开封农村地区婴幼儿中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型中和抗体水平及流行趋势

目的了解开封农村地区婴幼儿中肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)中和抗体水平及流行趋势。方法应用微量细胞病变法,对2004年开封农村地区采集的349名7～30月龄婴幼儿血清进行EV71和CA16中和抗体检测。结果7～30月龄婴幼儿EV71和CA16中和抗体阳性率分别为36.7%(128/349)和36.5%(123/337),但二者流行趋势不同。EV71抗体阳性率由10～12月龄组的18.2%上升至25～30月龄组的81.3%,上升约4.5倍,抗体几何平均滴度(GMTs)也缓慢上升;CA16抗体阳性率由13～15月龄组的23.0%上升至22～24月龄组的47.6%,上升约2.1倍,GMTs在125～338之间波动;不同月龄婴幼儿中存在EV71和CA16混合感染的情况,19～24和25～30月龄组的EV71和CA16混合感染率显著高于7～12和13～18月龄组。结论开封农村地区婴幼儿中EV71和CA16中和抗体阳性率高,但二者上升的趋势不同,18月龄后的婴幼儿中EV71和CA16混合感染的比例显著升高。     

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)VP1蛋白,并检测其免疫原性。方法通过RT-PCR法从CA16病毒青岛株中扩增VP1基因,克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET43.1a-VP1,转化感受态E.coli Rossatte(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组CA16 VP1蛋白通过Ni柱亲和层析纯化后,采用不同剂量(5、10、20、40μg)免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价,微量细胞病变抑制法检测血清中和抗体效价。结果重组表达质粒pET43.1a-VP1经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组CA16 VP1蛋白相对分子质量约为34 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%;纯化的重组CA16 VP1蛋白纯度可达95%以上,可与猴CA16抗血清反应;不同剂量的重组CA16 VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导产生CA16特异性抗体,血清中总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价均明显高于对照组,且抗体效价与免疫剂量存在一定的量效关系;各剂量CA16 VP1组免疫小鼠血清中和抗体效价均小于1∶8。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CA16 VP1蛋白,纯化的重组蛋白可诱导小鼠特异性体液免疫应答,为进一步研究CA16的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。     

2015年山东省烟台地区柯萨奇病毒A组16型VP1区基因特征分析

目的研究2015年山东省烟台地区手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)的病原谱,并分析病原谱中柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)流行株的进化及VP1区重要氨基酸位点的变异情况。方法采用实时荧光逆转录聚合酶链反应方法,对2015年烟台地区采集于HFMD患者的696份样品进行肠道病毒(enterovirus,EV)核酸检测和分子定型。根据EV的优势血清型,选取10株CV-A16扩增VP1区,并进行核苷酸序列及系统发育分析。结果从696份标本中检出EV 412株,其中101株为CV-A16,76株为EV-A71型。10株CV-A16的核苷酸序列相似性为88.4%~99.9%,氨基酸序列相似性为98.6%~100%。10株CV-A16烟台株分别属于B基因型的B1a和B1b进化分支,其中B1b进化分支为优势株。与参考株Tainan/5079/98(AF177911)相比,10株CVA16分离株氨基酸序列的第11、23、99、145、289位氨基酸出现突变,10株分离株的这些位点也有不同,表明烟台地区的CV-A16有其独特的突变位点。结论 CV-A16是引起2015年烟台地区HFMD发病的常见病原体,本次分离到的CV-A16均属于B基因型的Bla和B1b进化分支。     

柯萨奇病毒A16型疫苗的研究进展

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是由肠道病毒引起的传染病,柯萨奇病毒A16型(Coxsackie-virus type A 16,CA16)和肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引发HFMD流行和暴发的主要病原菌.HFMD在5岁以下的儿童中可引起口腔疼痛...     

