孔雀石绿多克隆抗体的制备与筛选

设计并成功合成了三种孔雀石绿半抗原,所有半抗原均采用活化酯法分别与血匙兰蛋白(KLH)偶联制备成免疫抗原,与卵清蛋白(OVA)偶联制备成包被抗原。利用所制备的三种免疫原免疫新西兰大耳白兔都获得了高效价的抗孔雀石绿抗体,并将每一种抗体都与三种包被抗原进行组合配对,通过间接竞争酶联免疫吸附检测(ELISA)方法筛选出最佳的抗体-包被抗原组合,筛选出的抗体采用Sepharose FF-Protein A亲和层析柱纯化,采用间接ELISA法测定效价及鉴定特异性。经测定筛选出的抗体效价达到1:12000,IC50值为0.65 ng/mL,交叉反应表明该抗体有较好的特异性,与结构类似物结晶紫的交叉反应率为18.73%,与隐性孔雀石绿及隐性结晶紫的交叉反应率低于10%。本研究为建立快速检测食品中孔雀石绿残留的免疫分析方法奠定了基础。     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。     

三唑磷多克隆抗体的制备及鉴定

采用活泼酯法将三唑磷半抗原(TZPM-Hap)与牛血清蛋白(BSA)和卵血清蛋白(OVA)偶联,制备出免疫抗原(TZPM-A-BSA)和包被抗原(TZPM-A-OVA),经紫外扫描证明人工抗原合成成功.用免疫抗原TZPM-A-BSA免疫雌性Balb/c小鼠,获得了特异性的三唑磷多克隆抗体.以所获得的抗体建立间接竞争酶联...     

羧基隐性孔雀石绿半抗原及全抗原的合成鉴定

以4-羧基苯甲醛,N,N-二甲基苯胺为原料合成羧基化隐性孔雀石绿(COOH-LMG),经薄层色谱、红外光谱、紫外光谱、液质联用仪鉴定该羧基化隐性孔雀石绿为目标产物。羧基隐性孔雀石绿经碳二亚胺法与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)载体蛋白相结合,分别得到免疫原与包被原。通过紫外分光光度计鉴定,人工抗原偶联物的吸收峰较反应前的反应物的吸收峰发生了漂移,证明耦合成功。新西兰大白兔经免疫原5次免疫后,得到针对隐性孔雀石绿的抗体,效价达1∶64000,为LMG的单抗的制备及其免疫学分析方法提供了重要依据。     

羧基隐性孔雀石绿半抗原及全抗原的合成鉴定

以4-羧基苯甲醛,N,N-二甲基苯胺为原料合成羧基化隐性孔雀石绿（COOH-LMG）,经薄层色谱、红外光谱、紫外光谱、液质联用仪鉴定该羧基化隐性孔雀石绿为目标产物。羧基隐性孔雀石绿经碳二亚胺法与牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）载体蛋白相结合,分别得到免疫原与包被原。通过紫外分光光度计鉴定,人工抗原偶联物的吸收峰较反应前的反应物的吸收峰发生了漂移,证明耦合成功。新西兰大白兔经免疫原5次免疫后,得到针对隐性孔雀石绿的抗体,效价达1∶64000,为LMG的单抗的制备及其免疫学分析方法提供了重要依据。      

芴完全抗原和多克隆抗体制备与鉴定

以9-芴乙酸（fluorene-9-aceticacid,FLU）为原料,经活性酯法合成完全抗原FLU-牛血清白蛋白（bovineserum albumin,BSA）和FLU-卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）,偶联产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及紫外扫描法鉴定。使用FLU-BSA足垫免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,间接酶联免疫吸附实验（enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA）测得多克隆抗体效价为51 200,间接竞争ELISA方法测得芴多克隆抗体的特异性,与荧蒽的交叉反应率为12%,与其他14 种多环芳烃交叉反应不明显。     

西地那非多克隆抗体的制备及特异性分析

目的为了研究开发一种具有高灵敏度、高特异性的西地那非(sildenafil,SD)多克隆抗体。方法本文通过人工合成西地那非半抗原(SDH)和西地那非抗原(SDH-BSA),然后经免疫兔子,制备了SD多克隆抗体,并对制得的抗体的特异性进行了分析。结果免疫后产生了SD多克隆抗体,抗体的效价为3.8×105,线性检测范围为0.02~3.8 ng/m L,抗体除与瓦地那非具有较高的交叉反应率外,与红地那非、他地那非等结构类似物交叉反应率均较低。结论采用本方法制备的SD多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度,可用于SD快速检测试剂盒的开发。     

