应用LNA-TaqMan探针实时荧光PCR检测大米制品中转基因成分

大米制品中痕量转基因成分的检测需要特异和超灵敏的检测方法。本研究以行业标准中转基因大米筛查位点CaMV35S启动子、NOS终止子和Cry1A基因为目标,利用在常规TaqMan探针中掺入锁核苷酸提高探针退火温度和杂交特异性等特点,经比较以上位点不同LNA-TaqMan探针实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测效果,建立了针对上述筛查位点的基于LNA-TaqMan探针的新型实时荧光PCR检测方法。该方法特异性强,检测灵敏度超高;与普通TaqMan实时荧光PCR方法相比,其反应Ct值可提前1～3 个循环（Cry1A位点除外）,检测低限可达3 pg。该检测方法可以用以检测大米制品中常规实时荧光PCR难以检测到的痕量转基因大米成分。     

实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立

采用实时荧光定量PCR技术 ,通过使用特异的引物和探针 ,对大豆中的内源基因Lectin和转基因大豆中的外源基因EPSPS进行了定量检测 ,建立了Monsanto公司生产的商业化转基因大豆Roundup Ready○R的定量PCR检测方法。该方法的检测灵敏度 <0 0 1% ,是国际上设定的转基因最低限量的 10 0倍     

转基因检测微流控恒温扩增芯片的研制

近年来环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）越来越多地应用于转基因农作物、微生物等的基因检测中。为了提高相关检测机构的转基因产品检测效率,加快进出口食品农产品的通关速度,本文首次使用碟式芯片环介导恒温扩增技术,在65 ℃恒温条件下,对样品中的P-CaMV35S、T-NOS、NPTⅡ、BAR、PAT、Cry1Ac、EPSPS I、EPSPS II、FMV35S和GM-HRA等转基因靶标进行同步检测,检出限可达到0.5%（m/m）,实现一次上样即可完成样品的转基因成分筛查。该方法特异性和灵敏度良好、检测时间较短,可实时读取扩增结果。对实际样品的检测结果表明,该方法的检测结果与实时荧光PCR方法的完全一致。本文开发的转基因检测微流控恒温扩增碟式芯片,可用于常见农产品（大豆、玉米、大米和棉花等）的转基因成分筛查,为转基因产品的定性检测提供了新的快速、灵敏、高通量技术平台。     

利用PCR方法检测水稻及其加工产品中转基因水稻

市场上的转基因产品以及深加工产品越来越多,其安全性引起全世界的极大争论,很多国家的检验机构相继开展了转基因产品的检测工作。以转基因水稻为材料,以聚合酶链式反应(PCR)方法为基础,选择适用于转基因食品安全性检验的核酸检测技术,针对转入苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简写为Bt)基因水稻的Cry1Ac片段进行PCR检测,建立适合转基因水稻的检测方法。该方法简便快速、检测结果与标准及其他文献资料相符。     

基于SYBR Green Ⅰ熔解曲线分析的食品中转基因检测方法

研究建立了一种基于SYBR Green Ⅰ的实时荧光PCR方法,结合熔解曲线分析及位点特异的Tm值辅助判断,可以对不同加工类型及加工程度的食品进行转基因检测。该方法对NOS终止子,RRS,Bt176三个基因位点的检出限达到0.1%,对CaMV35S启动子基因位点的检出限可以达到0.05%。运用该方法对80例不同类型的样品进行检测,检出8例含有转基因成分,其检测结果与传统定性PCR方法和Taqman探针实时荧光PCR方法的结果相符。该方法是一种操作安全方便、成本较低、特异、灵敏的实时荧光PCR方法,适用于食品中转基因成分的定性检测。     