柯萨奇病毒A组16型cDNA感染性克隆的构建

目的构建柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)c DNA感染性克隆。方法提取CA16基因组RNA,经RT-PCR得到基因组全长c DNA,插入至TOPO-XL-PCR载体,获得CA16全长c DNA克隆。采用T7聚合酶系统将线性基因组c DNA体外转录出病毒基因组RNA,纯化后转染Vero细胞,获得拯救病毒。通过RT-PCR、基因测序及免疫荧光法对拯救病毒进行鉴定,并对拯救病毒与母本病毒的增殖特性进行比较。结果病毒基因组RNA转染Vero细胞后48 h,可见典型的肠道病毒致细胞病变。拯救病毒经RT-PCR、基因测序和免疫荧光鉴定为CA16,且与母本野生型病毒增殖特性基本一致。结论成功构建了具有感染性的CA16全长c DNA克隆,为研究CA16基因功能和研发CA16新型疫苗奠定了基础。     

柯萨奇病毒A组16型疫苗的研发进展

柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)是引起手足口病(hand,foot and mouth desease,HFMD)的主要病原体之一。研发CA16疫苗对控制HFMD流行具有重要意义。本文探讨了CA16疫苗研发的必要性和可行性,并对CA16疫苗中和抗体检测方法、动物模型、重组病毒样颗粒(recombinant virus-like particles,rVLPs)疫苗及灭活疫苗等相关的研发进展作一综述。     

柯萨奇病毒A组16型临床分离株的生物学特性分析

目的对引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的重要病原体柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus group A type16,CA16)临床分离株的生物学特性进行分析,为后续的疫苗研发奠定基础。方法从昆明地区HFMD临床疑似患者178份咽拭子及粪便标本中分离并鉴定CA16毒株,并对病毒的生长特性、蚀斑形态以及对乳鼠的致病性等生物学特性进行分析。结果共分离出7株CA16病毒:KM1、KM15、KM154、KM165、KM168、KM263、KM881,均属于B1亚型;病毒在Vero细胞上增殖较快,多数毒株4~6 d即可达到增殖高峰,但感染性滴度差别较大,最低为4.75 lgCCID50/ml,而最高可达7.78 lgCCID50/ml;各毒株在Vero细胞上培养相同时间形成的蚀斑形态不同,其中KM15、KM154、KM168蚀斑呈圆形,针尖样大小,边缘较清晰,KM1、KM881、KM263、KM165蚀斑较大,不规则,边缘较模糊;各毒株毒力均较强,经乳鼠颅内注射后,乳鼠均于3~6 d陆续开始发病,除KM168、KM154、KM15组乳鼠为不同程度的发病及死亡外,其他组乳鼠发病率及病毒致死性死亡率均达100%;各毒株对乳鼠的脑、心肌、肺、肌肉、脊髓和肝脏等组织均有不同程度的损伤,其中损伤较严重的组织为脑和肌肉。结论分离的CA16毒株对Vero细胞均具有良好的适应性,蚀斑清晰,毒力较强,且多数毒株感染性滴度较高,可用于CA16病毒致病机理的研究及疫苗的研发。     

柯萨奇病毒A组16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性

目的应用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),通过条件优化,提高VLP的表达量,纯化后检测其免疫原性。方法对CVA16结构蛋白基因P1及蛋白酶基因3CD进行密码子优化,插入启动子P10改造为CMV的重组杆状病毒表达载体p Fast Bac Dual-CMV中,获得重组穿梭质粒p Fast Bac Dual-CMV-P1-3CD,转化DH10 Bac TM Competent Cells,提取重组杆粒Bacmid-CMVP1-3CD,转染Sf9细胞,组装成重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD,并进行扩增,采用间接免疫荧光法、Western blot法及透射电镜观察对表达产物进行初步鉴定。对重组CVA16 VLP的表达条件(病毒接种MOI值、感染时间及细胞培养方式)进行优化后,通过20%蔗糖垫层及氯化铯连续密度梯度离心法纯化CVA16VLP,并通过腹部皮下注射免疫ICR小鼠3次,采用间接ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体滴度,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度。结果重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD经PCR及测序鉴定证实组装成功;重组CVA16 VLP在Sf9细胞中成功表达,优化的表达条件为:重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD按MOI=5接种,Sf9细胞采用悬浮培养方式悬浮培养96 h,收集细胞及培养上清;纯化的CVA16 VLP纯度可达90%以上,针对VP2的单克隆抗体能与VP0及VP2发生特异性反应,电镜下可见大量形态规则的类球形VLP,直径约为27 nm;纯化的CVA16 VLP免疫ICR小鼠后,诱导机体产生的特异性血清Ig G滴度可达1∶105,中和抗体滴度达1∶358。结论应用杆状病毒表达系统成功表达了CVA16的P1和3CD蛋白,并组装形成完整的VLP;通过质粒启动子的改造及表达条件的优化,有效提高了CVA16 VLP的表达量;纯化的CVA16 VLP可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,为CVA16亚单位疫苗的研究提供了参考。     

