抗C(IgM)血型定型试剂国家参考品的研制

目的研制抗C(IgM)血型定型试剂(单克隆抗体)效价测定用国家参考品。方法筛选抗C(IgM)杂交瘤细胞,获得培养上清液,根据效价进行稀释,经冻干为国家参考品。对其进行分装均匀性、冻干后的外观、水分、效价检测,并联合多家实验室进行协作标定,同时进行瓶间精密度及热稳定性检测。结果国家参考品为白色冻干粉末,复溶后外观为无色或淡黄色透明液体,平均水分含量为1.70%,分装瓶间均匀性良好。经协作标定,抗C血型定型试剂(单克隆抗体)对CC红细胞的效价为1∶16,对Cc红细胞的效价为1∶8。瓶间精密度效价检测结果均一致。参考品于37℃放置3、7、14 d后,与-20℃保存的参考品效价一致。结论成功制备了抗C(IgM)血型定型试剂(单克隆抗体)国家参考品,可用于抗C(IgM)血型定型试剂(单克隆抗体)效价检测的质量控制。     

国产单抗血型定型试剂质量研究

对国产抗A、抗B单抗血型试剂进行了质量、稳定性、与亚型细胞识别检定及临床应用。临床应用对象包括1岁及1岁以下婴儿、59及59岁以上老人、肿瘤患者及非肿瘤患者、健康献血员、少数民族人群。共414044人,正反定型及与人血清试剂相符率为99．998％。质量及临床应用结果表明,我国单抗血型定型试剂,已达到人血型定型试剂要求,可以取代人血清型试剂推广应用。     

炭疽噬菌体国家参考品的研制

目的研制炭疽鉴别试验及炭疽活疫苗纯菌检查用炭疽噬菌体国家参考品。方法制备炭疽噬菌体参考品,建立噬菌体参考品效价质量标准,组织4个实验室对该参考品进行协作验证,并对参考品稳定性进行分析。结果研制的炭疽噬菌体国家参考品,其效价质量标准应不低于1.0×108PFU/ml;经协作验证,该参考品可有效鉴别3批炭疽活疫苗;该参考品在4℃条件下稳定性较好,37℃稳定性较差。结论研制的炭疽噬菌体国家参考品已被国家有关部门正式批准,可用于炭疽鉴别试验及炭疽活疫苗纯菌检查。     

梅毒非特异性抗体检测试剂国家参考品的研制

目的建立梅毒非特异性抗体检测试剂国家参考品。方法通过对84份血浆的复核、确证,组建梅毒非特异性抗体检测试剂国家参考品,并将3份效价检测用参考品溯源至国际标准品,经5家实验室的协助标定,确定参考品的质量标准,并对参考品进行均匀性及稳定性评估。结果梅毒非特异性抗体检测试剂国家参考品由25份阴性及25份阳性样品组成,3份效价检测用参考品的效价定值分别为12、10和5 IU/mL。协助标定确证25份阴性参考品均为阴性,25份阳性参考品均为阳性,效价参考品的效价检测值均≤0. 625 IU/mL。参考品的均匀性及稳定性均符合要求。结论研制的参考品可作为梅毒非特异性抗体检测试剂的质量控制和评价使用。     

梅毒螺旋体抗体快检试剂国家参考品的研制

目的建立梅毒螺旋体(Treponema pallidum,TP)抗体快检试剂国家参考品,确定其质量标准。方法通过对134批TP血浆的复核、确证,组建TP抗体快检试剂国家参考品,经多家实验室协助标定,确定参考品的质量标准,并对参考品进行均匀性及稳定性评估。结果 TP抗体快检试剂国家参考品由20份阴性、10份阳性、3份最低检出限及1份重复性样品组成。质量标准为20份阴性参考品中应至少18份为阴性,10份阳性参考品中应至少9份为阳性,最低检出限参考品中应至少1份为阳性,且稀释用血浆应为阴性,重复性参考品检测10次,应均为TP抗体阳性,其颜色反应应一致。参考品的均匀性及稳定性均符合国家参考品标准。结论研制的参考品可作为TP抗体快检试剂的质量控制及评价使用。     

