小鼠胃组织中幽门螺杆菌SYBR GreenⅡ实时定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立小鼠胃组织中幽门螺杆菌SYBR GreenⅡ实时定量PCR检测方法,并进行验证,以进一步应用于疫苗免疫效果评价。方法根据幽门螺杆菌尿素酶B亚基(urease B,Ure B)在各菌株中相对保守的特性设计引物,优化其扩增条件,建立幽门螺杆菌SYBR GreenⅡ实时定量PCR检测方法,并对方法的专属性、精密性、准确性及检测限进行验证。结果所设计的引物在阳性样本中可特异性地扩增出目的基因片段,且小鼠胃部中其他菌体的存在不影响反应结果的特异性。标准品质粒DNA模板含量在1×107~1×102拷贝/μl范围内线性良好,相关系数r2大于0.995,扩增效率在90%~110%之间。应用于小鼠胃组织幽门螺杆菌检测,具有较好的准确性和精密性,回收率为96.25%~101.42%,试验内和试验间相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于6%。用该方法检测高、中、低浓度的Hp菌液、并模拟定量Hp菌株在小鼠胃组织中的状态,试验内及试验间RSD均小于6%,精密度良好。其回收率大于80%,与平皿计数法一样,但灵敏度显著高于平皿计数法。结论 SYBR GreenⅡ实时定量PCR法快速有效,专属性良好,线性范围广,可重复性好,使用方便,可用于定量检测幽门螺杆菌在小鼠胃部组织中的定植,从而进一步应用于评估免疫反应对细菌定植的影响。     

H5N1禽流感病毒感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并检测H5N1 AIV感染前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。方法提取豚鼠肺脏组织RNA,反转录合成cDNA,将cDNA模板按10倍系列稀释为9个浓度(1.00 E+10~1.00 E+02 copies/μl),进行PCR扩增。以β-actin为内参,建立标准曲线,比较两基因的扩增效率,验证该方法的引物特异性、重复性及灵敏度。同时用该方法检测H5N1 AIV攻毒前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。结果 c DNA模板最佳稀释度范围为1.00 E+09~1.00 E+04。豚鼠MAVS和β-actin基因的标准曲线斜率差值0.1,R~2=0.999,扩增效率分别为100.2%和100.3%;两基因扩增溶解曲线峰单一,可扩增出清晰的目的条带,且无非特异性扩增;两基因Ct值的变异系数(CV)均10%;灵敏度为1.00 E+03 copies/μl。感染H5N1 AIV的豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平下调。结论成功建立了H5N1 AIV感染豚鼠体内MAVS的SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并发现H5N1 AIV感染可导致豚鼠体内MAVS表达水平下调。     

细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行优化及初步验证。方法以MS2噬菌体RNA模板及相应引物,建立一步检测逆转录酶扩增产物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,以梯度稀释的重组莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus,MMLV)逆转录酶活性参考品绘制标准曲线,进行逆转录酶活性的定量。对反应的引物和2×RT-PCR Mix进行优化,并对建立的方法进行线性关系、灵敏度、精密度和准确度验证。结果 1组引物(上游:5′-CATAGGTCAAACCTCGTAGGAATG-3′,下游:5′-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3′)更适合本方法;Promega公司生产的2×RT-PCR Mix具有更高的反应效率。逆转录酶活性在5.40×108~5.40×104pU/μl范围内定量标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.999 7;该方法判断样品阴阳性的标准cut-off值为1.31×104 pU/μl;检测CHO-1细胞株样品逆转录酶活性的试验内变异系数(CV)为0.80%,试验间CV值为16.4%;检测5株细胞样品逆转录酶活性的平均加标回收率为122.8%。结论建立了生物制品生产用细胞株逆转录酶活性SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,该方法能够准确地定量检测细胞株的逆转录酶活性。     

长效重组人生长激素纯化液中CHO-K1细胞残留DNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立检测CHO-K1细胞表达长效重组人生长激素(Fc-recombinant human growth hormone,Fc-rhGH)纯化液中残留DNA的实时荧光定量PCR方法,并进行验证。方法提取CHO-K1细胞基因组DNA,特异性PCR扩增后,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,以其为标准品,建立实时荧光定量PCR检测方法;并对方法进行灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性及耐用性验证。结果建立的方法灵敏度可达2. 6×10~1 copies/μL。标准曲线的回归方程为y=-3. 487 x+30. 201,R~2=0. 999;检测样品中DNA回收率在73. 56%～101. 87%范围内,RSD均小于10%;该方法可特异性扩增CHO-K1细胞的基因组DNA,而Vero细胞、MDCK细胞、Wish细胞及大肠埃希菌等基因组DNA均未见明显的扩增;样品精密度测定Ct的RSD在0. 4%～2. 95%之间;于两种不同PCR仪器上检测标准品,扩增效率分别为98%、99%,相关系数R~2均为0. 999。结论成功建立了一种检测CHO-K1细胞表达Fc-rhGH纯化液的残留DNA的实时荧光定量PCR方法,该方法具有较好的灵敏度、线性、准确度、精密度、特异性和耐用性。     

鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立鸡主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)BF1和BF2基因实时荧光定量PCR[Real-time fluorescent quantitative(FQ)-PCR]检测方法。方法从鸡外周血淋巴白细胞(Peripheral blood leuk-ocytes,PBLs)中提取细胞总RNA,以其为模板,根据BF1、BF2和GAPDH基因相对保守序列各设计一对引物,应用RT-PCR法扩增目的基因,分别克隆至pGM-T载体上,制备重组质粒标准品,经PCR、EcoRⅠ酶切及测序鉴定;优化反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立Real-time FQ-PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性。结果重组质粒标准品经PCR、酶切及测序鉴定构建正确;建立的定量标准曲线临界循环数(Threshold cycle,Ct)与BF1、BF2和GAPDH起始质粒DNA拷贝数的对数之间线性关系良好,相关系数分别为1.00、0.98、0.99,扩增效率分别为0.8、1.1、1.1;该方法的敏感性可达101copies/μl;融解曲线分析表明扩增效率一致,特异性较好;质粒DNA标准品3次检测的CV值误差不超过0.5,均小于5%。结论已成功建立了鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法,为下一步应用该法检测BF1和BF2基因的转录水平奠定了基础。     

人干扰素诱导跨膜蛋白基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立人干扰素诱导跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane protein,IFITM)1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank中登录的人IFITM1、2、3及β-actin基因序列,分别设计4对特异性引物,以质粒pVAX1-IFITM1、2、3和pMD18-T-β-actin为模板,分别进行PCR及实时荧光定量PCR扩增,优化实时荧光定量PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线及扩增曲线,建立实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的重复性、灵敏度及特异性。结果各质粒的PCR及实时荧光定量PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均可见大小与理论值相符的特异性条带。IFITM1、2、3和β-actin的最佳荧光定量PCR引物浓度分别为0.2、0.5、0.4和0.5μl,最佳退火温度为55℃。各质粒标准曲线的循环数与起始模板拷贝数的相关性均较好(R2分别为0.998、0.990、0.990和0.995),扩增效率分别为106.284%、101.030%、104.929%和101.962%。IFITM1、2、3基因不同拷贝数的试验内CV为0.14%-0.72%,试验间CV为0.77%-1.58%;灵敏度分别为2.52×100、1.3×100和3.7×101copies;该方法未扩增出鸡肝脏及禽流感病毒H3N2 cDNA,可特异性扩增B型流感病毒cDNA,各标准质粒的溶解曲线约在同一温度出现1个单峰。结论已成功建立了IFITM1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法,该方法具有较高的重复性、灵敏度及特异性,为进一步研究IFITM1、2、3的功能及其基因表达与肿瘤发生发展的相关性奠定了基础。     

细胞培养液中细菌、真菌多重荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的 建立细胞培养液中常见细菌和真菌的多重荧光定量PCR检测方法,并进行验证。方法 选取金黄色葡萄球菌NUC基因、生孢梭菌COLA基因和白色念珠菌ITS-2区段基因,分别设计1组引物及探针,并以辣椒UBI3基因作为外标基因,建立金黄色葡萄球菌、生孢梭菌和外标基因的三重反应体系及白色念珠菌和外标基因的两重反应体系。验证方法的引物特异性、线性范围、检测限、专属性、抗干扰性和精密性。采用建立的方法对100份293T细胞培养液样本进行检测,同时与普通PCR法进行比较。结果 3对引物于不同退火温度(56、57、58、59℃)下均可扩增出对应3种菌约100 bp的特异性基因条带,大小与预期相符;3种菌标准品质粒在5.80×10⁶～5.80×10²copies/μL范围内,与Ct均呈良好的线性关系,标准曲线方程分别为：Y=-3.373 X+37.48、Y=-3.557X+36.59、Y=-3.536 X+39.78,R²均> 0.99,扩增效率均在90%～110%范围内;3种菌的检测限均为10¹CFU/mL...     

