.9811,平均回收率为76.10%和75.43%,RSD为4.48%和4.00%。该方法可应用于白酒检测。     

金银花过氧化物酶的三相分离纯化及酶学性质

采用三相分离法提取纯化金银花中过氧化物酶,结果表明最优纯化条件为pH?5.60、硫酸铵质量浓度39.49?g/100?mL、提取液与叔丁醇体积比1∶1.38,在该条件下纯化倍数为5.849,回收率为87.64%。金银花过氧化物酶比活力为1 021.6 U/mg,色素清除率为92%;酶学性质研究表明:金银花过氧化物酶最适温度为30℃,热稳定范围为10~40℃;最适pH值为5,pH值稳定范围为4~7。在金银花过氧化物酶催化的双底物酶促反应中,当H_2O_2浓度一定时,酶对愈创木酚的Km值为8.12?mmol/L,vmax值为1.71?mmol/(min·L)。当愈创木酚浓度一定时,H_2O_2的Km值为0.822?mmol/L,vmax值为1.38?mmol/(min·L)。金银花过氧化物酶与底物的亲和力由强到弱依次是邻苯三酚、邻苯二酚、联甲氧基苯胺、愈创木酚。Ca~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)对金银花过氧化物酶有激活作用,Mg~(2+)、Mn~(2+)、柠檬酸、抗坏血酸、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠、十二烷基磺酸钠对金银花过氧化物酶有不同程度的抑制作用。