HIV抗体国家参考品(胶体金类试剂)的建立及其应用

目的建立HIV抗体国家参考品(胶体金类试剂)并对其应用效果进行分析。方法通过对阳性和阴性样品的筛选,确定候选参考品的组成,经标定,确定参考品的质量标准,并以此为标准对试剂的质量进行检测和评估。结果参考品由20份阳性、20份阴性、3份最低检测限和1份精密性样品组成。质量标准为20份阳性样品,应均为阳性,20份阴性样品中应至少18份为阴性,最低检测限样品应至少1份为阳性,且稀释用血浆应为阴性,精密度样品检测10次,其颜色反应一致。共检测进口注册、国内注册以及常规检定样品189批,其中进口注册样品合格率为81.8%,国内注册样品合格率为80.8%,常规检定样品合格率为96.2%。结论该参考品可反映试剂的质量水平,对保证试剂的质量具有重要作用。     

第3代丙肝试剂国家参考品的研制及初步应用

筛选全国 14个省、市、自治区的 2 5 0 0 0多份血样 ,取其中 2 6 4份用国产 14种抗HCVEIA试剂 ,国外 2种第 3代抗HCVEIA试剂复检 ,用RIBAHCV 3.0和PCR试剂确证。经两轮会同标定 ,国外两个实验室复核 ,确定40份阳性、40份阴性样品组成第 3代丙肝试剂国家参考品。 40份阴性样品中包括国内外几十种试剂曾经出现过非特异假阳性反应的阴性样品以及其S C值较高的阴性样品。 40份阳性样品中 ,6 5 %为弱阳性样品 ,有的样品含有全谱的抗HCV抗体 ,有的样品含有某几种抗HCV抗体 ,有的样品以抗HCV某种蛋白抗体成分为主 ,还有的样品只含有某种特定的抗HCV蛋白抗体。该参考品已通过专家鉴定并经卫生部批准使用。经改进后达到第 3代参考品标准的国产试剂的临床考核说明 ,该参考品促进了国产试剂质量的提高 ,并达到国际先进水平。     

单克隆抗体RhD血型定型试剂质量要求及临床应用要点

本文结合目前我国临床安全输血和新生儿溶血病诊断、预防以及人群血型普查等工作的需要,对临床常规应用的单克隆抗-D人血型定型试剂(单克隆抗体)的质量要求和应用要点提出了具体的意见。     

HIV-1核酸血筛试剂国家参考品的研制

目的研制HIV-1RNA血筛试剂国家参考品。方法收集HIV-1病毒培养物、我国不同地区的HIV-1感染者血浆以及正常人样品,经HIV-1病毒载量试剂检测,对HIV-1RNA阳性的样品进行env基因型分析,从中筛选参考品的候选样品。结果共筛选8份HIV-1RNA阳性的样品作为阳性参考品,病毒载量均高于5000IU/ml;8份HIV、HBV、HCV均为阴性的血浆样品作为阴性参考品;以1份病毒培养样品作为灵敏度参考品的原始样品,经WHOHIV-1RNA标准品标定,其HIV-1病毒载量为3.79×104IU/ml;反复3次冻融对参考品的病毒载量无明显影响。结论已制备HIV-1RNA血筛试剂国家参考品,为我国HIV-1核酸血筛试剂的质量控制和标准化提供了依据。     

水痘带状疱疹病毒IgG抗体检测试剂国家参考品的研制

目的制备水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)IgG抗体检测试剂的国家参考品。方法利用国内外5个厂家ELISA试剂和膜抗原免疫荧光抗体检测(fluorescent-antibody-to-membrane-antibody,FAMA)试验,对候选样本进行筛选,确定水痘检测试剂国家参考盘;利用VZV WHO免疫球蛋白标准品对检测限参考品进行标定,通过不同厂家的协作标定最终确定国家参考品的质量标准,并对其稳定性和均匀性进行考察。结果参考品由8支阴性参考品、10支阳性参考品、1份重复性参考品和6支检测限参考品组成。质量标准为:阴性参考品符合率至少为7/8;阳性参考品符合率至少为9/10;检测限的浓度不高于127 mIU/ml;重复检测重复性参考品10次,其A值的变异系数不高于15.0%。该参考盘存放于不同条件下,相对稳定且均一性较好。结论成功建立了1套用于评价VZV IgG抗体检测试剂盒国家参考品。     

