应用RP-HPLC分析基因工程人表皮生长因子肽谱

用DTT还原rhEGF中的二硫键，并用碘乙酰胺封闭巯基，用TPCK处理的胰蛋白酶消化rhEGF，经RP－HPLC分析，发现不同工程菌生产的rhEGF存在结构的细微差别。该法具有灵敏度高、重现性好等优点，适用于基因工程产品肽谱的常规检定。     

人表皮生长因子及其在化妆品中的应用

通过文献调研，综述了新型生物功能性化妆品添加剂－人表皮生长因子（human Epidermal Growth Factor,简称：hEGF)的发现史、来源、结构与生物活性，以及hEGF与EGFR的作用机理；还综述了hEGF的3种生产方法，重点介绍了物美价廉的基因重组hEGF的生产和表达特点。同时，引入从细胞层次营养肌肤的生物美容理念，展望了hEGF在化妆品中的广阔应用前景和含hEGF化妆品独特的生物美肤功能。旨在进一步指导实践，开发系列hEGF功能性化妆品。     

抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体CHO工程细胞株的构建、筛选及表达

目的构建抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)人源化单克隆抗体CHO工程细胞株,并进行筛选及表达。方法将抗HER2抗体重链基因Fd及轻链基因VL分别克隆至同一质粒p RH上,将构建正确的重组表达质粒命名为p HER2。通过脂质体法将p HER2转染至二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO细胞(CHO-DG44)中,筛选稳定表达的工程细胞株,进行ELISA及SDS-PAGE检测。同时对抗HER2抗体高表达细胞株进行batch模拟试验。结果从近10 000株克隆中筛选获得3株备选细胞株,命名为H6、H7和H9。细胞株培养上清表达的抗体仅能与重组HER2发生特异性结合;SDS-PAGE检测结果表明,于相对分子质量50 000和25 000处可见重链和轻链的目的蛋白条带。H6、H7和H9细胞株在简单的batch悬浮培养条件下周期约为1周,抗体水平随培养时间的延长而逐渐升高,H9细胞株表达水平最高,为0.52 mg/ml。结论本研究筛选获得的工程细胞株H9具有较高的抗HER2单克隆抗体水平,为靶向治疗HER2过表达的乳腺癌和胃癌等恶性肿瘤奠定了基础。     

靶向人表皮生长因子受体3治疗性单克隆抗体的制备及筛选

目的 制备并筛选靶向人表皮生长因子受体3(human epidermal growth factor receptor 3,Her3)的单克隆抗体。方法 用CHO系统克隆表达Her3的胞外区,获得重组蛋白h GH-Her3-ECD,用该重组蛋白免疫BALB/c小鼠,并经常规细胞融合杂交瘤技术制备单克隆抗体。对制备的单克隆抗体进行抑制Her3与其配体HRG的结合试验、亲和力测定、亚型鉴定、结合抗原结构域的确定、识别肿瘤细胞表面Her3抗原的FACS分析及对A431细胞增殖抑制分析。结果 获得100多株靶向Her3的单克隆抗体,其中927、1002、1050、993、1044、1056株具有较强的抑制Her3与HRG结合活性,均为Ig G1型,亲和力较好。927、1002、1050株与Her3第Ⅰ结构域结合,993、1044、1056株与Her3第Ⅲ结构域结合,均能结合A431和Bx Pc3表面的Her3分子,可明显抑制A431细胞的增殖。结论 获得的靶向Her3单克隆抗体基本满足开发治疗性单抗的要求,具有成为治疗性单克隆抗体的潜在条件。     

重组人角质细胞生长因子异构体抗实验性肝纤维化的作用

目的观察重组人角质细胞生长因子(rhKGF)异构体(K102)对实验性肝纤维化的预防和治疗作用。方法取90只Wistar大鼠,随机分为K102大剂量组(2.0mg/kg),K102小剂量组(0.5mg/kg)和模型对照组,用50%CCl4与精制花生油按1:1(v/v)比例混合,灌服大鼠,每周2次,同时K102大、小剂量组皮下注射相应剂量的K102,模型对照组皮下注射等量溶媒,分别连续用药6周和8周。另取36只大鼠,随机分为3组,复制肝纤维化模型后,再给予相应药物6周,同时设正常大鼠对照组(12只)。实验结束后处死各组动物,并采集血液和肝脏组织,检测肝功、肝组织羟脯氨酸含量,并进行肝脏病理和胶原特殊染色观察。结果 K102能明显改善大鼠的肝功,降低肝组织羟脯氨酸含量,与模型对照组比较,差异有统计学意义。肝脏病理观察显示,K102治疗组较模型对照组病变轻微;胶原特殊染色显示,K102治疗组中仅见少量胶原纤维。结论 K102对实验性肝纤维化有一定的预防和治疗作用,为临床研究提供了依据。     

重组人表皮生长因子的分离和纯化工艺的研究

探讨了人表皮生长因子的分离思路并据此研究了人表皮生长因子的分离工艺,特别是对工程发酵液理化特征和各层析单元操作的结果进行了详细地研究分析.结果表明发酵液中目标产物与杂蛋白质间的分子量相差较大,其等电点也有一定的差距.在层析分离单元中,凝胶层析可使人表皮生长因子的纯度提高至94%以上,收率达72%以上;而离子交换层析与扩张床吸附则具有较高生产力的特点.根据不同的层析操作所提出的三条生产工艺而生产的人表皮生长因子可满足不同的市场需求.     

重组抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体酸性异构体去除工艺的优化

目的 优化重组抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单克隆抗体纯化工艺中去除酸性异构体的条件.方法 考察重组抗HER2单克隆抗体在阳离子交换层析工艺过程中的洗脱方式、预洗缓冲液pH、预洗缓冲液盐浓度、预洗体积、填料负载抗体量等条件对酸性异构体...     

