诺如病毒优势流行基因型间免疫交叉阻断谱分析

目的分析诺如病毒(norovirus,NoV)GⅠ和GⅡ基因群内5种优势流行基因型(GⅠ. 1、GⅡ. 2、GⅡ. 3、GⅡ. 4、GⅡ. 17)间的抗体交叉反应性和交叉阻断活性,为NoV疫苗的研发路线和疫苗临床研究设计提供基础数据。方法使用经铝佐剂吸附的NoV GⅠ. 1、GⅡ. 2、GⅡ. 3、GⅡ. 4、GⅡ. 17病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)和佐剂对照品免疫小鼠,抗原剂量为3μg/只,第28天加强免疫1次,第56天处死小鼠,采集血清,采用间接ELISA法检测小鼠血清中各型NoV特异性IgG抗体,以基于ELISA法的受体结合阻断试验检测各型NoV阻断抗体。结果 GⅠ. 1型和GⅡ基因群各型间交叉反应IgG抗体GMT均小于或接近cut-off值(滴度=40)。GⅡ各型间,GⅡ. 2和GⅡ. 3VLP免疫小鼠后,均可诱导针对其余型别的交叉反应IgG抗体,各组GMT在494～2 792之间。GⅡ. 4 VLP可诱导GⅡ. 2 IgG抗体(GMT=1 660),以及较低水平的GⅡ. 3(GMT=226)和GⅡ. 17(GMT=147)IgG抗体。GⅡ. 17 VLP可诱导GⅡ. 2(GMT=6 401)和GⅡ. 3(GMT=830)IgG抗体。GⅠ. 1型和GⅡ各型间交叉阻断抗体GMT均小于cut-off值(BT_(50)=20)。在GⅡ各型间,交叉阻断抗体阳性的分别为:GⅡ. 2 VLP免疫血清对于GⅡ. 3和GⅡ. 4,GⅡ. 3VLP免疫血清对于GⅡ. 2,GⅡ. 4和GⅡ. 17 VLP免疫血清对于GⅡ. 2和GⅡ. 3;上述阻断抗体GMT均在31～73之间,且各组间针对同一型别的交叉阻断抗体GMT差异无统计学意义。GⅡ. 2、GⅡ. 3和GⅡ. 4均无针对GⅡ. 17的交叉阻断活性。结论 NoV GⅠ基因群和GⅡ基因群间不存在抗体交叉反应性和交叉阻断活性,而GⅡ群部分型别间存在有限的抗体交叉反应性和交叉阻断活性。     

GⅡ.21型诺如病毒衣壳蛋白VP1的表达、纯化及鉴定

目的构建含有GⅡ.21型人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)衣壳蛋白VP1基因的重组质粒,通过PichiaPink毕赤酵母表达VP1蛋白,并鉴定纯化产物。方法合成NoV GⅡ.21 VP1蛋白基因序列,将其连接至pPink-HC载体,构建重组质粒pPink-HC-GⅡ.21-VP1;经测序鉴定后,电转化毕赤酵母PichiaPink,甲醇诱导目的蛋白表达;采用AKTA pure M150型纯化仪纯化目的蛋白,Western blot法分析其抗原性,SEC-HPLC法检测纯化蛋白出峰时间。结果经测序鉴定,重组质粒pPink-HC-GⅡ.21-VP1构建正确;纯化的目的蛋白VP1纯度在95%以上,能与抗NoV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)抗体发生反应;测定目的蛋白出峰时间为16. 923 min,与NoV VLP理论出峰时间一致。结论成功在毕赤酵母高表达了GⅡ.21衣壳蛋白VP1,并制备了高纯度及良好抗原性的目的蛋白,为多价重组NoV疫苗的研发及规模化生产奠定了基础。     