ELISA法测定氨苄青霉素用多克隆抗体的制备与鉴定

采用戊二醛法和物理方法,分别以BSA、HSA、OVA为载体蛋白合成了免疫抗原和包被抗原,并通过紫外扫描法鉴定了合成的抗原为载体蛋白和氨苄青霉素的复合物。将偶联抗原用弗氏佐剂乳化后免疫新西兰大白兔,制备出多克隆抗体,并对ELISA检测条件进行了优化。实验得到酶标二抗的最佳稀释倍数为1600。Ag5、Ag6、Ag7包被抗原的最佳稀释倍数分别为6400、800和400,且在ELISA试验中,选择与免疫抗原合成方法不同的合成抗原作为包被抗原为佳。底物的最佳配方为10mL底物缓冲液+7μLH2O2+200μLTMB。酶标板选用Corning酶标板。在以上条件下测得6只兔子抗血清的效价在1×103～128×103之间。亲和性试验表明以物理方法直接合成的免疫抗原比戊二醛法合成的免疫抗原亲和性好。交叉反应实验证实,抗血清与阿莫西林有极高的交叉反应率(78%),而与其它结构相似的5种抗生素的交叉反应都很小。本检测方法的检测极限是4.17ng/mL。     

胭脂红酸人工抗原合成及多克隆抗体的制备

为了快速高效检测食品中胭脂红酸含量,本研究通过羟基二咪唑法制备了胭脂红酸人工抗原;通过免疫新西兰大耳白兔获得了胭脂红酸抗血清,经硫酸铵沉淀法分离纯化获得抗胭脂红酸多克隆抗体;利用棋盘滴定法检测了抗体效价,并探究了溶液pH值、离子强度和有机溶剂对ELISA反应的影响,优化出最佳ELISA反应条件;在最佳反应条件下,建立了胭脂红酸的间接竞争ELISA抑制曲线。紫外光谱扫描结果显示,免疫抗原(CA-BSA)和检测抗原(CA-OVA)均与载体蛋白成功偶联;经分离纯化获得的胭脂红酸多克隆抗体效价为1:16000;检测抗原最佳浓度为1μg/m L、ELISA反应最适缓冲液为pH7.4、含50mmol/L Na~+且无甲醇的磷酸盐缓冲液;间接竞争ELISA标准曲线的线性范围为7.8～1150ng/mL,检测限为1ng/mL,灵敏度IC_(50)值为95.2ng/mL。本研究为开发CA快速检测试剂盒对食品中胭脂红酸含量的大量快速测定奠定了基础。     

抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备

为了制备赭曲霉毒素A多克隆抗体,采用戊二醛法合成赭曲霉毒素A-BSA人工抗原,通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白偶联效果.合成的人工抗原用弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小白鼠,4次免疫后眼球下缘采血,分离血清.试验结果表明,免疫后产生了抗赭曲霉毒素A-BSA的特异性多克隆抗体,抗体效价为1:8100,赭曲霉毒素A的最低...     

重金属铅多克隆抗体的制备及鉴定

目的：合成铅离子完全抗原,并对其进行鉴定;用合成的完全抗原免疫Balb/c 小鼠制备多克隆抗体,鉴定效价和特异性。方法：用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA 将Pb2+ 与载体蛋白BSA 和OVA 偶联在一起,合成免疫抗原(Pb-DTPA-BSA)和检测抗原(Pb-DTPA-OVA),并通过SDS-PAGE、紫外扫描、电感耦合等离子体(ICP) 检测抗原中Pb2+ 含量,以及通过免疫Balb/c 小鼠,采集血清进行间接ELISA 和竞争ELISA 检测。结果：两种合成的抗原相对于各自的载体蛋白均出现了蛋白条带滞后,紫外吸收峰偏移等现象;免疫的4 号和5 号Balb/c 小鼠的抗血清效价达1:400000;与OVA 无交叉反应,ELISA 检测IC50 值为1.5ng/mL,与Fe3+ 有近5% 的交叉反应,与其他重金属离子的交叉反应均小于1%。结论：铅离子多克隆抗体制备成功。     

链霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

通过研究链霉素(SM)人工抗原的合成和多克隆抗体的制备,建立链霉素残留的免疫分析方法。以氧-缩甲基羟胺肟化链霉素的醛基,引入羧基,再用碳二亚胺法将半抗原与蛋白质载体连接,合成免疫原SM-cBSA。用戊二醛法合成包被原SM-OVA。用紫外扫描、SDS-PAGE分析偶联情况,计算得链霉素与cBSA、OVA的分子偶联比分别为7.6:1与17.7:1。经动物免疫获得效价为1:40000的链霉素多克隆抗体,采用间接竞争ELISA测定IC50为3.32ng/mL,与双氢链霉素的交叉反应率为105.21%,与同类的其他药物均无交叉反应。     

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原的合成及其多克隆抗体制备

本研究采用肟化法用羧甲基羟胺半盐酸盐对链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸(Tenuaconic acid,TA)进行衍生后引入连接臂,得到了半抗原TAO。通过活性酯法将半抗原TAO分别与牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)偶联制备得到免疫原TAO-BSA、与血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)偶联制备得到包被原TAO-KLH。经透析纯化后分别采用紫外光谱、红外光谱扫描法对合成的人工抗原进行初步鉴定,制备得到的人工抗原的偶联比分别为18.3:1、38.7:1。此人工抗原免疫Balb/c小鼠后获得的鼠源抗血清进一步验证了人工抗原合成成功,制备得到特异性识别TA的多克隆抗体。通过ELISA棋盘法确定了最佳包被原浓度以及最佳抗体稀释度并建立了TA间接竞争ELISA检测方法,其灵敏度以半抑制浓度IC50表示为335.55 ng/m L,最低检出限(LOD)为19.00 ng/m L,定量线性检测范围为200.00~1563.00 ng/m L。     

基于混合抗体的酶联免疫分析方法同时检测孔雀石绿和隐孔雀石绿

孔雀石绿是"三致"物质,常被非法使用于渔业生产。水产品和环境中常以孔雀石绿和隐孔雀石绿两种形式同时存在,均具有强致癌性。但由于二者结构差异较大,现有的单克隆抗体只能分别检测样品中单一药物的残留量,难以客观地反映出孔雀石绿和隐孔雀石绿的总残留量。目前同时检测两种结构的免疫分析方法鲜有报道,本文分别制备了针对孔雀石绿和隐孔雀石绿的高特异性单克隆抗体,通过研究混合抗体模式建立了可以同时检测两种物质的酶联免疫分析方法,该方法对孔雀石绿和隐孔雀石绿混合物的半抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50)为3.27 ng/m L,检测线LOD(IC10)为0.24 ng/m L,线性范围为0.62~17.25 ng/m L。本方法的建立对保障水产品安全具有重要意义,也为混合抗体法同时检测两种或多种残留药物提供了方法借鉴。     

副溶血弧菌多克隆抗体的制备及其特性分析

确定了副溶血弧菌多克隆抗体的制备方法:用体积分数0.05%甲醛于30℃灭活副溶血弧菌4 h制备抗原,并将此抗原分多次,以不同剂量免疫新西兰大白兔获得特异性多克隆抗体,以山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗,通过间接ELISA法测定其多克隆抗体的效价、敏感性和特异性。结果表明:在免疫的第5周产生大量高效价抗体,效价最高可达1.6×105;此多克隆抗体对副溶血弧菌检测灵敏度为1×105CFU/mL;交叉反应和阻断试验结果显示,此多克隆抗体具有很强的特异性。     

展青霉素人工抗原及多克隆抗体的研制

采用戊二酸酐法合成展青霉素-半戊二酸（PAT-HG），通过活泼酯法将PAT-HG偶联到牛血清白蛋白，制备了展青霉素免疫抗原（PAT—HG—BSA），免疫3只BALB／c小鼠，经4次免疫后，1号小鼠血清抗展青霉索抗体效价迭1：1600，且小鼠抗展青霉素多克隆抗体与展青霉素检测抗原的结合能被展青霉素阻断。     

高效特异的鸡蛋过敏原卵转铁蛋白多克隆抗体的制备

为得到高效特异的抗卵转铁蛋白多克隆抗体,通过用商品化的卵转铁蛋白(OVT)标品和自制纯化的OVT 免疫新西兰大白兔,用ELISA 及Western blotting 方法检测制备的抗血清效价和特异性。结果表明获得的抗体效价均高达1:819200 以上,抗体特异性强。本实验所建立的方法可成功制备高效特异的抗卵转铁蛋白多克隆抗体,可为进一步研究提供实验材料。