LiCl-ARTP复合诱变选育高产碱性蛋白酶菌株及其发酵条件优化

以地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）E-417为出发菌株,采用氯化锂（LiCl）-常压室温等离子体（ARTP）复合诱变法对其进行诱变,通过酪蛋白平板初筛、摇瓶复筛、遗传稳定性验证筛选高产碱性蛋白酶的优良菌株,并通过单因素及响应面试验对其发酵产酶条件进行优化。结果表明,在氯化锂添加量为1.5%、ARTP照射时间为45 s的最适复合诱变条件下筛选得到1株高产碱性蛋白酶的优良菌株F-3,酶活达到12 147 U/mL,且该菌株传代8次后仍具有良好的遗传稳定性,其最适发酵培养基成分为玉米粉41 g/L、豆饼粉40 g/L、碳酸钠2.1 g/L、磷酸氢二钠2.0 g/L;最适发酵条件为发酵温度37 ℃、初始pH值7.0、接种量8%。在此优化条件下,碱性蛋白酶酶活达到16 156 U/mL,较原始菌株提高75%。     

产蛋白酶耐酸细菌的筛选鉴定及混菌固态发酵豆粕的初步试验

为筛选出与乳酸菌混合发酵豆粕效果较佳的菌株,以透明圈法分别从霉豆腐、发酵豆粕、酱油发酵原液等样品中初筛得到13株产蛋白酶菌株,经过复筛固态发酵豆粕酶活、小肽、水解度的测定和耐酸性实验,最终得到1株耐酸性较好且蛋白酶活力较高菌株A-12,经形态观察、生理生化实验和分子生物学实验,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。利用此菌株与实验室保藏的植物乳杆菌NCU116混合发酵,结果表明,发酵后豆粕中胰蛋白酶抑制因子降解量为98.8%,营养物质如粗蛋白和小肽的含量分别提高了11.04%和13.71%,而且豆粕具有酸香味儿,适口性得到改善;枯草芽孢杆菌A-12可以做为与乳酸菌混和发酵豆粕的1株参考菌株。     

高糖化力白曲霉的复合诱变及固态发酵条件优化

采用紫外线及常压室温等离子体（ARTP）复合诱变技术对白曲霉（Aspergillus candidus）Nz 3.602进行诱变选育。对诱变致死率进行测定,确定最佳诱变条件为：15 W紫外灯照射12 min,ARTP处理40 s。对突变菌株进行透明圈法初筛、糖化力测定法复筛,最终得到产酶能力较高的突变菌株B5。其糖化酶酶活为1 050.32 U/g,较出发菌株糖化酶酶活提高85.53%,并且遗传稳定性较好。以菌株B5为研究对象,经单因素试验和响应面分析法对其固态发酵条件进行优化,最佳固态发酵条件为：糠壳添加量15%,原料含水量70%,接种量12%,培养时间5 d,培养温度30 ℃。该条件下糖化酶酶活为（1 254.17±6.14） U/g,比优化前提高了19.41%。     

响应面法优化解淀粉芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件

在单因素试验的基础上,应用响应面法对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZUB-7产中性蛋白酶的发酵条件进行优化,以达到提高菌株产中性蛋白酶酶活力的目的。结果表明,发酵培养基的最佳组分为葡萄糖用量50 g/L、豆粕粉40 g/L、CaCl2添加量0.44 g/L;最适发酵条件为发酵温度40 ℃、初始pH 7.0、接种量6.0%、发酵时间40 h,在此条件下,该菌株产中性蛋白酶酶活力达到192.7 U/mL。     

黑曲霉菌株的诱变筛选及其酸性环境酶活特性研究

用滤纸涂布法从固态发酵的醋醅中分离到1株耐酸黑曲霉菌株.采用常压室温等离子体技术(ARTP)对该菌株进行了诱变,通过专利方法"鉴定霉菌分解淀粉能力的方法"定性筛选出正向突变株,在不同酸度条件下测定了出发菌株和诱变菌株的淀粉酶、蛋白酶活性.测定结果显示,诱变后菌株酸性淀粉酶活和酸性蛋白酶活分别较出发菌株提高53.3％和4...     