诺如病毒VP1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的分泌表达

目的探讨诺如病毒(Norovirus,NoV)VP1蛋白的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)在毕赤酵母表达系统中分泌表达的可行性。方法用pPICZa-A表达载体和X-33毕赤酵母株进行NoV GⅡ.4和GⅡ.17型VP1蛋白的分泌表达,并对阳性菌株进行Mut表型筛选。同时优化起始pH(5.0、6.0、7.0、8.0)、甲醇终浓度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)及发酵时间(24、48、72、96、120 h)3个表达条件。取原始及传代10代菌株,采用优化条件进行发酵,于诱导0～60 h间,通过双标准曲线实时荧光定量PCR法测定外源基因拷贝数。发酵产物经蔗糖密度梯度离心纯化后,检测其浓度及纯度,并观察VLP的形态。结果表达目的蛋白的重组酵母菌株均为Mut~+型。最佳发酵pH为7.0,甲醇终浓度为1%,发酵时间为72 h。菌株传代后未发生基因缺失,整合基因在10代内稳定性良好。GⅡ.4及GⅡ.17型VP1纯度均约85%,浓度分别为133和165μg/mL,VP1蛋白均可自发组装成直径约40 nm的VLP颗粒,形态与天然病毒相似。结论用毕赤酵母表达系统进行NoV VP1蛋白VLP分泌表达是可行的。     

GⅡ.4诺如病毒抗原ELISA定量检测方法的建立及其应用

目的建立GⅡ.4诺如病毒(Norovirus,No V)抗原ELISA定量检测方法,用于重组GⅡ.4 No V病毒样颗粒疫苗研制中抗原含量检测。方法使用纯化的GⅡ.4 No V病毒样颗粒作为免疫原,分别免疫新西兰大白兔和豚鼠,制备抗血清。以豚鼠抗GⅡ.4病毒样颗粒多抗作为包被抗体,HRP标记的兔抗GⅡ.4病毒样颗粒多抗作为检测抗体,建立GⅡ.4 No V抗原ELISA定量检测方法,确定该方法的线性范围,并对该方法的准确度、精密度、稳定性、特异性进行验证;用建立的方法检测GⅡ.4病毒样颗粒制备过程中间品的抗原含量。结果 GⅡ.4病毒样颗粒内部参考品在15.6~250 ng/ml范围内,线性关系良好,R20.98,高、中、低3个浓度样品回收率在90.9%~110.2%之间,板内和板间精密度试验的CV值均不超过15%;包被微孔板37℃放置6 d,稳定性试验的CV值均小于15%;与GⅡ.4No V病毒样颗粒之外的抗原均无交叉反应;可用于定量检测重组No V抗原制备过程中不同阶段样品。结论建立了GⅡ.4 No V抗原ELISA定量检测方法,该方法准确度、精密度、稳定性、特异性、适用性均良好,为No V病毒样颗粒疫苗的研制提供了质控方法。     

狂犬病病毒糖蛋白抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立可快速检测狂犬病病毒(rabies virus,RabV)糖蛋白抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证及初步应用。方法用抗RabV糖蛋白基因工程抗体建立双抗体夹心ELISA法,检测RabV糖蛋白抗原含量。对建立的方法进行特异性、线性、准确性、板内与板间精密性、灵敏度验证,对不同厂家(毒株分别为aG、PV、CTN、PM)生产的狂犬病疫苗与不同工艺阶段的狂犬病疫苗样品进行适用性检测。结果捕获抗体与酶标抗体最佳稀释度分别为1∶2 000和1∶4 000,最佳封闭剂为1. 5%BSA。该方法与其他人用疫苗和辅料成分无交叉反应;线性范围在0. 003 2~0. 103 1 IU/mL之间,R2> 0. 98;准确性验证的回收率在97. 0%~110. 1%之间;精密性验证的板内变异系数<8. 6%,板间变异系数<13. 9%;检测不同厂家的狂犬病疫苗和不同工艺阶段的疫苗样品呈良好的剂量依赖效应。结论建立了适用于人用狂犬病疫苗糖蛋白抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法,符合定量检测的需求,可用于aG、PV、CTN、PM等不同毒株生产的狂犬病疫苗检测;也可用于病毒收获液、浓缩液、灭活液及原液等不同工艺阶段样品检测。     