实时荧光定量PCR方法检测人癌组织中RFP蛋白的表达

目的检测RFP(Ret finger protein)蛋白在人正常组织及人癌组织中的分布。方法采用实时荧光定量PCR方法,以18 S rRNA为内对照,检测RFP在人正常组织及人癌组织中的表达水平。结果RFP表达水平子宫颈鳞状细胞癌组织高于正常子宫颈组织,子宫内膜腺癌组织高于正常子宫内膜组织,胃腺癌组织高于正常胃组织,食管鳞状细胞癌组织高于正常食管组织,而子宫内膜腺癌组织高于子宫颈鳞状细胞癌组织,胃腺癌组织高于食管鳞状细胞癌组织,脑癌组织高于正常脑组织。结论RFP可能成为治疗恶性肿瘤的一个潜在的分子靶点。     

鼠源性病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的 建立8种鼠源性病毒的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,Q-PCR)检测方法,并进行验证。方法 通过4个实验室验证Q-PCR法的特异性、灵敏度及精密性,同时进行病毒模拟污染试验及盲样检测,并将检测结果进行比对。采用Q-PCR法检测26批SARS-CoV-2疫苗生产用单抗细胞株及15批其他鼠源性制品。结果 用于8种鼠源病毒检测的Q-PCR法与同科同属或其他鼠源病毒无交叉反应;除实验室2对鼠痘病毒(又名脱脚病病毒)(ectromelia virus,EctV/Mouse Pox,MPV)检测的灵敏度为2×10²copies/μL外,实验室2对其他7种病毒及其他3个实验室对8种鼠源性病毒的检测灵敏度均为2×10¹copies/μL;除实验室3对鼠腺病毒(mouse adenovirus,MAdV)检测拷贝数试验间CV为37.58%外,实验室3对其他7种病毒和其他3个实验室对8种病毒检测的试验内、试验间Ct和拷贝数CV均<25%。病毒模拟污染试验检测灵敏度均符合参数要求;4个实...     

乙脑患儿脑脊液和血清可溶性细胞间黏附分子-1的变化及其临床意义

目的探讨流行性乙型脑炎(乙脑)患儿脑脊液和血清可溶性细胞间黏附分子-1变化的临床意义。方法对45例乙脑患儿采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定脑脊液和血清可溶性细胞间黏附分子-1,20例无神经系统疾病而需外科手术的腰麻患儿为对照组。结果乙脑患儿极期轻型、普通型、重型脑脊液可溶性细胞间黏附分子-1分别为(4.78±0.74)ng/L、(6.42±0.84)ng/L、(9.12±0.75)ng/L,血清可溶性细胞间黏附分子-1分别为(432.47±124.32)ng/L、(687.43±154.85)ng/L、(952.64±187.54)ng/L;对照组脑脊液可溶性细胞间黏附分子-1为(2.43±0.31)ng/L,血清可溶性细胞间黏附分子-1为(235.31±55.26)ng/L。乙脑患儿极期脑脊液和血清可溶性细胞间黏附分子-1水平显著高于对照组(P<0.01)。并且,乙脑患儿脑脊液和血清可溶性细胞间黏附分子-1水平随临床分型加重而增高(P<0.01)。乙脑患儿恢复期血清可溶性细胞间黏附分子-1为(394.76±142.76)ng/L,较极期下降(P<0.01)。结论乙脑患儿脑脊液和血清可溶性细胞间黏附分子-1水平呈正相关,且与临床分型相关,检测乙脑患儿血清可溶性细胞间黏附分子-1水平的变化,有助于判定脑组织受损的严重程度及评估患儿的预后。     

一种基于VP6基因的A组轮状病毒拷贝数实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种基于VP6基因的A组轮状病毒(rotavirus,RV)拷贝数的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。方法提取病毒液中RV基因组RNA,经RT-PCR扩增VP6基因片段,回收PCR产物克隆至pMD-19T载体,将鉴定正确的阳性菌株常规培养制备标准品质粒,建立RT-qPCR病毒拷贝数检测方法,以标准品质粒Ct值为横坐标,拷贝数的对数为纵坐标绘制标准曲线,依据标准曲线方程检测样品中RV拷贝数。结果标准品质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;获得RV标准品质粒的标准曲线方程为y=-0. 246 3 x+10. 957,R~2=0. 995 5;原倍及稀释度为1×10~(-3)的样品溶液的RV病毒拷贝数分别为265 319. 903 5、1 682. 228 735 copies/μL。结论建立的RT-qPCR拷贝数检测方法,能在早期快速准确的检测RV,该方法稳定性较好,可据此标准曲线方程对样品中的RV进行绝对定量,为RV研究及临床检查提供了检测工具。     

牛乳中蜡样芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立一种快速检测牛乳中蜡样芽孢杆菌的荧光定量PCR方法,并进行验证。方法根据GenBank中登录的蜡样芽孢杆菌gyrB基因序列及荧光定量PCR要求,设计合适的特异性引物,提取菌体DNA,对目的基因进行扩增及克隆;以重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线;以蜡样芽孢杆菌DNA为模板进行荧光定量PCR扩增,确定其扩增条件。对建立的方法进行特异性及灵敏性验证。结果建立的方法检测其他3种牛乳中常见致病菌(大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌)未见特异性扩增,即无交叉反应;最低检出限为1×10~(-7) ng/μL。以掺入蜡样芽孢杆菌的牛乳为样品,可检测到牛乳中10. 4 CFU/mL的蜡样芽孢杆菌,优于国标方法(GB 4789. 14-2014)检测含有相同菌落数的蜡样芽孢杆菌(仅能检测到1. 04×10~2 CFU/mL)。结论建立的方法特异性强,灵敏性高,适用于快速、准确检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌,为实验室快速检测致病菌提供了参考。     