柯萨奇病毒A组16型中和抗体检测方法的实验室评价

目的评价柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)中和抗体检测方法于不同实验室内和实验室间的可重复性。方法参照WHO脊髓灰质炎病毒中和抗体检测方法,建立CA16中和抗体检测方法和实验标准;收集22份血清样品,对CA16 A基因型毒株G10及B基因型毒株W190、33、203、P11和CS02毒株独立进行CA16中和抗体有效检测实验,评价所建立的检测方法于A~G实验室内和实验室间的可重复性;分别于A、B、C、D和E实验室比较G10毒株与W190、33、203、P11和CS02毒株对CA16中和抗体检测结果的影响。结果在各实验室内,有17/22份血清样品的变异系数(variable coefficient,CV)在0~11.4%之间,表明该检测方法在同一实验室内具有较好的可重复性;在实验室间,除3份低效价血清和1份效价过高血清外,其余血清样品的几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)最大差异倍数均在3.0倍以内,实验室间检测差异在可接受范围内;W190、33、203、P11和CS02毒株与G10毒株检测结果趋势相近。在同一实验室内,W190和33毒株与G10毒株的检测结果差异无统计学意义;203、P11和CS02毒株的检测结果均低于G10毒株,差异有统计学意义,表明B基因型毒株与A基因型毒株生物学活性存在一定差异。结论以G10毒株检测CA16中和抗体的方法在各协作实验室可得到良好应用,有利于CA16中和抗体检测的标准化,但适用性需进一步评估和验证。     

33株柯萨奇病毒A组16型分离株的全基因序列分析

目的对2008～2010年北京和青岛地区流行的33株柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)分离株的全基因序列进行分析。方法收集2008～2010年北京和青岛地区CA16感染患者咽拭子标本,采用Vero细胞对病毒进行分离,并经噬斑纯化。提取病毒RNA,采用RT-PCR法分段扩增CA16全长基因,经序列测定和拼接后,利用DNAStar和MEGA5.10软件分析全基因序列。结果经病毒分离和噬斑纯化,共获得33株CA16分离株;33个分离株之间的核苷酸序列同源性大于90.9%,与CA16国际标准株G10各区段的核苷酸序列同源性为72.7%～89.0%,氨基酸序列同源性为79.3%～100.0%;与近年中国分离的CA16 SZ/HK08-7株同源性较高,全基因组同源性大于91.5%,各区段核苷酸序列同源性均大于83.7%;在基于VP1序列的种系进化树中,BJWG16、BJWG17、BJWG20等23个分离株属于C1亚型,其余10个分离株属于C3亚型。结论 2008～2010年北京和青岛地区流行的33株CA16分离株均为C基因型。本研究对我国CA16分子流行病学、毒力位点的研究以及疫苗株的选择具有重要意义。     

肠道病毒71型感染患儿外周血自然杀伤细胞比例、亚群、表面受体及免疫效应分子的变化

目的探讨肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染患儿外周血中自然杀伤(Natural killer,NK)细胞比例、亚群、表面受体及免疫效应分子的变化。方法将EV71阳性的急性期患儿按疾病严重程度分为重症病例组和普通病例组,同时设健康对照组。提取各组患儿外周血,采用流式细胞术检测外周血中NK细胞比例、NK细胞亚群、自然细胞毒受体NKp30和NKp46、激活性受体NKG2D、抑制性受体CD94和NKG2A、脱颗粒标记CD107a及免疫效应分子(PF、GrB和GNLY)阳性细胞所占NK细胞的比例。结果重症病例组患儿外周血NK细胞比例较健康对照组明显减少(P<0.01),普通病例组CD16+NK细胞亚群比例较健康对照组升高(P<0.05),重症病例组较普通病例组低,但差异无统计学意义(P>0.05);重症病例组和普通病例组NKG2D阳性细胞百分率均较健康对照组低(P<0.01),而CD94和NKG2A阳性细胞百分率均较健康对照组明显升高(P<0.01),NKp30和NKp46阳性细胞率3组之间差异无统计学意义(P>0.05);重症病例组和普通病例组CD107a、PF、GrB、GNLY的阳性细胞百分率均较健康对照组明显降低(P<0.01或P<0.05)。结论 EV71感染可能抑制宿主NK细胞的增殖、激活及其杀伤功能。重症病例组与普通病例组比较,NK细胞比例和CD16+NK细胞亚群降低,抑制性受体CD94表达增高,胞浆内CD107a、GrB和PF表达显著降低,可能与重症病例的发生有关。     

