肠道病毒71型灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫抗原表位的筛选

目的筛选肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)灭活疫苗免疫小鼠后诱导的细胞免疫抗原表位,探讨EV71疫苗诱导的细胞免疫应答机制。方法以EV71 BJ08株(C4基因型)病毒结构蛋白氨基酸序列为模板,合成覆盖EV71 VP1～VP3的256条合成肽(每条肽12个氨基酸),分别以其为刺激物(80μg/ml),采用ELISPOT法测定EV71灭活疫苗免疫小鼠脾单个核细胞(Mononuclear cell,MNC)诱导IFNγ分泌的斑点形成细胞数(Spot-forming cell,SFC),筛选细胞免疫抗原表位。从脾MNC中去除CD4+或CD8+T细胞及封闭MHCⅡ类分子或MHCⅠ类分子,分析抗原提呈途径。结果通过对256条合成肽的筛选,获得3条可刺激小鼠脾MNC高水平分泌IFNγ的合成肽。以3条合成肽作为刺激物时,小鼠脾MNC分泌IFNγSFC均值(单针免疫组:22.3、12.8、17.4;两针免疫组:29.3、44.1、28.5)较乙肝表面抗原对照肽S28-3(9单针:2.1;两针:5.2)显著升高(P0.01)。当MNC中去除CD4+T细胞或封闭MHCⅡ类分子后,IFNγSFC均值显著下降(P0.05);而去除CD8+T细胞或封闭MHCⅠ类分子时,IFNγSFC均值未见显著性差异(P0.05)。结论已成功筛选出3个EV71细胞免疫抗原表位,分别位于VP1、VP2和VP3区域,3条合成肽均属MHCⅡ类限制性多肽。     

人肠道病毒71型VP4多抗的制备及其应用

目的制备人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP4多抗,并鉴定EV71空心颗粒(empty particle,EP)和实心颗粒(full particle,FP)。方法构建重组表达质粒p GEX-6p-1-VP4,诱导表达并纯化GST-VP4融合蛋白,免疫家兔制备多抗。ELISA法检测抗体效价,免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot法鉴定抗体特异性。应用制备的多抗经Western blot法区分EV71 EP与FP。结果质粒p GEX-6p-1-VP4经双酶切及测序鉴定证明构建正确,纯化后的GST-VP4融合蛋白相对分子质量约32 000,以包涵体形式存在。免疫家兔后可获得效价达10~(10)的多抗。兔抗EV71 VP4多抗可识别EV71原核表达及天然病毒颗粒中的VP0、VP4。结论抗EV71 VP4多抗可应用于EV71 EP及FP的鉴定,为EV71的基础研究及疫苗研发提供了新的工具及方法。     

靶向肠道病毒71型VP1基因的siRNA表达质粒的构建

目的构建靶向肠道病毒71型(EV71)VP1基因的siRNA表达质粒,并进行鉴定。方法构建靶向EV71VP1基因的siRNA表达质粒pSVSi1、pSVSi2和pSVSi3;脂质体法转染A549细胞株,筛选阳性克隆,通过荧光定量PCR和Western blot,分别在mRNA水平和蛋白水平鉴定EV71VP1基因的表达。结果质粒pSVSi1、pSVSi2和pSVSi3经测序证明构建正确。pSVSi1对A549细胞VP1基因的抑制效果最好,在mRNA和蛋白水平上的抑制率分别为87%和89%,pSVSi2和pSVSi3在mR-NA水平上的抑制率分别为60%和70%。结论已成功构建了靶向EV71VP1基因的siRNA表达质粒,并筛选出一种对VP1基因有显著抑制作用的siRNA,为手足口病的siRNA基因治疗奠定了基础。     

开封农村地区婴幼儿中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型中和抗体水平及流行趋势

目的了解开封农村地区婴幼儿中肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)中和抗体水平及流行趋势。方法应用微量细胞病变法,对2004年开封农村地区采集的349名7～30月龄婴幼儿血清进行EV71和CA16中和抗体检测。结果7～30月龄婴幼儿EV71和CA16中和抗体阳性率分别为36.7%(128/349)和36.5%(123/337),但二者流行趋势不同。EV71抗体阳性率由10～12月龄组的18.2%上升至25～30月龄组的81.3%,上升约4.5倍,抗体几何平均滴度(GMTs)也缓慢上升;CA16抗体阳性率由13～15月龄组的23.0%上升至22～24月龄组的47.6%,上升约2.1倍,GMTs在125～338之间波动;不同月龄婴幼儿中存在EV71和CA16混合感染的情况,19～24和25～30月龄组的EV71和CA16混合感染率显著高于7～12和13～18月龄组。结论开封农村地区婴幼儿中EV71和CA16中和抗体阳性率高,但二者上升的趋势不同,18月龄后的婴幼儿中EV71和CA16混合感染的比例显著升高。     