GⅡ.4型人诺如病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗GⅡ.4型人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)衣壳蛋白VP1单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法 PCR扩增GⅡ.4型HuNoV VP1基因序列,将其插入至原核表达载体pGEX-5X-1中,构建重组质粒p GEX-5X-1-VP1,转化至E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并通过亲和层析纯化获得重组蛋白GST-VP1。利用杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与经GST-VP1抗原免疫的BALB/c小鼠的脾细胞进行融合,通过间接ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,并进行纯化。采用间接ELISA法、Biacore法和Western blot法分别检测单克隆抗体的效价、亲和力及特异性。结果经菌落PCR及测序鉴定,重组质粒pGEX-5X-1-VP1构建正确。重组蛋白GST-VP1相对分子质量约85 000,大部分以可溶形式存在,纯化后浓度为1.100 mg/mL。筛选获得3株能分泌GⅡ.4型HuNoV VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为NoV C1、NoV D9和NoV H6,效价均可达1∶10~7以上,亲和力常数KD(M)分别为4.422×10~(-7)、4.303×10~(-8)、7.540×10~(-7 )mol/L,均可与HuNoV VP1天然蛋白及GST-VP1重组蛋白发生特异性结合。结论利用原核表达系统成功表达了GST-VP1蛋白,并通过杂交瘤技术制备了高效价的GⅡ.4型HuNoV VP1特异性单克隆抗体,为GⅡ.4型HuNoV免疫诊断和疫苗的研发奠定了基础。     

基于噬菌体抗体库技术制备诺如病毒全人源单链抗体

目的 基于噬菌体抗体库技术制备抗诺如病毒(norovirus,NoV)全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)。方法 从GⅡ. 6 NoV感染者恢复期外周血中分离得到外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),提取总RNA,RT-PCR法分别扩增scFv的重链和轻链可变区基因片段,通过Overlap PCR技术将两者随机拼接成scFv基因片段。将scFv基因克隆至噬菌体质粒pCANTAB-5E,转化至感受态E. coli TG1,获得全人源scFv噬菌体抗体库。以GⅡ. 6 P蛋白为固相抗原对抗体库进行4轮生物筛选,以选取的特异性抗NoV阳性噬菌体为模板,扩增scFv基因后,进行原核表达及纯化,并鉴定其特异性及中和性。结果 人源噬菌体scFv抗体库库容约为8.8×10⁶PFU/mL。4轮生物筛选共获得10株scFv,均能与GⅡ. 4、GⅡ. 6和GⅡ. 17 NoV P蛋白发生特异性结合,且对3株NoV毒株均有不同程度的阻断作用。结论 利用GⅡ. 6 NoV感染...     

狂犬病病毒抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

目的建立狂犬病病毒(Rabies virμs,RV)抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,以应用于疫苗生产过程中RV含量的监测。方法将RV aGV株纯化抗原经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,制备抗RV单克隆抗体,纯化后以HRP进行标记,建立双抗体夹心ELISA检测方法。以狂犬病疫苗(效力检定用)国家标准品为定量标准,建立剂量-反应曲线,确定该方法的灵敏度,并对该方法的专属性、精密性及适用性进行验证。结果制备了2株针对不同抗原位点的单克隆抗体1E9和2H1,间接ELISA法测定腹水效价为1∶105～1∶107,纯化后蛋白含量分别为10.285和7.64 mg/ml。建立的ELISA法对RV抗原的最低检出限为1.03 mIU/ml,标准曲线的最佳线性范围为1.03～66 mIU/ml,相关系数为0.991 9。该方法对检测过程中可能遇到的杂质和添加物(人血清白蛋白、牛血清、Vero细胞培养上清)的检测结果均为阴性;检测3个浓度(20、12.50和3.13 mIU/ml)狂犬病疫苗(效力检定用)国家标准品的试验内和试验间变异系数的平均值分别为7.78%和14.0%;用该方法检测不同毒株、不同细胞生产的狂犬病疫苗的RV抗原含量的平均值在0.67～4.86 IU/ml之间。结论成功建立了RV抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,可对来自不同毒株、不同细胞的狂犬病疫苗的RV抗原进行快速定量检测,为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段。     

