CHO宿主细胞DNA残留量检测方法的建立

目的建立检测生物制品中CHO宿主细胞DNA残留量的方法,制备检测CHO细胞DNA残留量的内部参考品,为国家相关标准的制定和修订提供依据。方法分别采用酚:氯仿:异戊醇抽提、DNA提取试剂盒和高盐抽提3种方法提取CHO细胞DNA,比较3种方法的提取效果;用地高辛标记最佳方法提取的CHO细胞DNA探针,并优化标记体系,直接法检测探针的标记效率;采用3种方法处理CHO细胞DNA内部参考品(1组不作处理;2组加入牛血清白蛋白和蛋白酶K;3组按2组方法处理后,增加DNA抽提步骤),通过点杂交法,用标记的探针检测上述样品的灵敏度。结果高盐抽提法提取的CHO细胞DNA效果较好;体系4(DNA10μg,Vial416μl,总体积64μl)标记效率最高;经不同方法处理的1、2、3组CHO细胞DNA内部参考品的检测灵敏度分别为1pg、10pg和1ng。结论建立的地高辛标记CHO细胞DNA探针-点杂交检测CHO细胞DNA残留量的方法稳定可靠,可用于生物制品中CHO宿主细胞DNA残留量的检测。     

磁珠分离结合定量PCR法检测单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量

目的利用磁珠分离法结合定量PCR技术,建立单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证及初步应用。方法通过磁珠分离法提取样品中的残留DNA,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析。对建立的方法进行种属特异性、准确性及精密性验证,并对5个厂家15批单克隆抗体类产品中的残留DNA进行测定。结果该方法检测CHO细胞DNA残留的最低准确定量浓度可达1×10-3 pg/μl,DNA含量在1×10-3~102 pg/μl范围内曲线线性良好,标准曲线的相关系数为0.994;该方法能特异性地检测CHO细胞DNA,对其他种属的DNA无扩增反应;该方法检测不同DNA加标量样品的DNA回收率相近,均值均在90%以上,3次测定的相对标准偏差均小于20%,92.6%加标样品的DNA回收率在70%~130%之间;该方法检测15批单克隆抗体类产品的DNA残留量均小于100 pg/剂量,符合《中国药典》三部(2010版)有关CHO细胞残余DNA的要求。结论磁珠分离法可解决残留DNA检测中样品前处理的技术难点,定量PCR法能够简便、快速、准确地对不同工艺的单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留进行定量测定。     

抗CD52单克隆抗体外源DNA残留量检测方法的建立及验证

目的建立检测抗CD52单克隆抗体原液中残余DNA的方法,并对该方法进行验证。方法利用CHO Host Cell DNA Extraction&Amplification Kit,采用qPCR法检测抗CD52单克隆抗体中宿主细胞残留DNA含量,并进行方法的专属性、线性、准确度、精密度和耐用性验证。结果该方法可以准确定量检测CHO细胞残留DNA含量。专属性验证试验中对照制剂无特异扩增曲线,而CHO细胞上清有明显的扩增曲线;5次试验中标准曲线相关系数R~2均≥0.98,表明该方法线性良好;准确度验证试验中所有试验的加标回收率均在70%~130%范围内;精密度验证试验中所有试验检测结果的相对标准偏差(RSD)均不大于30%;耐用性验证试验中,Proteinase K不同消化温度下检测结果的CV为0.85%,不同稀释倍数的供试品加标回收率在70%~130%范围内,不同稀释倍数外源DNA检测结果CV为4.71%。结论该方法专属性、准确度、精密度、线性和耐用性均符合要求,可采用该试剂盒qPCR法检测外源DNA残留量。     