氢氧化铝佐剂对肠道病毒71型灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的影响

目的评价氢氧化铝佐剂对肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的影响。方法用含铝佐剂及无佐剂EV71灭活疫苗免疫BALB/c小鼠,并设生理盐水对照组。于加强免疫后7 d采血,进行小鼠脾单个核细胞(Mononuclear cell,MNC)的分离及CD8+T细胞的去除,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测经EV71疫苗原液或VP2-36刺激后的小鼠脾MNC分泌IFNγ水平;应用液相芯片技术(LUMINEX)检测经EV71疫苗原液刺激后的小鼠脾MNC分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10水平;采用体外微量中和试验法检测小鼠血清中和抗体效价。结果 BALB/c小鼠经2次免疫后,铝佐剂疫苗组小鼠脾MNC的IFNγSFC值显著高于无佐剂疫苗组(P均<0.05);铝佐剂疫苗组分泌IL-6和IL-10水平显著高于无佐剂疫苗组(P均<0.05);铝佐剂与无佐剂疫苗组小鼠血清EV71中和抗体阳转率均达到100%,铝佐剂疫苗组诱导的中和抗体效价显著高于无佐剂疫苗组(P<0.01)。结论 EV71灭活疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性IFNγ、IL-2、IL-6和IL-10应答,铝佐剂可同时增强EV71灭活疫苗的Th1和Th2类免疫应答。     

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)VP1蛋白,并检测其免疫原性。方法通过RT-PCR法从CA16病毒青岛株中扩增VP1基因,克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET43.1a-VP1,转化感受态E.coli Rossatte(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组CA16 VP1蛋白通过Ni柱亲和层析纯化后,采用不同剂量(5、10、20、40μg)免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价,微量细胞病变抑制法检测血清中和抗体效价。结果重组表达质粒pET43.1a-VP1经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组CA16 VP1蛋白相对分子质量约为34 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%;纯化的重组CA16 VP1蛋白纯度可达95%以上,可与猴CA16抗血清反应;不同剂量的重组CA16 VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导产生CA16特异性抗体,血清中总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价均明显高于对照组,且抗体效价与免疫剂量存在一定的量效关系;各剂量CA16 VP1组免疫小鼠血清中和抗体效价均小于1∶8。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CA16 VP1蛋白,纯化的重组蛋白可诱导小鼠特异性体液免疫应答,为进一步研究CA16的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。     

黄芪注射液对肠道病毒71型感染引起的细胞凋亡及自噬的抑制作用

目的 探讨黄芪注射液（astragalus membranaceus,AM）对肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）感染诱导的人胃上皮细胞（GES-1）凋亡及自噬的影响。方法 体外培养GES-1细胞，将细胞分为感染组（按MOI=3感染EV71）和对照组（未感染病毒），倒置显微镜观察EV71感染后细胞形态变化；Western blot检测EV71感染后GES-1细胞中病毒结构蛋白VP1的水平；CCK-8法检测EV71感染后GES-1细胞活力；用DAPI进行细胞核染色，观察EV71感染的细胞核凋亡形态变化。再将GES-1细胞分为对照组（未感染病毒）、感染组及终浓度分别为1、2.5、5和10μg/mL的AM干预组，Western blot检测AM干预对EV71感染的GES-1细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP及自噬相关蛋白LC3、P62表达的影响；CCK-8法检测AM干预对EV71感染的GES-1细胞活力的影响。结果 EV71感染引起了GES-1细胞变圆、皱缩，细胞核固缩，大小不均，细胞中VP1水平明显增高（t=41.56,P <0.01），细胞活力明显降低...     

脑心肌炎病毒VP2基因真核表达质粒的构建

目的构建脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)VP2基因真核表达质粒,并于CHO细胞中表达。方法 RT-PCR法扩增EMCV VP2目的基因,克隆至载体pcDNA3. 1中,构建重组质粒pcDNA3. 1-VP2,脂质体法转染CHO细胞。转染48 h后,RT-PCR法检测EMCV VP2基因mRNA的转录情况,免疫组化法及Western blot法检测EMCV VP2蛋白的表达情况。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pcDNA3. 1-VP2构建正确。EMCV VP2基因m RNA及蛋白可在CHO细胞中正常转录及表达,且EMCV VP2蛋白可与兔抗EMCV阳性血清发生特异性结合,主要分布于CHO细胞膜上。结论成功构建了重组质粒pcDNA3. 1-VP2,并有效地在CHO细胞中进行了表达,为EMCV VP2基因体外表达及其功能的进一步研究奠定了基础。     