MF59佐剂对肠道病毒71型灭活疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响

目的探讨MF59佐剂对肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将ICR小鼠随机分成10组:MF59佐剂+不同含量EV71灭活抗原(50 EU、100 EU)组、Al(OH)3佐剂0.5 mg+不同含量EV71灭活抗原(50 EU、100 EU)组和PBS阴性对照组,每组10只,分别经小鼠后肢肌肉和腹腔注射,200μl/只,共免疫2次,间隔4周(0、28 d)。分别于初免和加强免疫后28 d,采集小鼠尾静脉血,分离血清,采用微量中和试验法检测小鼠血清抗体水平。结果除阴性对照组外,各组小鼠血清抗体阳转率及中和抗体GMT值均随免疫剂量和免疫时间的延长呈升高趋势。初免后28 d,抗原含量为50 EU(低剂量)和100 EU(高剂量)各组中和抗体GMT均较低,组间差异均无统计学意义(P0.05)。加强免疫后28 d,低剂量各组小鼠血清中和抗体GMT与初免比较均略有升高(P0.05);高剂量各组小鼠血清中和抗体GMT与初免比较均明显升高,其中MF59佐剂肌肉注射组血清中和抗体GMT值最高(274.40),显著高于铝佐剂肌肉注射组(P0.05)。结论 MF59佐剂可显著增强EV71灭活疫苗诱导小鼠的体液免疫应答。     

氢氧化铝佐剂对肠道病毒71型灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的影响

目的评价氢氧化铝佐剂对肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的影响。方法用含铝佐剂及无佐剂EV71灭活疫苗免疫BALB/c小鼠,并设生理盐水对照组。于加强免疫后7 d采血,进行小鼠脾单个核细胞(Mononuclear cell,MNC)的分离及CD8+T细胞的去除,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测经EV71疫苗原液或VP2-36刺激后的小鼠脾MNC分泌IFNγ水平;应用液相芯片技术(LUMINEX)检测经EV71疫苗原液刺激后的小鼠脾MNC分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10水平;采用体外微量中和试验法检测小鼠血清中和抗体效价。结果 BALB/c小鼠经2次免疫后,铝佐剂疫苗组小鼠脾MNC的IFNγSFC值显著高于无佐剂疫苗组(P均<0.05);铝佐剂疫苗组分泌IL-6和IL-10水平显著高于无佐剂疫苗组(P均<0.05);铝佐剂与无佐剂疫苗组小鼠血清EV71中和抗体阳转率均达到100%,铝佐剂疫苗组诱导的中和抗体效价显著高于无佐剂疫苗组(P<0.01)。结论 EV71灭活疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性IFNγ、IL-2、IL-6和IL-10应答,铝佐剂可同时增强EV71灭活疫苗的Th1和Th2类免疫应答。     

Glutathione-S-transferase M1 regulation of diesel exhaust particle-induced pro-inflammatory mediator expression in normal human bronchial epithelial cells

