IBRV TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法在BVDV和IBRV共感染中病毒定量检测的应用

目的应用牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)Taq Man-MGB实时荧光定量PCR方法进行牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和IBRV共感染的病毒定量检测,进一步研究BVDV和IBRV共感染后BVDV对IBRV复制的影响。方法分别用0.2和1.0 MOI的BVDV感染MDBK细胞,待细胞出现50%CPE时,再用0.1 MOI的IBRV共感染,作用24 h后收集样品,采用Taqman-MGB实时荧光定量PCR方法检测IBRV的拷贝数,并与对照组(IBRV单独感染组)进行比较。结果在先感染0.2和1.0 MOI BVDV情况下,IBRV拷贝数分别为3.0×10~6和6.47×10~6拷贝/μL,单独感染IBRV的对照组的拷贝数为1.15×10~7拷贝/μL。结论在体外情况下,BVDV对IBRV的复制影响较小,为研究BVDV和IBRV的共感染机制以及制备BVDV和IBRV感染同一细胞的二联苗奠定了基础。     

基于网络药理学和分子对接技术探讨清肝颗粒治疗慢性肝炎的作用机制

目的：利用网络药理学分子对接技术探讨清肝颗粒治疗慢性肝炎的作用机制。方法：首先利用TCMSP数据库收集清肝颗粒的中的化学成分以及靶点，利用OB、DL筛选候选活性化合物成分，然后通过CTD数据库、TTD数据库筛选出慢性肝炎相关的靶点；通过DAVID数据库对靶点进行GO富集分析和KEGG通路分析。运用Cytoscape3.6.1构建化合物-靶点、靶点-通路网络图；慢性肝炎通路整合与分析，最后通过AutoDock软件对主要活性成分及核心作用靶点进行分子对接验证。结果：检索得到清肝颗粒的化合物成分487个、靶点466个；筛选得到候选活性成分101个、慢性肝炎相关靶点115个，GO富集分析得到GOCC、GOMF、GOBP条目(p≤0.05)分别46、49、207个；KEGG通路富集筛选得到相关的通路23条，涉及钙信号通路、非酒精性脂肪肝、T细胞受体信号通路等。构建“慢性肝炎通路”,揭示了清肝颗粒在通路水平上协同发挥治疗慢性肝炎的效果，分子对接结果显示潜在的活性成分与核心靶点PTGS2、PPARG和NOS2均有较好的结合。结论：该研究通过运用网络药理学的研究方法发现清肝颗粒治疗慢性肝炎具有多成分、...     

佛波酯对人单核白血病细胞THP-1中颗粒溶素表达的激活作用

目的探讨佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetatefor,PMA)对人单核白血病细胞THP-1中颗粒溶素(granulysin,GLS)表达的激活作用。方法分别用不同浓度的PMA(130、160、180 nmol/L)诱导THP-1细胞24 h,RT-PCR法检测细胞中GLS基因mRNA的转录,筛选PMA最佳诱导浓度;用PMA最佳诱导浓度分别诱导THP-1细胞12、24和48 h,RT-PCR法检测GLS基因mRNA的转录,筛选最佳诱导时间;用PMA最佳诱导浓度分别诱导THP-1细胞12、24、48和72 h,Western blot法检测GLS蛋白的表达,免疫细胞化学法检测48 h时GLS蛋白的表达。结果以160 nmol/L的PMA诱导THP-1细胞24 h,细胞中GLS基因mRNA的转录水平最高;诱导48 h后可检测到GLS蛋白大量表达。结论 PMA可激活THP-1细胞中GLS的表达,本实验为后续进一步研究GLS表达的调控机制奠定了基础。     

3个生长温度的家蝇幼虫转录组和表达谱分析

目的:通过3个不同生长温度的家蝇幼虫表达谱差异分析,为进一步探究温度引起的家蝇幼虫转录组变化提供实验数据。方法:提取3个生长温度(18℃、28℃、38℃)4龄期家蝇幼虫总RNA,反转录成cDNA,进行Illumina测序、de novo组装及生物信息学分析。结果:对3个不同生长温度的家蝇幼虫转录组测序组装共得到43,570个Unigene,分别将18℃和38℃培养的家蝇幼虫转录组与28℃培养的家蝇幼虫转录组进行比较,筛选到10,863个和11,606个差异表达基因,其中共同上调的差异表达基因有1,994个,共同下调的差异表达基因有3,640个。对差异基因进一步GO功能显著性富集分析和KEGG通路分析显示,这些差异表达基因主要细胞、细胞组分、代谢过程有关。     