TaqMan MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA方法的适用性验证及应用

目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液、纯化液和原液中Vero细胞残余DNA含量,计算Vero细胞残余DNA去除率。结果 Taq Man MGB探针实时定量PCR能够特异性扩增Vero细胞基因组DNA长串连重复序列;DNA浓度在10-1~10-6 ng/μl范围内标准曲线线性良好,相关系数为0.996,扩增效率为93.54%;检测灵敏度为10-6 ng/μl,高于斑点杂交法;检测高(10-2 ng/μl)、中(10-4 ng/μl)、低(10-6 ng/μl)浓度阳性对照DNA模板的试验内变异系数(CV)为0.145%~3.110%,试验间CV为0.624%~2.359%;检测不同浓度阳性对照DNA的回收率在101.5%~109.4%之间,均在定量方法可接受的回收率范围内;在斑点杂交检测灵敏度范围内,同一样品采用Taq Man MGB探针实时定量PCR法与斑点杂交法半定量检测的结果吻合。3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液纯化后可有效去除Vero细胞残余DNA,总去除率约为100%。结论 Taq Man探针实时定量PCR法特异性、精密性、准确性良好,灵敏度高,可作为斑点杂交法的替代方法,用于实验室内部的质量控制。     

流感疫苗毒种中3种外源性禽病毒荧光定量PCR检测方法的实验室间验证

目的 实验室间验证流感疫苗毒种中3种外源性禽病毒的荧光定量PCR(Q-PCR)检测方法.方法 联合4家实验室对已建立的流感疫苗毒种中禽腺病毒Ⅰ型[鸡胚致死孤儿病毒(chicken embryo lethal orphan virus,CELO)]、禽腺病毒Ⅲ型[减蛋综合征病毒(egg drop syndrome vir...     

猪细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据GenBank中登录的PPV NADL-2株序列,针对VP2区设计引物,以提取的PPV核酸为模板,进行荧光定量PCR扩增;优化反应体系及反应条件,并进行专属性、重复性和敏感性验证。用建立的荧光定量PCR法检测辛酸沉淀及L、P、S公司生产的纳米膜过滤器去除制品中PPV的效果。结果优化后的荧光定量PCR反应体系:Eva Green预混液7.5μl,上下游引物各0.5μl,模板DNA 1μl,补加dH2O至15μl;反应条件:95℃3 min,95℃10 s和60℃10 s,共40个循环;模板浓度的对数值与循环数的相关性较好(R2=0.999),扩增效率为102.5%。该方法可特异性扩增PPV,而对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、牛细小病毒(bovine parvovirus,BPV)、鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)及猪肾细胞PK-15无扩增反应;试验内CV为0.79%².81%,试验间CV为1.23%2.81%,试验间CV为1.23%².21%,均<5%,最低检测限为102copies/μl。辛酸沉淀可使样品中PPV浓度下降5 Logs;不同公司生产的20 nm膜滤器过滤量及过滤效果均有明显差异,其中S公司生产的滤器效果最好,可使样品中的PPV滴度下降4 Logs。结论已成功建立了PPV荧光定量PCR检测方法,为快速、准确的检测病毒去除工艺对PPV的去除效果奠定了基础。     

化妆品中动物源性成分多重实时荧光PCR检测方法的研究

使用优化的Chelex-100结合玻璃奶法提取膏状、液态和固态化妆品中的动物源性DNA;根据驴、马和牛线粒体16S rRNA基因序列设计通用引物和特异性探针,建立了一次性检测化妆品中驴、马和牛3种动物源性成分的多重实时荧光PCR体系,检出限均为0.001 ng。并对市售的面霜、洗面奶和面膜进行盲样检测,验证了体系的可靠性和准确性。     

实时荧光定量PCR方法检测人、鼠正常组织及脑癌组织中CD109蛋白的表达

目的分析CD109基因在正常组织及脑癌组织中的分布。方法采用实时荧光定量PCR方法,分析CD109在人、鼠正常组织及脑癌中的表达,以18SrRNA作为内标。结果CD109蛋白的mRNA丰度在睾丸组织中最高,在其它组织中较低,在12份脑癌标本中,检测到9份CD109表达上调。结论CD109基因在多数正常组织中表达很少,有可能是治疗恶性肿瘤的一个潜在的分子靶点。