用于血型鉴定的国产微柱凝胶卡抗体试剂的选择

目的筛选特异性强、效价高、亲和力高的用于血型鉴定的国产微柱凝胶卡抗A、抗B及抗D抗体试剂。方法按《中国生物制品规程》2000版中《抗A、抗B血型定型试剂(单克隆抗体)制造及检定规程》的要求,对4家公司的抗A、抗B及抗D抗体试剂进行特异性、效价、亲和力检测。结果 3批抗A、抗B单克隆抗体试剂及3批抗D抗体试剂的特异性、效价和亲和力检测结果均符合《中国生物制品规程》2000版中《抗A、抗B血型定型试剂(单克隆抗体)制造及检定规程》的要求,选择成本相对较低的上海血液生物医药有限责任公司生产的抗A、抗B试剂和英国Millpore公司亲和力更好、效价更高的抗D抗体试剂,用于制备国产微柱凝胶卡。结论 3批抗A、抗B、抗D单克隆抗体试剂均合格,已选择更优的试剂用于制备国产微柱凝胶卡。     

第6套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品的研制

目的研制第6套丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗体诊断试剂国家参考品。方法从我国10省市血站及生物制品企业的供血员中筛选候选参考品血浆样本304份,采用国内外27种检测试剂进行HCV Ag、HCV Ab及HCV RNA检测后,应用CHIRON公司的RIBA HCV 3.0 SIA及MP公司HCV BLOT 3.0试剂进行确证检测;利用Abbott Real Time HCV GenotypeⅡ试剂,对HCV RNA阳性样本进行HCV基因型别检测,并以核苷酸序列测定方法对分型样本进行确认。通过分析上述检测数据,从中拟选出协作标定样本,邀请国内外生产或市场使用占较大份额的11个实验室参加该套参考品标定。取最低检出限参考品4份,分别于4、25和-20℃放置1、3、5、7、9和11 d,或置-70℃反复冻融1~6次,进行稳定性试验。结果选出65份样品组成第6套HCV抗体诊断试剂国家参考品,其中包括阴性参考品30份,阳性参考品30份,最低检出限参考品4份,精密性参考品1份。应用11家的16种HCV抗体试剂分别平行3次标定检测,阴、阳性参考品符合率均≥29/30;最低检出限参考品检测L1~L3均为阳性,L4为阴性;精密性参考品检测CV在1%~11%之间。不同温度保存11 d及-70℃保存反复冻融6次的检测结果均符合要求(P0.05)。结论建立了应用于血液筛查丙型肝炎病毒抗体试剂质量控制的第6套HCV抗体国家参考品。     

人巨细胞病毒IgM抗体生物素-亲和素单克隆抗体捕获时间分辨荧光免疫法检测试剂盒的研制与评价

目的建立人巨细胞病毒IgM(human cytomegalovirus IgM,HCMV IgM)抗体生物素-亲和素单克隆抗体捕获时间分辨荧光免疫法(biotin-avidin monoclonal antibody capture time-resolved fluoroimmunoassay,BA Mac TrFIA)检测试剂盒,并对其性能进行评价。方法采用鼠抗IgMμ链单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)作为固相反应板的包被抗体,生物素(biotin)标记的HCMV基因重组抗原作为桥接抗原,链酶亲和素(SA)标记铕(Eu3+)作为示踪物,配制以β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分的增强液,应用BA Mac TrFIA法进行HCMV IgM抗体的检测,对连续制备的3批试剂盒的最低检测限、重复性、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、热稳定性进行评价,并与巨细胞病毒IgM抗体诊断试剂盒同时对1 020份血清或血浆样本进行临床研究比对试验,采用Kappa检验进行一致性分析。结果选择4μg/ml作为鼠抗IgMμ链McAb最佳包被浓度,1∶10 000稀释作为HCMV-Bio最佳工作浓度,1∶1 500稀释作为SA-Eu3+最佳工作浓度,试剂盒参考值建议为阴性对照品检测荧光值(negative control counter,NCx)×2.1;连续制备的3批试剂盒最低检测限、重复性、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率均达到国家检定标准;于37℃恒温箱放置6 d后,检测性能无明显改变;临床研究比对试验Kappa指数为1,一致程度达100%。结论成功制备了HCMV IgM BA Mac TrFIA法检测试剂盒,该试剂盒灵敏度高,精密性较好,与同类产品检测结果相关性好,为临床HCMV lgM抗体的检测提供科学、可靠的诊断依据。     