进口胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒的分离及鉴定

目的对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)进行分离及鉴定。方法Trizol法提取待检胎牛血清中的病毒RNA后,利用套式RT-PCR扩增BVDV,并利用生物信息学Lasergene 7.0软件对其核苷酸序列进行同源性分析。取生长状态良好的MDBK细胞,按1%比例加入待检胎牛血清,收获F1代BVDV FBS2014,反复冻融3次后,再次接种MDBK细胞,连传4代。采用荧光定量RT-PCR法、间接免疫荧光试验及抗原捕获ELISA法对收获的病毒进行鉴定。结果扩增产物大小均与预期相符,与已报道的BVDV-1 NADL株的核苷酸序列一致性为92.2%,属于BVDV-1a亚型毒株;分离的病毒经鉴定为BVDV,命名为BVDV FBS2014,病毒基因拷贝数为10~4拷贝/μl,感染MDBK细胞可见特异性绿色荧光;各代次的病毒收获液中BVDV的基因拷贝数均大于10~(4.92)拷贝/μl,BVDV抗原检测结果均为阳性。结论购买的进口胎牛血清中成功分离到可致MDBK细胞产生细胞病变的病毒,经鉴定所分离的病毒为BVDV,命名为FBS2014株,该病毒属于BVDV-1a亚型毒株。     

哺乳动物呼肠孤病毒在不同细胞中的复制动力学及体外抗肿瘤活性

目的探讨哺乳动物呼肠孤病毒3型标准株(Reovirus 3)在不同细胞中的复制动力学,并对其体外抗肿瘤活性进行初步的研究。方法将低浓度的呼肠孤病毒分别接种于Vero-E6、MRC-5和MDBK 3种细胞,盲传3代,逐日观察细胞病变(CPE);采用直接免疫荧光抗体法检测盲传3代后的病毒复制情况;将黑色素瘤细胞与MDBK细胞置同一个器皿中用呼肠孤病毒进行攻毒,每日观察CPE。结果接种低浓度的呼肠孤病毒后72 h,即可在MDBK细胞中观察到明显的CPE;在MRC-5细胞中盲传3代未发现CPE;在Vero-E6细胞中盲传3代可发现轻微的CPE。呼肠孤病毒在MDBK细胞中可稳定传代;在MRC-5细胞中盲传3代未检测到病毒;在Vero-E6细胞中盲传2代即可检测到病毒,但荧光强度较弱。接种呼肠孤病毒后30 h,黑色素瘤细胞出现破裂且大面积死亡,MDBK细胞局部区域开始出现CPE,且病变区域逐渐扩大。结论 MDBK细胞是最适合培养呼肠孤病毒的细胞,Vero-E6细胞中病毒可以繁殖,但是复制动力较MDBK细胞弱,MRC-5细胞不适于培养呼肠孤病毒。呼肠孤病毒在体外具有选择性的杀死癌细胞的特性,但由于机体的免疫系统相对体外更加复杂,体内具有的抗肿瘤活性尚需在肿瘤动物模型中进行进一步的研究。     