肠道病毒71型灭活疫苗的小鼠细胞免疫效果

目的评价肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗诱导小鼠的细胞免疫效果。方法分别以不同剂量(1、2.5、5、10μg/ml,均含铝佐剂1 mg/ml)、不同剂型(含铝佐剂1 mg/ml或不含铝佐剂)、不同免疫剂次(单次免疫或加强免疫)EV71灭活疫苗经腹腔免疫小鼠,0.5 ml/只,均设铝佐剂对照组(仅注射铝佐剂1 mg/ml)。采用经典小鼠树突状细胞(dendritic cell,DC)培养方法制备正常小鼠DC,瑞氏染色法检测细胞形态,流式细胞术分析其表型及纯度;免疫磁珠分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)分离小鼠脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞,流式细胞术检测细胞纯度。ELISPOT法检测各组免疫小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ的水平;细胞因子试剂盒检测小鼠淋巴细胞培养上清及小鼠血清中细胞因子的水平。结果 DC形态不规则,表面树枝状突起形态不同,细胞核较大且不规则;DC纯度为(81.39±9.24)%,可高水平表达MHⅡ(I-A/I-E)类分子,中度表达CD86和CD40。CD4+、CD8+T细胞纯度分别为95.27%和94.08%。随着疫苗免疫剂量的增加,CD4+T细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ及CD8+T细胞分泌IFNγ的SFC显著增加,5μg/ml疫苗组达最大值,且明显高于其他组(P均0.05);5μg/ml疫苗组淋巴细胞培养上清中IFNγ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-5、TNF-α含量明显高于其他组(P0.05);1、2.5、5μg/ml疫苗组血清中IL-10含量明显高于铝佐剂对照组(P0.05),1μg/ml疫苗组明显低于2.5及5μg/ml疫苗组(P0.05)。含铝佐剂疫苗组CD4+T细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ及CD8+T细胞分泌IFNγ的SFC、淋巴细胞培养上清中IL-2、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α水平及血清中IL-10含量均明显高于无铝佐剂疫苗组(P均0.05)。加强免疫组CD4+T细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ及CD8+T细胞分泌IFNγ的SFC、淋巴细胞培养上清中IL-2、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α水平、血清中IL-10含量均明显高于单次免疫组(P均0.05)。结论 EV71灭活疫苗可诱导小鼠产生特异性细胞免疫反应,本实验为其进一步人体临床试验研究奠定了基础。     

北京市朝阳区部分婴幼儿肠道病毒71型感染率及手足口病发病情况分析

目的分析北京市朝阳区部分婴幼儿肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染率及手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)发病情况。方法选择北京市朝阳区小红门、酒仙桥社区6~35月龄健康婴幼儿为观察对象,共采集血清414份,检测中和抗体水平,并采集符合"可疑肠道病毒病"入选标准患者的咽拭子和肛拭子标本,应用RT-PCR法进行其他肠道病毒EV-G、柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus type A16,CA16)、EV71特异性核酸筛查。同时对观察对象进行1年随访,调查HFMD发病情况。将观察对象分为6~11月、12~17月、18~23月、24~29月、30~35月5个月龄组。结果 414名观察对象中,EV71中和抗体阳性39人,阳性率为9.42%,随着月龄的增加,阳性率呈递增趋势(P0.001);男性婴幼儿EV71中和抗体阳性率为8.90%(17/191),女性为9.87%(22/223),二者差异无统计学意义(P0.05)。414名观察对象中,29例肠道病毒阳性,其中女性14例,男性15例,男女发病比例为1.07:1;CA16感染率为31.03%(9/29),EV71感染率为17.24%(5/29),其他肠道病毒感染率为51.72%(15/29)。尚不能认为男女性别间肠道病毒感染及EV71和CA16感染的构成比有差别,也不能认为EV71中和抗体情况对肠道病毒感染率和EV71发病率有影响;随着年龄的增长,EV71感染人数呈递增趋势,而CA16则保持不变;小红门社区EV71中和抗体阳性率(12.25%)与酒仙桥社区(4.45%)差异有统计学意义(P0.05)。结论月龄越大,婴幼儿血清EV71抗体阳性率越高;小红门和酒仙桥地区检测到的HFMD患儿主要病原体为CA16和EV71,且CA16感染率高于EV71感染率。     