ABO血型反定型试剂质控方法和质量标准的建立

目的建立ABO血型反定型试剂的质控方法和质量标准。方法用抗P、抗M、抗N、抗C、抗c、抗E、抗e试剂检测O型血浆样本,选择分别与抗P、抗M、抗C、抗e试剂反应呈■强阳性样本,和与抗P、抗N、抗c、抗E试剂反应呈■强阳性样本各2份,配制ABO血型反定型用O型细胞。分别对两个厂家提供的和自制的ABO血型反定型用O型细胞进行抗原性检测,同时进行外观、特异性、ABH抗原性、亲和力、溶血率、稳定性检测,并检测35份含IgM类不规则抗体的阳性血浆样本,对比检出率。结果自制的ABO血型反定型用O型细胞与抗P、抗M、抗N、抗C、抗c、抗E、抗e试剂反应均呈■以上,而其他两个厂家提供的ABO血型反定型试剂均有部分抗体漏检;外观、特异性、ABH抗原性、亲和力、溶血率、稳定性检测均无明显差异,符合相关要求;自制的ABO血型反定型用O型细胞可检出所有IgM类不规则抗体,无漏检,而其他两个厂家提供的ABO血型反定型试剂均有部分血浆样本漏检。结论本研究建立的质控方法和质量标准适用于IgM类不规则抗体的检出。     

人脲原体核酸检测试剂盒国家参考品的制备

目的制备人脲原体核酸检测试剂盒国家参考品。方法培养人脲原体两大生物群14个标准血清型菌株,培养液灭活后经颜色改变单位(color change unit,CCU)法与PCR相结合的方法进行定值,组成能覆盖脲原体所有表型及基因型的14份阳性参考品P1-P14(浓度为106 CCU/ml)及14份检测限参考品L1-L14(浓度为104 CCU/ml);选择6份能排除脲原体核酸检测试剂盒非特异性或交叉反应的样品组成阴性参考品N1-N6;选择生物群1的微小脲原体(ureaplasma parvum,UP)1和UP14作为重复性参考品R1、R2(浓度分别为105和104 CCU/ml)。用5家公司生产的脲原体核酸检测试剂盒对参考品进行验证,确定准确性、特异性、检测限、重复性、稀释线性的性能指标;并考察参考品在不同条件下(2~8℃放置7 d,37℃放置3、7、12 d,-20℃及常温反复冻融5次)的稳定性。结果支原体各培养液经CCU法测定,浓度均在106~107 CCU/ml之间,以CCU法测定浓度为靶值,绝对偏差均在±0.5个数量级以内。4家公司生产的不同试剂盒检测参考品,在准确性、特异性、检测限及重复性上均符合要求;在稀释线性上,最低稀释浓度为102 CCU/ml的样品只有2家可以检出,其他几家的稀释线性相关系数以103~106 4个浓度计算,r值均0.990 0;1家(RNA检测)检测R2的重复性,CV为5.5%。经不同条件处理的参考品的稳定性有轻微变化,但均处于设定的可接受范围内。结论制备了人脲原体核酸检测试剂盒国家参考品,该参考品可满足人脲原体核酸分型、定性及定量检测要求,经多家实验室进行验证,可用于国内大多数试剂盒的性能评价及临床实验室质量评价。     

用于单克隆抗体纯化的仿生多肽超大孔PGMA微球制备及其性能

以仿生多肽配基FYEILHC为亲和配基、以葡聚糖修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯[Dextran-poly(glycidyl methacrylate), Dextran-PGMA]超大孔微球为基质，制备用于单克隆抗体纯化的仿生多肽超大孔PGMA微球，在环氧氯丙烷中滴加2 mol/LNaOH使其表面衍生出环氧基，在表面修饰FYEILHC；用扫描电镜表征微球表面形貌，用AKTA蛋白纯化系统考察了Dextran-PGMA微球和琼脂糖微球对抗体的动态吸附量随线性流速的变化。结果表明，偶联FYEILHC后Dextran-PGMA微球仍能保持其大孔结构，在923 cm/h线性流速下，其对抗体的动态吸附量仅下降约8%，而琼脂糖微球的动态吸附量则迅速下降25%。表明在较高流速下，抗体在Dextran-PGMA微球上的传质性能较好。吸附?用0.1 mol/L NaOH原位清洗重复40次后，Dextran-PGMA微球对抗体的动态吸附量约为(21?1) mg/mL，表明微球具有良好的化学稳定性；血清中回收的抗体纯度为95.0%，表明仿生多肽亲和介质具有从复杂生物样品中纯化抗体的巨大潜力，可满足高流速、高通量抗体分离纯化需求。