抗乙型脑炎病毒NS1蛋白抗体的制备及其抗原定量ELISA检测方法的建立及验证

目的 制备抗乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)非结构蛋白NS1多克隆抗体和单克隆抗体,并建立针对JEV的抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,用于疫苗研制中抗原定量及质量控制。方法 原核表达制备重组蛋白JEV-NS1,纯化后免疫BALB/c小鼠和家兔,制备兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体。分别以兔多抗作为捕获抗体、HRP-JEns1C1鼠单抗作为检测抗体和鼠单抗JEns1C1作为捕获抗体、酶标兔多抗作为检测抗体,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度和检测抗体浓度,建立抗原定量ELISA检测方法。确定该方法的线性范围及灵敏度,并对其专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证。结果 制备了特异性好、效价高的抗JEV-NS1兔多抗和鼠单抗,以兔多抗作为捕获抗体、HRP-JEns1C1鼠单抗作为检测抗体建立了抗原定量ELISA检测方法。该方法在检测范围为250.0～4 000.0 ng/mL时,R²不低于0.99;高(2 000.0 ng/mL)、中(1 000.0 ng/mL)、低(500.0 ng/mL)3个浓度样品准确度验证回收率为8...     

柯萨奇病毒A组16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性

目的应用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),通过条件优化,提高VLP的表达量,纯化后检测其免疫原性。方法对CVA16结构蛋白基因P1及蛋白酶基因3CD进行密码子优化,插入启动子P10改造为CMV的重组杆状病毒表达载体p Fast Bac Dual-CMV中,获得重组穿梭质粒p Fast Bac Dual-CMV-P1-3CD,转化DH10 Bac TM Competent Cells,提取重组杆粒Bacmid-CMVP1-3CD,转染Sf9细胞,组装成重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD,并进行扩增,采用间接免疫荧光法、Western blot法及透射电镜观察对表达产物进行初步鉴定。对重组CVA16 VLP的表达条件(病毒接种MOI值、感染时间及细胞培养方式)进行优化后,通过20%蔗糖垫层及氯化铯连续密度梯度离心法纯化CVA16VLP,并通过腹部皮下注射免疫ICR小鼠3次,采用间接ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体滴度,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度。结果重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD经PCR及测序鉴定证实组装成功;重组CVA16 VLP在Sf9细胞中成功表达,优化的表达条件为:重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD按MOI=5接种,Sf9细胞采用悬浮培养方式悬浮培养96 h,收集细胞及培养上清;纯化的CVA16 VLP纯度可达90%以上,针对VP2的单克隆抗体能与VP0及VP2发生特异性反应,电镜下可见大量形态规则的类球形VLP,直径约为27 nm;纯化的CVA16 VLP免疫ICR小鼠后,诱导机体产生的特异性血清Ig G滴度可达1∶105,中和抗体滴度达1∶358。结论应用杆状病毒表达系统成功表达了CVA16的P1和3CD蛋白,并组装形成完整的VLP;通过质粒启动子的改造及表达条件的优化,有效提高了CVA16 VLP的表达量;纯化的CVA16 VLP可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,为CVA16亚单位疫苗的研究提供了参考。     

sIPV疫苗D抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的 建立牛多抗对兔多抗夹心ELISA方法 检测Sabin株脊灰病毒灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus Vaccine,sIPV)D抗原含量,并对建立的方法 进行验证。方法 分别采用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型sIPV疫苗原液作为抗原制备兔多抗,并通过间接ELISA法检测其效价及特异性。以牛多抗为包被抗体、兔多抗为显示抗体建立检测D抗原含量的双抗体夹心ELISA方法 ,并对方法 的准确度、精密度及D抗原专属性进行验证。用建立的方法 检测国内5家企业sIPV疫苗样品。结果 制备获得型别特异性好、效价高的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型兔多抗,并成功建立了双抗体夹心ELISA方法 。采用四参数拟合,3型别标准曲线均具有良好的线性关系,R²均>0.99。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型各试验加标回收率均为80%～120%,各浓度平均回收率分别为98.11%、97.41%、98.66%;重复性与中间精密度CV均<10%;能够对D/C抗原进行区分。建立的方法 对5家企业生产的sIPV疫苗均能够进行D抗原定量检测。结论 成功建立了检测sIPV疫苗D抗原含量的双抗体夹心ELI...     