康柏西普制品中CHO细胞DNA残留量的检测

目的建立特异的CHO细胞DNA残留量荧光定量PCR(Q-PCR)检测方法。方法采用DNeasy Tissue Kit提取CHO细胞基因组DNA,制备DNA标准品;确定Q-PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,并验证其专属性、准确性及精密性;用建立的方法对1003b02、1008b05、1012b09、1104b04、1108b13、1112b24批康柏西普原液的CHO细胞DNA残留量进行检测。结果建立的标准曲线Ct值与模板DNA浓度的对数值之间呈良好的线性关系,相关系数为0.99以上;检测HUVEC、HEK293细胞的DNA残留量均无特异性扩增曲线;检测高、中、低浓度的DNA标准品(105、103、101pg/ml)的平均回收率均在Q-PCR方法可接受的回收率范围(50%²00%)内,批间变异系数分别为9.3%、21.8%、26.8%;检测100pg/ml浓度的DNA标准品的平均回收率为111.6%,变异系数为20.4%;康柏西普原液的DNA残留量远低于100 pg/剂量。结论已成功建立特异的CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,该方法专属性好,准确性及精密性高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法。     

首批HEK293细胞DNA含量测定国家标准品的制备

目的 制备HEK293细胞DNA含量测定用国家标准品,以期为行业内HEK293细胞残余DNA的测定提供支持。方法 使用Genomic-tip 500/G以及基因组DNA纯化试剂制备HEK293细胞DNA,以其为标准物质原料,采用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法进行纯度和含量筛选,随后稀释至浓度约为100 ng/μL后,按160μL/支进行分装。组织5家不同实验室,采用紫外分光光度法进行协作标定,并评价其稳定性和适用性。结果 制备的HEK293细胞DNA国家标准品经检测,A₂₆₀/A₂₈₀均在1.8～2.0之间,电泳图谱为单一条带,符合规定。该标准品经5家实验室协作标定,共得到78个有效数据,平均含量为104.8 ng/μL,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为4.2%,均数的95%可信区间为103.8～105.8 ng/μL,单次测定的95%参考值范围为96.0～113.6 ng/μL,平均可信限率为1.0%,推荐保存条件为-80℃。采用2个不同型号的荧光定量PCR仪进行适用性研究,该标准品在0.3...     

阈值法检测人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量

目的建立人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量的阈值检测法,并进行验证。方法验证阈值法的线性范围、准确性及精密度。采用阈值法和DNA探针杂交法分别对3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量进行测定,并进行比较。结果 DNA标准品浓度为3～200 pg时,与检测信号(μV/s)呈良好的线性关系,直线回归方程为y=10. 812 x-36. 761,R2=0. 994 5;加入100和25 pg DNA标准品的样品回收率为88%～110%,CV分别为7. 7%和7. 4%;精密度各次检测CV均10%。阈值法检测3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量分别为181. 9、104. 2和64. 6 pg/mL,DNA探针杂交法检测结果分别为约250、约100和100 pg/mL,二者检测结果相符。结论阈值法有望应用于生物制品宿主细胞残留DNA含量的常规检测,且具有良好的准确性及精密度。     

重组腺相关病毒中游离与错误包装宿主细胞DNA检测的两种前处理方法的比较

目的 采用DNA酶（deoxyribonuclease,DNase）处理与填料亲和两种前处理方法检测重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）游离与错误包装宿主细胞DNA(host cell DNA,HCDNA)残留量,并进行比较。方法分别采用DNase处理法和填料亲和法分离游离与错误包装HCDNA,再进行核酸提取及qPCR检测。比较两种前处理方法检测HCDNA残留量的准确度和重复性。结果 采用DNase处理的方式,DNase未处理组核酸定量检测结果为HCDNA总残留量,DNase处理组为错误包装HCDNA量,二者差值为游离HCDNA残留量。DNase未处理和处理组回收率均为75%以上,重复性RSD小于30%。采用亲和提取方式,填料偶联亲和配基,结合rAAV,检测错误包装HCDNA回收率为75%以上,检测游离HCDNA回收率仅为36%。结论 DNase处理法可有效检出游离与错误包装HCDNA,可为后续研究奠定基础。     

宿主细胞残留DNA片段大小分布检测方法的建立及验证

目的 建立宿主细胞残留DNA片段大小分布的检测方法,并进行验证,为监控疫苗生产过程提供依据.方法 基于高灵敏的微型化芯片毛细管电泳法,用MDCK细胞基因组DNA作为阳性对照品,建立检测方法,并验证方法的检测范围、准确性及精密度.利用建立的方法分析MDCK细胞基质流感疫苗生产过程中间品(H1N1型流感病毒收获液、病毒微滤...     