补料分批培养耐乙酸大肠杆菌生产人表皮生长因子

An acetate-tolerant mutant of Escherichia coli DH5α, DA19, was used for secretory production of human epidermal growth factor （hEGF） whose expression was under the control of phoA promoter. The recombinant cells were cultured in a chemically defined medium, and glucose was added at different specific provision rates during the growth and expression phases. It was found that pH had a significant effect on the extracellular hEGF production. The extracellular hEGF concentration was 75.5mg·L^-1, 5.2-fold of the level reached at pH 7.0, even though more acetate was produced. Nitrogen source was limited in the later growth phase. Supplementation of ammonium promoted the consumption of phosphate and reduced the time to exhaust phosphate, but the extracellular hEGF production was similar to that without supplementation of ammonium.     

表皮生长因子及其在化妆品中的应用研究进展

综述了人表皮生长因子(human Epidermal Growth Factor,简称hEGF)的发现、来源、结构以及生物活性,介绍了hEGF的研究进展以及在化妆品中的应用。     

化妆品中人表皮生长因子的UPLC-Q-TOF-MS测定方法和量化确证策略

建立UPLC-Q-TOF-MS测定化妆品中EGF的方法。冻干粉、水和啫喱化妆品提取、过滤后以0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈为流动相,经C₁₈色谱柱分离,ESI源正离子多反应模式外标法定量。在0.5～10μg/mL内线性关系良好,R²大于0.9973,检出限0.2μg/mL,回收率96.6%～116.6%,RSD小于5.0%(n=6)。该方法简便、准确。提出化妆品中EGF的量化确证策略。联用互不干扰方法,在符合要求下对特征分别赋分,以总分进行不同程度的肯定。该策略可提供化妆品中物质确证的参考方案。     

重组全人源抗表皮生长因子受体单克隆抗体生物学活性检测方法的Potency验证

目的对已建立的重组全人源抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体生物学活性检测方法进行Potency验证。方法共4个验证批次,每个批次包括1个对照组和3个考察组,对照组抗体浓度设定为100%,8个浓度梯度,考察组抗体浓度为对照组的60%、70%、80%、100%、120%、130%和140%。用已建立的生物学活性检测方法测定对照组和各考察组的抗体活性,得到的结果用PLA 3.0软件进行分析,判断回归、线性、平行性、等效性是否合格,并得到实测效能。准确度以回收率表示。并以标称效能为横坐标,实测效能为纵坐标作线性回归,验证其线性和范围。结果各考察组的回归、线性、平行性、等效性均合格;各考察组的回收率均值在80%~125%范围内;标称效能与实测效能作线性回归,y轴截距为-1.716 5,斜率为0.984 6,相关系数为0.867 9,均符合标准。结论该方法用于评价目标活性的样品浓度区间在上述考察范围内(即60%~140%)时,可以真实地反映抗EGFR单抗的生物学活性。     

重组人血管内皮生长因子抑制剂理化对照品质控方法及质量标准的建立

目的建立重组人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抑制剂理化对照品质控方法及质量标准。方法利用HEK293细胞增殖抑制法测定重组人VEGF抑制剂理化对照品生物学活性;紫外分光光度法测定蛋白含量;质谱法进行相对分子质量测定、液质肽图及糖基化位点分析、二硫键分析、N-寡糖糖型及比例分析;SDS-PAGE及SEC-HPLC法分析纯度;等点聚焦法进行电荷异质性分析;Edman降解法进行N-末端氨基酸序列分析。结果重组人VEGF抑制剂理化对照品各项检定指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2015版)相关要求。结论建立的质控方法和质量标准符合理化对照品的相关规定,具有保证该理化对照品结构正确、质量可控的特点。检定合格的理化对照品可用于该类产品的常规检定。     

聚天冬氨酸钠在护肤品中的应用

利用皮肤水分测试仪和皮肤水分流失测试仪,考察了添加低、高分子量及不同质量分数聚天冬氨酸钠(PASP)的保湿化妆品作用于人体皮肤后的水分含量和经表皮水分散失情况。结果表明,高分子量PASP对皮肤的保湿效果较好、锁水效果显著,高分子量PASP在质量分数为0.8%时,使皮肤水分含量的增长率达到0.5%以上,对皮肤的保湿效果与透明质酸相当。使用皮肤弹性测试仪对新鲜猪皮进行了体外透皮实验,测试了使用PASP前后猪皮弹性状况的变化,表明PASP具有提高皮肤弹性的效果。PASP代替目前广泛使用的透明质酸作为化妆品中的保湿剂具有良好的发展前景。     

儿童护肤品中乳化剂的应用

基于对儿童护肤品市场和皮肤差异的分析,针对性介绍了配方中乳化剂的选择和使用并分享了实际配方应用,为配方设计提供思路。     

在效果卓越的防晒及护肤产品中防晒保护的配方策略

讨论开发效果显著的紫外防护产品中的一些问题，并将着重讨论有效添加物。同时，将介绍一种新开发的二氧化钛产品，这种产品能给皮肤带来透明效果。     

化妆品中表皮生长因子的快速检测

采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹法(WB)和噻唑蓝(MTT)比色法对化妆品中表皮生长因子(EGF)进行快速检测。得到SDS-PAGE和WB的检出限分别为0.500 mg/L和0.005 mg/L;样品1中EGF质量浓度约为2 mg/L,样品2中EGF质量分数约为10μg/g;MTT检测样品1和样品2中EGF的活性分别为1.14×104IU/mL和1.97×105IU/g。结果表明,采用SDS-PAGE、WB、MTT比色法快速检测化妆品中的EGF可行,可为建立EGF类化妆品的质量标准提供实验依据。