O型口蹄疫病毒血清抗体竞争ELISA检测方法的建立及验证

目的建立O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)血清抗体的竞争ELISA检测方法,并进行验证。方法采用O型FMDV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)作为包被抗原,建立用于检测FMDV血清抗体的竞争ELISA方法。对方法的抗原包被浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μg/mL)、抗原包被温度及时间(4℃过夜、37℃1 h、37℃1.5 h、37℃2 h、37℃2.5 h、37℃3 h)、血清稀释度(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释)、HRP-IgG稀释度(1∶10000~1∶20000稀释)、封闭液种类(不封闭、1%BSA封闭、2%BSA封闭、5%脱脂乳封闭)、封闭液作用时间(30、60、90、120 min)、血清与HRP-IgG作用时间(30、60、90、120、150 min)、底物TMB作用时间(10、15、20、25、30 min)进行优化。同时验证方法的交叉反应、特异性及敏感性、精密性。采用建立的方法及O型FMDV抗体液相阻断ELISA检测试剂盒分别检测未知血清背景的138份猪和牛血清,计算两者的符合率。结果方法最适检测条件为:抗原包被浓度0.5μg/mL,抗原包被温度及时间为4℃过夜,血清稀释度为1∶4;HRP-IgG稀释度为1∶18000;封闭液为1%BSA,封闭液作用时间为30 min;HRP-IgG与血清作用时间为30 min;底物作用时间为10 min。21份不同猪病的阳性血清中,除3份O型FMD阳性血清为阳性外,其他血清样品为阴性,该方法无交叉反应;敏感性为90.4%,特异性为95.7%;批内和批间精密性试验变异系数(CV)均<10%。该方法与口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测结果的符合率为97%。结论建立的方法具有良好的特异性及精密性,且操作简便,可用于O型FMDV血清抗体的检测。     

戊型肝炎病毒重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒的制备

目的制备戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒。方法以4型HEV ORF2重组蛋白P179免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行克隆化培养,制备腹水,并对杂交瘤细胞进行染色体计数,鉴定单抗亚类及特异性、并检测稳定性;经SDS-PAGE分析抗体纯度,以兔抗179抗原多抗作为包被抗体,HRP标记P179单抗作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,制备试剂盒,并进行最佳线性范围测定、准确性、精密性和稳定性验证。结果获得4株能稳定分泌抗P179抗原单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3A10、3F8、4E9和5G6,腹水抗体效价分别为1∶10-7、1∶10-6、1∶10-6和1∶10-7,染色体数分别为96、98、101和99条;亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG1和IgG2b;4株单抗连续传代3个月,液氮冻存1年抗体效价未发生变化;制备的试剂盒有良好的线性(R2>0.950 0)、准确性、精密性,试验内变异系数为4.17%～6.26%,回收率在87.9%～114.8%之间,试验间变异系数为5.82%～8.01%,回收率在90.8%～108.9%之间;于37℃及4℃放置3 d,仍具有良好的稳定性。结论成功制备了戊型肝炎病毒P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒,可用于戊型肝炎疫苗生产中定量检测疫苗抗原。     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白受体结合活性检测方法的改进

目的对重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)-抗体融合蛋白的受体结合活性检测方法进行改进。方法采用夹心ELISA法对系列稀释的重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白供试品和参比品进行检测,通过四参数方程拟合,计算二者的半数有效浓度(EC50),分析其受体结合活性。对改进的方法进行精密性和准确性验证,并与原方法进行比较。结果重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白供试品和参比品均存在量效关系,符合四参数方程y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D;3批重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白经3次测定,受体结合活性分别为(133±8)、(114±4)和(138±9)BU,符合其质量标准中受体结合活性65～135 BU的规定,变异系数分别为6.02%、3.51%和6.52%;1批供试品经3次重复测定,回收率为(107.67±7.50)%;3批供试品采用原方法和改进方法分别重复测定3次,受体结合活性差异均无统计学意义(P>0.05)。结论改进的方法精密性好,准确性高,可作为重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白受体结合活性的常规检测方法。     