ABSTRACT: BACKGROUND: Diesel exhaust particles (DEP) contribute substantially to ambient particulate matter (PM) air pollution in urban areas. Inhalation of PM has been associated with increased incidence of lung disease in susceptible populations. We have demonstrated that the glutathione Stransferase M1 (GSTM1) null genotype could aggravate DEP-induced airway inflammation in human subjects. Given the critical role airway epithelial cells play in the pathogenesis of airway inflammation, we established the GSTM1 deficiency condition in primary bronchial epithelial cells from human volunteers with GSTM1 sufficient genotype (GSTM1+) using GSTM1 shRNA to determine whether GSTM1 deficiency could exaggerate DEP-induced expression of interleukin-8 (IL-8) and IL-1beta proteins. Furthermore, the mechanisms underlying GSTM1 regulation of DEP-induced IL-8 and IL-1beta expression were also investigated. METHODS: IL-8 and IL-1beta protein levels were measured using enzyme-linked immunosorbent assay. GSTM1 deficiency in primary human bronchial epithelial cells was achieved using lentiviral GSTM1 shRNA particles and verified using real-time polymerase chain reaction and immunoblotting. Intracellular reactive oxygen species (ROS) production was evaluated using flow cytometry. Phosphorylation of protein kinases was detected using immunoblotting. RESULTS: Exposure of primary human bronchial epithelial cells (GSTM1+) to 25-100 mug/ml DEP for 24 h significantly increased IL-8 and IL-1beta protein expression. Knockdown of GSTM1 in these cells further elevated DEP-induced IL-8 and IL-1beta expression, implying that GSTM1 deficiency aggravated DEP-induced pro-inflammatory response. DEP stimulation induced the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) and Akt, the downstream kinase of phosphoinositide 3-kinase (PI3K), in GSTM1+ bronchial epithelial cells. Pharmacological inhibition of ERK kinase and PI3K activity blocked DEP-induced IL-8 and IL-1beta expression. DEP-induced ERK and Akt phosphorylation could be increased by GSTM1 knockdown. In addition, pretreatment of HBEC with the antioxidant N-acetyl cysteine significantly inhibited DEP-induced ERK and Akt phosphorylation, and subsequent IL-8 and IL-beta expression. CONCLUSION: GSTM1 regulates DEP-induced IL-8 and IL-1beta expression in primary human bronchial epithelial cells by modulation of ROS, ERK and Akt signaling.     

肠道病毒71型2A、3C、3D蛋白的研究进展

肠道病毒71型(Enterovirus type 71,EV71)感染是引起神经系统紊乱、肺水肿、肺出血等严重疾病的主要原因。非结构蛋白2A、3C、3D是EV71在宿主细胞内完成复制和存活的基础,具有不同于肠道病毒其他成员的结构和作用机制。2A和3C蛋白可抑制宿主细胞蛋白的表达,从而促进细胞凋亡,3C蛋白还可抑制天然免疫,3D蛋白与病毒的耐高温和高度变异适应性有关。一些小分子物质可在病毒入侵的不同阶段抑制EV71感染。本文就2A、3C、3D蛋白在EV71复制过程中的结构与功能特点以及一些小分子物质在病毒复制中的抑制作用作一综述。     

肺炎链球菌dnaJ基因缺陷对小鼠肺炎感染模型天然免疫应答的影响

目的探讨肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)dnaJ基因缺陷对肺炎感染模型小鼠天然免疫应答的影响。方法将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、D39感染组和△dnaJ感染组,分别经鼻腔滴注30μl无菌PBS、30μl含2×107cfu的S.pn D39和△dnaJ(dnaJ基因缺陷株)菌液,复制小鼠肺炎感染模型。于感染后6、12、24、36和48 h处死小鼠,取肺组织,匀浆后分离上清,ELISA检测促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFNγ的表达水平,HE染色观察感染12 h的小鼠肺组织炎症反应变化;将小鼠巨噬细胞株RAW264.7体外感染S.pn D39和△dnaJ,细菌与细胞的比例为100∶1,感染1、2、3 h后分离细胞培养上清液,ELISA检测TNF-α和IL-6的表达水平。实时定量PCR和Western blot分别检测感染12 h的小鼠肺组织中模式识别受体TLRs基因mRNA的转录水平和炎症相关信号p38MAPK的磷酸化水平。结果与D39感染组相比,△dnaJ感染组小鼠肺组织炎症反应强度下降,TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎因子水平达峰时间延迟,且峰值降低,RAW264.7细胞感染3 h分泌TNF-α和IL-6显著减少(P<0.01或P<0.05);小鼠肺组织Tlr2和Tlr13基因mRNA转录水平显著降低(P<0.05),p38MAPK的磷酸化水平也明显下降。结论肺炎链球菌dnaJ基因缺陷可下调肺炎感染模型小鼠的炎症反应、促炎因子分泌及胞内信号分子的激活,也可影响小鼠感染后肺组织中Trl2和Tlr13基因mRNA的表达,为进一步研究机体对肺炎链球菌DnaJ蛋白的天然免疫应答分子机制奠定了基础。     