人胎盘来源的造血干细胞和间充质干细胞的分离及鉴定

目的建立人胎盘来源的造血干细胞(placenta hematopoietic stem cells,hP-HSCs)和间充质干细胞(placentaderived mesenchymal stem cells,hP-MSCs)的分离方法,并进行鉴定和组分分析。方法选取10份新生健康婴儿胎盘组织,采用机械破碎法联合磁珠分选法分离h P-HSCs,胎盘绒毛膜组织块贴壁法分离hP-MSCs,利用形态学观察、集落培养、流式细胞术等进行鉴定。结果 hP-HSCs:分离后有核细胞数(total nucleated cell number,TNC)为(11. 82±2. 46)×10~8个,TNC回收率≥80%;细胞活性为(99. 7±0. 3)%;细胞表面抗体CD34~+CD45dim表达率为(8. 69±0. 36)%,CD34~+总数为(108. 0±6. 48)×10~6个;集落形成总数为(1. 88±1. 07)×10~6。hP-MSCs:冻存细胞总数为(40. 78±9. 35)×10~7个;细胞活性为(99. 0±1. 5)%;细胞表面抗体CD34~+CD45~+表达率为(0. 1±0. 1)%,CD44~+CD105~+为(99. 6±0. 2)%,CD14~+CD19~+为(0. 1±0. 1)%,CD90~+CD73+为(98. 9±0. 2)%;且具有良好成脂、成骨分化潜能。结论成功建立了hP-HSCs和hP-MSCs体外分离培养方法,为胎盘的临床应用奠定了基础,并提供了细胞种子资源。     

Electrochemical impedance spectra of solid-oxide fuel cells and polymer membrane fuel cells

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) is a very useful method for the characterization of fuel cells. The anode and cathode transfer functions have been determined independently without a reference electrode using symmetric gas supply of hydrogen or oxygen on both electrodes of the fuel cell at open circuit potential (OCP). EIS are given for both polymer electrolyte fuel cells (PEFC) and solid oxide fuel cells (SOFC) at current densities up to 0.76 A cm⁻² (PEFC) and 0.22 A cm⁻² (SOFC). With increasing current density the PEFC-impedance decreases significantly in the low frequency range reaching a minimum at 0.4 A cm⁻². At even higher current densities an increasing contribution of water diffusion is observed: the cell impedance increases again. From EIS of SOFC a finite diffusion behavior is observed even at OCP, depending on water partial pressure of the anodic gas supply. This additional element reflects the influence of water partial pressure on the cell potential. The simulation of the measured EIS with an equivalent circuit enables the calculation of the individual voltage losses in the fuel cell.     

Design and optimization of thermo-electrochemical cells

Thermo-electrochemical cells (or thermocells) convert thermal energy to electricity in continuous operation based on a balance of ion conduction and redox reactions at hot and cold electrodes. In this study, the fundamental governing equations for mass and heat transfer, fluid dynamics, and electrokinetics in thermocells are presented and solved numerically using COMSOL. A parametric study is performed to explore the limitations and optimal cell dimensions for maximum energy conversion efficiency in thermocells. Series-stacking designs are demonstrated to have the potential to increase conversion efficiency by 100 % compared to a single cell configuration. Natural convection is shown to significantly increase the conversion efficiency of thermocells with conventional aqueous electrolyte (0.4 M potassium ferri/ferrocyanide), by compressing the diffusive boundary layers. A flow cell thermocell design is also considered. Results reveal that the ohmic resistance of the electrolyte limits the energy conversion efficiency of this design.     

Measure of the driving forces of underfilm differential contamination cells and differential aeration cells

Specially designed multilaminar electrochemical sensors (MS) are used to determine the difference in potential between the local anodes and cathodes of corrosion cells that form under protective organic coatings. These MS not only allow quantification of the effect of underfilm contamination and differential aeration on corrosion kinetics but also supply valuable information for a better understanding of the corrosion process mechanism. The use of MS with alternately clean and contaminated laminae clearly shows that differential contamination cells are capable of generating potential differences (driving forces) of hundreds of millivolt, as also occurred with underfilm differential aeration cells.     