百日咳毒素兔多克隆抗体的制备及其ELISA定量检测方法的建立和验证

目的 制备百日咳毒素（pertussis toxin,PT）兔多克隆抗体（简称多抗）,建立定量检测PT抗原含量的双抗体夹心ELISA法,并进行验证及应用。方法 采用传统方法,用PT免疫青紫蓝兔制备PT兔多抗。优化ELISA系统反应条件,建立PT双抗体夹心ELISA定量检测方法,并进行特异性、线性、准确性、精密性、灵敏度验证。采用建立的方法对脱毒过程样品及其他百日咳抗原纯化过程样品菌毛蛋白（fimbriae proteins,FIM）原液中PT抗原含量进行检测。结果 PT抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的工作条件为PT兔多抗包被浓度为1μg/mL,酶标抗体稀释度为1∶8 000。此检测系统能与PT纯化蛋白发生特异性反应,而与百日咳丝状血凝素、白喉类毒素、破伤风类毒素均未发生交叉反应;建立的双抗体夹心ELISA法线性检测范围在25～400 ng/mL之间;PT高、中、低浓度回收率分别为103.27%、91.48%、103.52%;酶标板内和板间的变异系数（CV）均小于10%;该方法的灵敏度为20.719 ng/mL,检测下限为41.438 ng/mL。检测5种不同脱毒工艺条件下、不同取...     

肺炎链球菌表面抗原PsaA-PspA融合蛋白双抗夹心ELISA定量检测方法的建立及验证

目的建立快速测定肺炎链球菌表面抗原PsaA-PspA融合蛋白含量的双抗夹心ELISA方法,并进行验证。方法制备PsaA-PspA抗原,确定PsaA单抗和PsaA-PspA兔多抗的最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA方法。对方法的抗原特异性、精密性和准确性进行验证,并分析变性抗原对测定的影响。结果单抗和兔多抗最佳稀释倍数为1∶500和1∶10 000。建立的双抗夹心ELISA法检测PsaA-PspA抗原的浓度范围为70~560 ng/m L,R~2为0.993 8;该方法不适用于其他抗原的测定,但可用于鉴定抗原是否变性;该方法检测不同批次PsaA-PspA抗原的批内平均变异系数(CV)为4.9%,批间平均CV为19%,平均回收率为88.98%。结论建立的双抗夹心ELISA方法特异性、精密性和准确性良好,可用于PsaA-PspA融合蛋白浓度的检测,且可检测抗原是否变性。     

重组戊型肝炎病毒抗原ELISA检测方法的建立

目的建立重组戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于HE疫苗中HEV抗原含量的检测。方法以重组HEV病毒样颗粒作为免疫原,免疫母鸡,制备抗HEV-IgY多克隆抗体,纯化后作为包被抗体,HRP标记的抗HEV单克隆抗体作为检测抗体,建立HEV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对其进行验证。用建立的方法检测3批HE疫苗成品的HEV抗原含量,计算HEV抗原对氢氧化铝的吸附率。结果建立的ELISA方法线性范围为2～128 ng/ml,最低定量限为2 ng/ml;该方法检测冻干甲肝减毒活疫苗、重组人白介素-2(IL-2)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、人血白蛋白、小牛血清及健康人血清均无交叉反应;该方法检测3个浓度的HEV抗原内部参考品的回收率在95.13%～104.50%之间,试验内及试验间变异系数均<15%;包被抗HEV-IgY的酶标板于37℃放置5 d,其检测HEV抗原内部参考品的A450值及敏感性均未发生显著变化;3批HE疫苗成品中HEV抗原对氢氧化铝的吸附率均大于95%,符合相关质控要求。结论已成功建立了HEV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,可用于HEV抗原含量的检测。     