实时荧光PCR定量检测加工产品中转基因玉米Mon810成分

采用实时荧光PCR技术，建立了定量(性)鉴定检测加工产品中转基因玉米Mon810成分的方法。实验设计的可以扩增玉米自身基因和外源基因边界序列的引物和探针具有品种和品系特异性，特异性地检测出食品、饲料等加工产品中转基因玉米Mon810成分。某些检测样品不仅检出转基因玉米Mon810成分，还同时检出其它转基因玉米品系或其它转基因品种。本研究实验建立的转基因玉米Mon810品系鉴定检测方法，即可以用于加工产品中转基因成分的定量检测(检测低限为0．1％)，也可以用于定性检测，或作为常规PCR定性检测后的确证实验方法。     

痕量及微量转基因大米成分半巢式PCR检测方法的建立

采用半巢式PCR技术建立了食品中痕量及微量转基因大米成分的检测方法。根据大米内源SPS基因以及转基因大米Bt63含有的外源Cry1A(b)/Cry1A(c)融合基因和Btc基因,分别设计了6对普通与半巢式PCR引物。扩增结果显示,针对理论DNA浓度的检测灵敏度,普通PCR扩增灵敏度为1ng/μl左右,半巢式PCR扩增灵敏度达到10-3～10-4ng/μl,半巢式PCR比普通PCR方法提高了103～104倍;在质量百分比的检测灵敏度方面,普通PCR方法扩增灵敏度在0.1%～1%之间,半巢式PCR方法的检测灵敏度能够达到0.001%～0.01%,半巢式PCR比普通PCR方法要提高10倍以上。在实际样品的检测中,速冻汤圆、婴儿米粉及芝士小圆饼等食品经普通PCR扩增,其内源SPS基因条带模糊或未扩增到,进一步采用半巢式PCR扩增后,能够得到清晰明亮的特异性条带。所有样品均未扩增到外源Cry1A(b)/Cry1A(c)和Btc基因。     

实时荧光定量PCR技术在粮油转基因成分检测中的应用

随着转基因技术在谷物育种中的广泛应用,以及转基因粮油及其制品消费的不断增加,加强粮油转基因成分的检测技术的研究极为必要.阐述了实时荧光定量PCR技术在粮油转基因成分检测中的应用,主要从实时荧光定量PCR技术,实验室条件,实验步骤以及应用范围等方面进行了阐述.     

快速定量检测转基因番茄方法的研究

本文以转基因番茄"华番一号"为原材料,采用了特异性的引物和探针,对构建的质粒载体进行转基因番茄的实时荧光PCR定量检测.其相对检测灵敏度可达到6个拷贝.可用于转基因番茄的定性和定量检测.     

储藏期内转Bt基因稻谷对印度谷螟生长发育的影响（网络首发、推荐阅读）

对转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷（华恢1号）及其非转基因亲本明恢63在储藏期内对害虫印度谷螟生长发育的影响开展研究。结果表明，转Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷对印度谷螟低龄幼虫（1至3龄幼虫）具有较强的致死作用。温度显著影响印度谷螟各虫态的发育历期和发育速度，以2%转基因稻谷糙米粉饲喂印度谷螟后发育历期显著延长。种群生长发育速率与温度关系的非线性拟合结果显示，印度谷螟发育起点温度为7.40~15.94 ℃，以2%转基因稻谷糙米粉饲喂印度谷螟发育起点温度为4.90~17.36 ℃。以上研究结果在理论上加深对转Bt基因稻谷生态安全的认识，在实践上为科学开发利用转Bt基因水稻提供理论支持。     

Expression,purification and refolding of recombinant Cry1Ab/Ac obtained in Escherichia coli as inclusion bodies