质粒DNA中宿主菌基因组DNA残留检测方法的比较

目的对检测质粒DNA中宿主菌基因组DNA含量的Southern blot和Real-time PCR法进行比较。方法PCR扩增宿主菌染色体DNA的16SrRNA片段,以地高辛标记回收的目的片段为探针,对提取的质粒pcDNAH进行Southern blot,同时根据16SrRNA基因序列设计探针,建立Real-time PCR反应体系和标准曲线,分别检测质粒中宿主菌基因组DNA的含量。结果应用Southern blot和Real-time PCR检测质粒pcDNAH中宿主菌基因组DNA的含量,结果均符合WHO相关标准。结论两种检测方法各有优缺点,均可用于检测质粒DNA中宿主菌基因组DNA的残留,可根据不同情况,采用不同方法或配套使用。     

单抗制品中CHO细胞宿主蛋白残留双抗夹心ELISA检测方法的建立

目的建立单抗制品中CHO细胞宿主蛋白(host cell protein,HCP)残留双抗夹心ELISA检测方法。方法确定双抗夹心ELISA方法的最佳工作条件,并对该方法的精密度和准确度进行验证,确定线性范围及最低检出限;用建立的方法与市售试剂盒分别检测低、中、高浓度HCP标准品及抗TNF-α单抗原液、抗VEGF单抗纯化工艺样品中的HCP。结果建立的双抗夹心ELISA法最佳抗体包被浓度为1.5μg/ml,酶标抗体浓度为1μg/ml,160 r/min,37℃孵育2.5 h;TMB 37℃孵育15 min;以630 nm为参比波长,450 nm为测定波长。该方法的线性范围为3.125~100 ng/ml,最低检测限为3.125 ng/ml;试验内变异系数(CV)和试验间CV均小于15%,回收率为85.3%~115.1%。与商品化试剂盒检测结果基本一致,可用于检测纯化工艺样品。结论已成功建立单抗制品中CHO细胞HCP残留双抗夹心ELISA检测方法,该方法可代替市售试剂盒用于CHO细胞HCP残留检测,可使检测成本降低30倍。     

生物制品中残留甲醛含量衍生-气相色谱检测方法的建立及初步应用

目的建立生物制品中残留甲醛含量衍生-气相色谱检测方法,并进行验证及初步应用。方法采用液体进样方式,毛细管色谱柱(SH-Rxi-5MS,30 m×0. 25 mm×0. 25μm)分离,FID检测器检测,外标法定量,测定样品中残留甲醛含量。进样前,对照品及样品使用2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenyl-hydrazine,2,4-DNPH)衍生处理,考察不同衍生条件(包括衍生时间、衍生温度和提取溶剂等)对甲醛衍生及提取效率的影响。色谱条件:初始温度为150℃,保持1 min;以20℃/min的速率升温至250℃,保持10 min;检测器温度为250℃,进样口温度为250℃,分流比为10∶1;载气为N2;进样量为1μL。对建立的方法进行重复性、准确性验证及初步应用。结果游离甲醛质量浓度在1～100μg/mL范围内时,浓度与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为A=3 789. 7 C-1 030. 2,相关系数为0. 999 8。用建立的方法重复检测甲醛标准液6次,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为1. 73%;在百白破疫苗样品中加...     

DNA聚合酶中宿主细胞核酸残留的分析

目的分析市售不同厂家DNA聚合酶中的宿主细胞核酸残留。方法根据E.coli 16S rRNA基因序列设计特异引物及探针,建立基于Taqman探针技术的Real-time PCR检测方法,检测基因工程制品中E.coli的核酸残留。结果建立的Real-time PCR法检测市售不同厂家的DNA聚合酶中均有宿主细胞E.coli核酸残留,但不同来源的DNA聚合酶其宿主细胞核酸残留量不同。结论应用PCR方法检测基因工程产品,尤其是E.coli制备的生物制品时,应注意DNA聚合酶中核酸残留对检测结果的影响;应用Real time PCR法定量检测时,建议将Ct值控制在30以内,以减小DNA聚合酶背景残留物的影响。     