重组人抗TNFα单抗制品中CHO宿主细胞蛋白质残留夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立检测重组人抗TNFα单抗制品中CHO宿主细胞蛋白质(host cell protein,HCP)残留的夹心ELISA法,并进行验证。方法采用二维电泳-Western blot(2D-Western blot)法筛选兔抗CHO HCP多克隆抗体(产品号:AB000103-A、AB000103-C)及羊抗CHO HCP多克隆抗体(批号:3G-0016-PA)中识别重组人抗TNFα单抗特异性CHO HCP覆盖率最高的一种作为检测抗体,建立检测样品中残余HCP的夹心ELISA法,并验证方法的线性、基质干扰、稀释线性、灵敏度、精密度及准确性。结果以覆盖率达57%的AB000103-C号兔抗CHO HCP多克隆抗体作为检测抗体;样品基质干扰HCP检测,样品需稀释6倍;HCP标准品浓度在3. 33～810 ng/mL范围与A450值曲线拟合良好,R2=1,试验内及试验间精密性验证的CV均小于12%,检测限及定量限分别为2. 4和20 ng/mL;20、150及300 ng/mL的加标样品回收率分别为99. 5%、97. 1%及100. 3%。结论成功建立了重组人抗TNFα单抗HCP残留的夹心ELISA检测方法,该方法灵敏度高,准确性、精密性及线性良好,适用于重组人抗TNFα单抗制品的残留HCP检测。     

狂犬病病毒抗原定量检测方法的建立

目的建立狂犬病病毒抗原的定量检测方法,用于疫苗生产过程中病毒含量的监测。方法用狂犬病病毒aG株免疫豚鼠,制备抗狂犬病病毒多克隆抗体,纯化后以辣根过氧化物酶进行标记。采用双抗体夹心ELISA法建立检测系统。以狂犬病疫苗国家参考品为定量标准,建立剂量反应曲线,确定该方法的灵敏度,并对该方法的精密性、特异性和适用性进行验证。结果制备的多克隆抗体高峰效价为1∶105,纯化后的抗血清蛋白含量为6.45mg/ml。建立的ELISA方法对狂犬病病毒抗原的最低检出量为5.3mIU/ml,最佳定量区间为10～110mIU/ml,相关系数为0.9983,精密性和特异性较好。用该方法对狂犬病疫苗进行抗原定量,与NIH法测定的疫苗效力具有一定的相关性;检测市售的不同毒株和细胞系生产的狂犬病疫苗,其结果在2.4～9.9IU/ml之间。结论已建立了狂犬病病毒抗原的定量检测方法,可对来自不同毒株和不同细胞系的狂犬病疫苗进行快速定量检测,为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段。     

巨细胞病毒IgG定量ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)IgG定量ELISA检测方法,并进行初步应用。方法用CMV IgG(50 U/ml)标准品建立CMV IgG ELISA定量检测方法,确定该方法的最佳线性范围;制备室内质控血清并进行标定。对该方法进行重复性、中间精密性、准确性、特异性验证,并与Dia.Pro CMV IgG ELISA试剂盒进行比较。用建立的ELISA法检测689人份健康献浆员血浆的CMV IgG抗体效价。结果建立的CMV IgG定量ELISA检测方法的最佳线性范围为0.000 78～0.05 U/ml;制备的室内质控血清的抗体效价为(5.67±0.55)U/ml;重复性试验检测结果的变异系数为4.6%～9.8%,中间精密性试验检测结果的变异系数为9.7%～10.6%;该方法检测3个浓度标准品的回收率为107.01%～112.97%;样品稀释液和血清中的其他一些干扰因素对检测结果影响较小;该方法与Dia.Pro CMV IgG ELISA试剂盒检测血浆样品的相关系数r=0.81。该方法检测689人份健康献浆员血浆样品的CMV IgG抗体效价≥10 U/ml的占30.8%。结论建立的CMV IgG定量ELISA检测方法操作简便,精密性良好,特异性强,可用于人血浆中CMV IgG的定量检测。