基于网络药理学的天麻抗缺血性脑中风作用机制研究

使用SciFinder、CNKI、Pubchem、SwissADME及Swiss Target Prediction数据库得到天麻活性成分及靶点;利用Genecards、TTD及Drugbank数据库获得缺血性脑中风的潜在靶标;通过Venny在线软件平台得到天麻与疾病的交集靶点,并将其导入Cytoscape软件构建“成分-靶点”网络图;利用String数据库及Cytoscape软件构建PPI网络与核心靶点筛选;通过Metascape平台进行GO和KEGG富集分析。通过筛选获得天麻活性成分35个、天麻靶点498个;缺血性脑中风相关靶点1031个;天麻与疾病共同靶点170个;GO富集分析得到1914条生物过程、111条细胞组分表达过程、190个与分子功能相关的过程;KEGG富集分析得到306条信号通路。天麻可能通过酚性化合物作用于关键靶点GAPDH、CASP3、STAT3、AKT1、MAPK3及MAPK8,发挥对cGMP-PKG、HIF-1、cAMP、AMPK等信号通路调节作用,干预细胞凋亡、血管再生、炎症反应、氧化应激反应及能量代谢障碍等机制防治缺血性脑中风。     

基于网络药理学探讨清开灵解热作用机制

目的：基于网络药理学探索清开灵解热的作用机制。方法：查找清开灵的活性成分与作用靶点和发热的相关靶点,制作韦恩图、药物-活性成分-作用靶点网络图、PPI网络并进行分析。结果：筛选出清开灵活性成分62个,作用基因靶点389个,其中99个为清开灵与发热的共同基因靶点,靶点包括丝/苏氨酸蛋白激酶1、人重组BCL2L1、半胱天冬酶-9、窖蛋白等。GO和KEGG富集分析共得到428个GO富集条目和147个KEGG富集条目,涉及癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路等。结论：清开灵在解热中有着多靶点调控、多方面共同作用的特点。     

冷应激大鼠体内miR-383-5p表达的变化及其功能的预测分析

目的探讨冷应激大鼠体内miR-383-5p表达的变化,并对其功能进行预测分析。方法将大鼠置(4±0. 05)℃冷暴露12 h,同时设对照组(24℃常温饲养),qRT-PCR法检测miR-383-5p在血清和肝脏中的表达水平。应用miRanda、TargetScan和miRDB 3种软件同时对miR-383-5p进行靶基因预测,并通过DAVID 6. 8软件对miR-383-5p肝脏靶基因进行GO和KEGG分析。qRT-PCR和Western blot法检测下调BRL-3A细胞中miR-383-5p表达对部分代谢相关靶基因mRNA转录及蛋白表达的影响。结果冷应激后小鼠血清及肝脏中的miR-383-5p相对表达量均显著下降(P 0. 05)。生物信息学方法预测出733个在大鼠肝脏表达的靶基因,GO富集分析结果显示这些靶基因主要与细胞氧化还原过程、增殖和凋亡相关,KEGG分析结果显示富集靶基因最多的信号通路是代谢通路。下调miR-383-5p表达使BRL-3A细胞中Mtor、Pfkfb1和Apbb3基因的mRNA的转录水平显著升高(P 0. 05),Pfkfb1蛋白的表达量显著升高(P 0. 05)。结论冷应激可降低大鼠肝脏中miR-383-5p的表达量,进而通过调节Pfkfb1等靶基因的表达参与细胞的代谢、增殖和凋亡。     

基于网络药理学的小儿肺热咳喘颗粒治疗肺炎的作用机制探讨

目的：利用网络药理学探究小儿肺热咳喘颗粒(XFKP)治疗肺炎的作用机制。方法：利用TCMSP、TCMID、Symmap数据库筛选XFKP中活性成分及其作用靶点,通过Genecards、Drugbank、Pharmgkb等数据库收集肺炎疾病靶点。提取成分与疾病靶点的交集靶点,借助STRING数据库绘制共同靶点相互作用网络,并以中位值筛选靶点。对所筛选靶点进行GO分析和KEGG信号通路富集分析。结果：共获得XFKP潜在活性成分239个和对应靶点269个,成分与疾病的共同靶点136个,以中位值筛选出核心靶点24个。以此靶点进行分析获取GO生物过程条目1782个,细胞组成条目45个,分子功能条目111个,KEGG通路139条。Cytoscape软件构建有效成分-靶点-疾病-信号通路网络图,以平均度值筛选核心成分10个,靶点23个。结论：XFKP可能通过关键有效成分槲皮素、木樨草素、柚皮素等,靶向核心靶点EGF、MMP9、PPARG等,从而调节IL-17、MAPK、TNF等信号通路作用于肺炎。