非灌流法分离大鼠肝星形细胞及其鉴定

目的采用非灌流法分离大鼠肝星形细胞(Hepatic stellate cell,HSC),并进行鉴定。方法采用非灌流法结合酶消化法分离大鼠肝脏细胞,密度梯度离心进一步分离HSC,油红染色检测HSC胞质中的脂滴,免疫组化法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)、结蛋白(Desmin)及神经胶质酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达。结果非灌流法结合酶消化法可成功分离大鼠HSC;密度梯度离心纯化的HSC经油红染色,细胞核周围可见红色脂滴;该细胞中α-SMA、结蛋白及GFAP的免疫组化染色结果均呈阳性,细胞着色率可达90%以上。结论成功建立了大鼠HSC的非灌流分离模式,所获得的HSC纯度较高,该方法稳定简便,具有一定的推广应用价值。     

Cultivation of anchorage-dependent cells and their applications

A short review and evaluation of the various cultivation systems for anchorage- dependent cells is given. From the cultivation systems presently available the micro-carrier culture system might be considered to be the most suitable system for large-scale cultivation of these cells. Beside its high potential for scaling up and control of environmental conditions, it has the advantage of easy separation of cells and culture medium. This facilitates medium changes either batch-wise or continuously. For continuous refreshment the sieve for retaining the beads with cells in the fermenter should be built on the stirrer shaft in order to avoid blocking.     

rhGH-Fc工程细胞的构建及筛选

目的研制具有较长半衰期的长效重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH),构建并筛选出高表达rhGH-Fc免疫融合蛋白的细胞株。方法将hGH基因与特异位点突变后的人抗体IgG4Fc段用柔性linker连接,克隆至GS双表达载体上,构建重组表达质粒,经两次双酶切鉴定及测序分析后,将构建正确的质粒稳定转染CHO-k1细胞。通过逐渐提高蛋氨酸磺酰胺(methionine sulphoximine,MSX)浓度,ELISA法筛选高表达的细胞株;利用亲和层析初步纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE、HPLC、等电聚焦电泳分析;通过大鼠去垂体法测定长效rhGH的生物学活性,比较本课题研制的长效GH与其他普通GH的半衰期。结果重组质粒phGH-Fc-1经两次双酶切及测序鉴定,证明构建正确;成功筛选出高表达rhGH-Fc融合蛋白的细胞株,表达量可达1g/L;纯化的目的蛋白相对分子质量大小及等电点均与理论值一致,纯度可达95%以上;经大鼠去垂体体内活性测定,其比活为1.1IU/mg,依大鼠体重增长情况判断,其生物半衰期高于普通rhGH。结论成功构建并筛选出高表达长效rhGH的工程株,为后续长效rhGH的研制奠定了基础。     

微生物燃料电池的研究进展

介绍了微生物燃料电池的工作原理。列举了微生物燃料电池的3个实例模型。概括了微生物燃料电池目前存在的问题和解决方法。展望了微生物燃料电池的应用前景。     

聚合物太阳能电池及材料研究进展

太阳能的充分应用是解决目前人类所面临的能源短缺和环境污染的根本途径。聚合物太阳能电池作为第三代太阳能光伏技术已得到二十多年的研究,其太阳能转化效率已超过10%。回顾聚合物太阳能电池的发展历史和理论研究,太阳能电池的材料与结构对太阳能电池的效率影响很大,尤其是给体材料。从PPV类材料到PT类材料再到PCDTBT、TTBDT、BDTTPD等能级调节后的受体材料,每一次材料的升级,都能让聚合物太阳能电池的效率大幅提高。在聚合物太阳能电池的理论逐渐认识清楚,聚合物太阳能电池制作工艺不断成熟的情况下,研究新型给体材料对向聚合物太阳能电池实用化迈进尤为重要。     

Modelling microbial fuel cells with suspended cells and added electron transfer mediator

Derivation of a mathematical model for microbial fuel cells (MFC) with suspended biomass and added electron-transfer mediator is described. The model is based on mass balances for several dissolved chemical species such as substrate, oxidized mediator and reduced mediator. Biological, chemical and electrochemical reactions can occur in the bulk liquid and at the electrode surface, respectively. Model outputs include time-dependent production of current and electrical charge, current–voltage and current–power curves, and the evolution of concentrations of chemical species. The model behaviour is illustrated using a test case based on detailed experimental observations reported in the literature for a microbial fuel cell operated in batch mode and repeatedly fed with a single substrate. A detailed model parameter estimation procedure is presented. The model simulates the current–time evolution and voltage–current curves in the MFC with glucose as anode substrate and the ferrocyanide/ferricyanide redox couple as the oxidation reaction at the cathode. Simulations show the effect of different parameters (electrical resistance, mass transfer resistance, exchange current, coulombic yields and biomass, substrate and mediator concentrations) on the MFC characteristics. The model explains how the endogenous metabolism or intracellular substrate storage could lead to a non-zero background current even when the added substrate has been depleted. Different trends (increasing or decreasing) in the initial current are explained by the initial oxidation state of the mediator (oxidized or reduced, respectively). The model has potential applications for other bioelectrochemical systems.