BACKGROUND: The Cry toxins are already a useful alternative or supplement to synthetic chemical pesticide application in commercial agriculture and forest management. RESULTS: The Cry1ab/ac gene from Bacillus thuringiensis was cloned from the genome of genetically modified rice by polymerase chain reaction (PCR). Owing to the large number of Escherichia coli low‐usage codons in the Cry1ab/ac gene, the first 20 codons were optimised by PCR to improve the expression of the Cry1ab/ac gene in E. coli. The Cry1Ab/Ac protein was highly expressed in E. coli as inclusion bodies that could be dissolved in 8 mol L^?1 urea and purified on a His Trap^? FF crude column under denaturing conditions. The purified Cry1Ab/Ac protein was dialysed in refolding buffers to obtain a soluble and biologically active protein. To achieve better biological activity, the His‐tag was digested from the Cry1Ab/Ac protein with enterokinase, and the Cry1Ab/Ac protein was further purified by gel filtration on a fast performance liquid chromatography Superdex 75 HR 10/30 column using an AKTA purifier. The identity of the purified Cry1Ab/Ac protein sequence was confirmed by western blot and matrix‐assisted laser desorption ionisation time‐of‐flight mass spectrometry. The final purified Cry1Ab/Ac protein was 99.2% pure and retained its biological activity, as determined in a growth inhibition assay of Chilo suppressalis. CONCLUSION: The purified Cry1Ab/Ac protein could be used to evaluate the food safety of transgenic plants containing the Cry1ab/ac gene and to produce antibodies for immune‐based methods employed in the detection of genetically modified organisms containing the Cry1ab or Cry1ac gene. It might also serve as a new biological insecticide to reduce the use of broad‐spectrum insecticides. Copyright © 2009 Society of Chemical Industry     

多重PCR 检测转基因水稻的转基因成分

以水稻内源基因SPS、外源抗虫基因Cry1Ab、外源抗虫基因Cry1Ab/Ac、外源抗虫基因Btc、报告基因GUS、NOS终止子和CaMV35S启动子为检测对象,设计7对引物,通过优化PCR扩增体系中不同引物浓度的配比及退火温度,建立水稻转基因成分的七重PCR检测体系。结果表明：建立的七重PCR体系能有效检测出水稻及其他作物(大豆、玉米、棉花籽、菜籽粕)中的转基因成分,检测过程简便、特异性好。     

多重荧光聚合酶链反应对转基因能力验证样品的检测和验证

目的利用多重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对转基因能力验证样品进行检测和验证。方法通过筛选出合适的多重引物和探针、核酸提取及多重扩增和分析方法,分别对9个转基因标准品和11个来自于中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment,CNAS)和食品分析水平测试计划(food analysis performance assessment scheme,FAPAS)的能力验证样品进行多重荧光PCR检测,通过SPSS统计软件比较二重、三重实时荧光PCR的循环阈值(cycle threshold,Ct)与单重实时荧光PCR结果的差异性。结果二重实时荧光PCR可同时检测Ca MV35s和NOS 2个基因,三重实时荧光PCR可同时检测Ca MV35s,NOS和NPTII 3个外源基因,各基因之间无信号的交叉干扰。经统计分析,二重和三重实时荧光PCR相对于单重实时荧光PCR的结果无显著性差异。结论建立的二重和三重实时荧光PCR技术可用于能力验证和实验室间比对实验,简单快速,节约试剂成本,且结果准确度可满足日常检测需求。     

基于同源建模与分子对接技术构建抗Bt Cry1类毒素单链抗体定点饱和突变库

转基因食品中苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry毒素种类较多,对生态环境和食品安全等造成的潜在风险日益受到关注,制备针对多种Cry毒素的高效广谱抗体,进而建立广谱性快速检测方法,是对转Bt基因作物进行监管并确保生态环境和食品安全的基础。本研究利用基因工程抗体易于定向修饰及Cry毒素具有相似结构的特点,以实验室前期获得的人源化抗苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry1Ac毒素单链抗体为材料,通过同源建模模拟单链抗体及五种Cry1类毒素的三维结构并利用分子对接技术分析单链抗体与Cry1类毒素结合的关键氨基酸位点;在此基础上利用重叠延伸PCR技术对关键氨基酸位点及其邻近位点进行定向改造,以构建定点饱和突变库,为筛选检测多种Cry1类毒素的广谱特异性抗体提供实验材料。     