重组蛋白制品中大肠埃希菌宿主蛋白残留测定试剂盒的适用性验证

目的验证重组蛋白制品中大肠埃希菌宿主蛋白(host cell protein,HCP)残留检测试剂盒的适用性。方法对淄博云桥生物技术有限公司制备的大肠埃希菌HCP的ELISA检测试剂盒进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,同时进行基质干扰试验和稀释回收试验。采用该试剂盒及一款市售进口试剂盒分别对本公司制备的3批重组碱性成纤维细胞生长因子(recombinant basic fibroblast growth factor,rbFGF)制品原液及纯化工艺中间样品的HCP残留量进行检测。结果试剂盒可特异性检测大肠埃希菌HCP残留量;线性范围为3.33~810 ng/ml;检测限和定量限均为3.33 ng/ml;试验内变异系数(CV)和试验间CV均16%;低、中、高3个浓度样品的回收率分别为113.1%、113.7%和97.5%;原液样品基质对测定基本无影响,原液基质中DTT含量5 mmol/L对测定结果的影响在可接受范围内;原液样品在测定HCP含量时存在干扰,稀释3倍时,干扰最小;该试剂盒与另一款市售试剂盒检测3批rbFGF制品原液及纯化工艺中间样品的HCP残留量基本一致。结论该试剂盒具有良好的特异性、灵敏度、准确性、精密度和线性,可用于本公司重组蛋白制品中大肠埃希菌HCP残留的检测。     

疫苗中甲醛残留量检测方法的研究进展

甲醛在疫苗生产中常作为灭活剂,但随疫苗注入机体后,会对机体产生一系列刺激性反应,因此需对疫苗中甲醛残留量进行严格控制。近几年随着科学技术的发展,疫苗中甲醛残留量检测方法也得到了改进。本文对近年来疫苗中甲醛残留量检测方法及其应用的研究进行了综述,涉及到的检测方法主要有乙酰丙酮法、品红亚硫酸法、变色酸法、酚试剂分光光度法、气相色谱法和液相色谱法,以期为今后的相关研究提供参考。     

多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA

目的采用多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞残留DNA。方法采用滤芯(滤板)澄清、鱼精蛋白处理、核酸酶处理、Sepharose 4FF层析纯化或澄清、核酸酶、Sepharose 4FF层析纯化结合的方法去除Vero细胞培养的狂犬病病毒液中的Vero细胞DNA,检测Vero细胞DNA残留量、抗原含量、核酸酶残留量及疫苗效价。结果 0.45μm UB玻璃纤维澄清病毒液,抗原损失率较小;鱼精蛋白去除Vero细胞DNA,抗原损失量较大;核酸酶处理后,病毒液中Vero细胞DNA残留量仍高于1 ng/ml;经Sepharose 4FF层析纯化,能有效去除浓缩后经核酸酶处理的病毒液中的核酸酶及一定量的Vero细胞DNA;采用多种方法结合去除病毒液中Vero细胞残留DNA,DNA残留量<100 pg/ml,疫苗效价≥4.0 IU/ml,均达到《中国药典》三部(2010版)要求。结论多种方法结合能有效去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量,且疫苗效力达到《中国药典》三部(2010版)要求。     

重组人肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗外源DNA残留量检测方法的建立

目的建立重组人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗原液中昆虫细胞宿主DNA残留的地高辛探针杂交检测方法。方法抽提昆虫细胞sf9基因组DNA,经分子筛纯化后作为阳性对照品;分别以1 000~5 000 bp和100~1 000 bp的基因组DNA超声随机小片段为模板,制备地高辛探针,与阳性对照进行杂交试验。同时验证方法的检测范围、灵敏度和特异性,并采用该方法对3批重组EV71 VLPs疫苗原液中宿主DNA残留量进行测定。结果纯化后DNA样品浓度为47. 5 ng/μL,A260/A280值为1. 86,可作为阳性对照。以100~1 000 bp DNA超声随机小片段作为模板,探针标记效率更高,杂交显色更清晰。该法检测范围为10 pg^10 ng,灵敏度达1 pg,特异性强。3批重组EV71 VLPs疫苗原液中每人份剂量的宿主细胞DNA残留均<50 pg。结论本实验建立的方法特异性强,灵敏度高,可用于重组EV71 VLPs疫苗制备过程中的原液检定及质量控制。