腺病毒介导的slit2 shRNA对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响

目的观察腺病毒介导的slit2 shRNA对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响,探讨slit2在脉络膜新生血管(chorodal neovascularation,CNV)中的可能作用,为CNV的治疗提供新的思路。方法分别采用RT-PCR和免疫组化法检测人视网膜色素上皮-19(ARPE-19)细胞中slit2及受体Robo1基因mRNA的转录和蛋白的表达;用200μmol/L氯化钴处理人ARPE-19细胞,建立化学缺氧模型,以未缺氧组作为对照,采用Real-time PCR和Western blot法检测在缺氧状态下细胞中slit2、Robo1、VEGF基因mRNA及蛋白水平表达的变化;将缺氧的人ARPE-19细胞随机分为shRNA处理组(加入Ad-slit2-shRNA)、空腺病毒组(加入空腺病毒)和缺氧组,24 h后收集各组细胞,Real-time PCR和Western blot法检测slit2 shRNA干扰后细胞中slit2、Robo1、VEGF基因mRNA和蛋白水平表达的变化,ELISA法检测细胞培养上清中VEGF蛋白水平的变化。结果在正常人ARPE-19细胞中有slit2和Robo1基因mRNA的转录及蛋白的表达;缺氧组人ARPE-19细胞中slit2、Robo1、VEGF基因mRNA和蛋白的表达水平均较未缺氧组明显升高(P0.05);与缺氧组相比,slit2-shRNA处理组人ARPE-19细胞中slit2、Robo1、VEGF基因mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(P0.05),缺氧组与空腺病毒组slit2、Robo1、VEGF的变化差异无统计学意义(P0.05)。结论 slit2 shRNA沉默RPE细胞中的slit2后,可明显抑制缺氧诱导的RPE细胞中VEGF的表达,为临床CNV的治疗提供了新的思路。     

Synthesis and evaluation of an alpha-C-galactosylceramide analogue that induces Th1-biased responses in human natural killer T cells

An alpha-galactosylceramide (alphaGalCer, 1) and its isosteric C-glycoside analogue (2) were found to possess promising immunostimulatory activity because of their ability to activate natural killer T (NKT) cells. We report the synthesis of compound 3, a truncated nonisosteric C-alphaGalCer analogue, that like 2 is not enzymatically labile at the glycosidic linkage, but has the anomeric carbon directly bonded to the C1 of the phytoceramide backbone. We compared the biological activity of the three ligands using an in vitro system with human dendritic cells as the antigen-presenting cells and human NKT cells as the responding cells. Although 3 was a less potent agonist for NKT cells than 1 and 2, it induced cytokine production with the highest IFN-gamma:IL-4 and IFN-gamma:IL-13 ratios. Therefore, our data suggest that the new mimetic of alphaGalCer might preferentially promote Th1-immune responses and serve as a potent adjuvant in the immunotherapy of cancer and infectious diseases.     

细胞因子信号抑制因子1基因真核高表达质粒的构建及其在NOK细胞中的表达

目的构建细胞因子信号抑制因子1(suppressors of cytokine signaling 1,SOCS1)基因真核高表达质粒,并在口腔上皮细胞系NOK细胞中进行表达。方法提取健康人外周静脉血基因组DNA,PCR扩增SOCS1基因,与p EGFPN1载体连接,构建重组真核表达质粒p EGFP-N1-SOCS1,用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切鉴定及测序后,转染NOK细胞,采用荧光显微镜及Western blot法检测转染细胞中SOCS1蛋白的表达。结果重组真核表达质粒p EGFP-N1-SOCS1经双酶切及测序鉴定证实构建正确。p EGFP-N1-SOCS1转染NOK细胞72 h后获得表达,SOCS1蛋白的表达量为(134.67±9.07)%,较转染空质粒组约升高4倍,二者差异有统计学意义(P=0.001)。结论成功构建了SOCS1基因真核高表达质粒,为进一步研究SOCS1的生物学功能奠定了基础。