大肠杆菌中表达Cry1C基因及其重组表达产物的纯化及复性

通过PCR方法将苏云金芽孢杆菌Cry1C基因从原始质粒中克隆出来。由于Cry1C基因携带了大量大肠杆菌稀有密码子,因此用PCR方法对其前86个密码子进行修改,以提高其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量。Cry1C蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式大量表达,将包涵体用8mol/L尿素溶解并用His TrapTM FF凝胶柱纯化。所得纯化蛋白在复性缓冲液中复性折叠,最终得到可溶并有生物活性(由三化螟活性实验验证)的蛋白。Cry1C蛋白纯度可达99.2%。     

转基因速测卡的现场应用性能及其可行性研究

目的对快速、灵敏、适用于现场检测的转基因速测卡的现场实际应用性能进行评估,并对其方案设计进行探索性研究。方法选取国内外3家公司的转基因速测卡对含Cry1Ab/1Ac Bt蛋白的转基因水稻的检测性能(如灵敏度和交叉反应性)进行评估,并与Real-time PCR方法同时对5种模拟实际样品进行检测分析。结果转基因速测卡的灵敏度最低可达0.25%,且无交叉反应性,与Real-timePCR法检测模拟实际样品的检测结果一致,此外,转基因速测卡具有良好的现场操作性能。结论转基因速测卡具有良好的实际现场应用性能,当实际应用检测时,应根据检测目的与目标蛋白抗原,设计相应的实验方案,达到准确检测的目的。因此,转基因速测卡具有良好的市场推广前景。     

一种5 重real-time PCR筛查转基因水稻方法的建立

以转基因水稻中最常用的CaMV35S启动子、NOS终止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因及SPS水稻内标基因为研究对象，利用5 种不同的荧光信号（FAM、HEX、Taxas Red、Cy5、Cy5.5）进行多重实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）检测方法的研究。通过引物组合筛选、反应体系优化、特异性测试、灵敏度测试、适用性测试等一系列实验，建立了5 重real-time PCR方法，灵敏度可达0.032%。此方法具有灵敏度高、结果准确、通量大等优点，可实现水稻中转基因成分的快速、高效检测。     

乳品中致病大肠杆菌荧光双重PCR技术建立

建立乳及乳制品中致病性大肠杆菌(EPEC)的快检方法。以EPEC特异的微绒毛粘连基因(eae gene)和茵毛束形成编码基因(bfp gene)为模板,设计两对引物,荧光探针对EPEC进行特异性扩增。该方法快速,特异性好,对EPEC的最低检出量为1 cfu/μL(纯菌),检出时间为3 h,同一样品重复检测3次ct值的变异系数均小于5%。建立可快速特异检测乳及乳制品中EPEC的双重荧光PCR方法。     

转基因玉米的七重PCR鉴定方法

以玉米内源基因IVR、外源抗除草剂基因(BAR、PAT)、抗虫基因Cry1Ab、筛选基因NPTII、CaMV35S启动子和NOS终止子为检测的目的片段,分别设计了7对引物,通过研究较佳引物终浓度配比和退火温度,建立了玉米转基因成分七重PCR检测体系。结果表明,建立的七重PCR体系用于同时检测内源基因和转基因成分是可行的,检测方法效率高、稳定性好。     

TaqMan探针用于转基因食品的荧光定量PCR检测

选择了内源基因大豆植物凝集素 (lectin)、玉米转化酶 (invertase)和外源基因抗草甘膦除草剂的 5 烯醇式丙酮酰莽草酸 3 磷酸合成酶 (cp4epsps)、抗欧洲玉米螟的苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 (cryIAb)的TaqMan探针 ,确定了探针浓度和镁离子浓度等反应条件 ,分别对转基因大豆和转基因玉米系列标准品进行内源基因和外源基因的荧光PCR扩增 ,在PCR反应过程中分别以TET和FAM两种荧光通道信号分别追踪同一样品DNA的内源基因和外源基因的扩增动力学变化 ,并依此绘制了ΔCt值与转基因食品百分比含量之间的标准曲线 ,建立了转基因大豆和转基因玉米的TaqMan -荧光定量PCR检测方法 ,该方法具有探针设计较简便、成本较低的特点 ,初步实现了对转基因食品的定量分析及品种鉴定。