异步发酵对混合植物蛋白品质的影响

以豆粕、菜粕和豌豆为混合原料,通过异步发酵工艺改善其蛋白品质。考察不同发酵菌株、原料配比、发酵和酶解条件等单因素条件,并结合响应面试验和正交试验确定最佳的异步发酵工艺,以粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度和蛋白酶活力等指标评价混合蛋白品质。结果表明,单因素实验中米曲霉为最佳的发酵菌株,其分泌的中性蛋白酶活达到676.56 U/g,固态发酵时间为49 h,发酵温度29.9℃,初始发酵水分39.7%。在此工艺下,混合植物原料中的粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度分别提高了15.5%、344%和132%;液态酶解最佳条件为：料水比1:4(m/m),酶解时间18 h,酶解温度50℃,酶解后混合植物蛋白的粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度分别提高了2%、101%、244%。综上,优化先固态发酵,后利用发酵产的蛋白酶液态酶解的异步工艺后混合蛋白原料中的粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度明显提高,蛋白质品显著改善,为蛋白的开发利用提供了基础。     

常压室温等离子体诱变(ARTP)及高通量筛选高产蛋白酶米曲霉的初探

为提高酱油发酵菌种米曲霉的蛋白酶活力,采用实验室保藏菌种H0米曲霉为诱变出发菌株,对H0菌株进行常压室温等离子体诱变(ARTP),诱变条件:功率120 W;气流量10L/min;10个时间梯度处理。结果表明:当诱变时间为140s时,致死率接近90%,此时为最佳诱变时间。利用大豆球蛋白作为选择培养基关键因子进行初筛和96孔板高通量复筛,选出3株高蛋白酶活力菌株H5,H12,H15,并且经过福林酚法验证。最终筛选出米曲霉菌株H15具有高蛋白酶活力:酸性、中性、碱性蛋白酶活力分别为192.35,1816.31,3774.82U/g,比出发菌株H0分别提高17.49%,19.08%,10.66%。     

枯草芽孢杆菌液态发酵豆粕的种子培养基和发酵培养基优化研究

为提高枯草芽孢杆菌液态发酵豆粕的效率,对发酵所用种子培养基和发酵培养基进行优化。通过单因素实验研究种子培养基氮源、碳源、无机盐种类及温度对生物量的影响,确定种子培养基组成为1%酵母膏、1%玉米黄粉、1%KH2PO4,培养温度36℃,其生物量、中性和碱性蛋白酶酶活较常规蛋白胨培养基分别提高210.10%、459.20%和67.50%。在此基础上运用正交实验对发酵培养基碳源量、接种量及温度进行优化,得到最优发酵工艺条件为20%豆粕、2%玉米黄粉、1%KH2PO4、接种量10%,培养温度36℃,其生物量、可溶性蛋白及多肽含量较仅含22%豆粕的培养基分别提高40.90%、28.60%和36.40%。结果表明采用优化后的种子培养基和发酵培养基能够显著提高枯草芽孢杆菌液态发酵豆粕的效率。     

常压室温等离子体诱变技术选育曲霉型豆豉发酵菌种研究

为了提高曲霉型豆豉曲醅中蛋白酶活力,本研究对实验室前期筛选得到的一株蛋白酶活力较高的Aspergillus oryzae NCU-110为原始菌株,采用常压室温等离子体(ARTP)技术进行诱变。结果表明:ARTP处理6min为最佳诱变时间,米曲霉致死率达到91.05%。对诱变处理的菌株进行两轮筛选及遗传稳定性验证实验后发现,突变株A.oryzae NCU-A55显示出高产中性蛋白酶活力和良好的遗传稳定性,酶活力较原始菌株提升了21.0%,达到741.6U/g;蛋白酶系对比实验进一步证实了突变株蛋白酶系以中性酶活力为主的特点,且酶系完整。在制曲60h后中性蛋白酶活力最高,达到958.8U/g,比原始菌株提升了14.7%;形态观察及产孢子能力对比,发现突变株具有菌丝生长速度加快、产孢子能力显著增强的有利表型。这些结果综合表明突变菌株A.oryzaeNCU-A55较高的产中性蛋白酶活性可能与其菌丝体快速生长及产孢子能力增强有关,且比较适合曲霉型豆豉的纯种发酵。     

脉冲磁场诱变结合发酵条件优化提高 中性蛋白酶产量的研究

利用脉冲磁场诱变枯草芽孢杆菌结合发酵条件优化以实现中性蛋白酶产量的最大化。结果表明在磁场强度为7 T,脉冲数为40次时诱变得到了中性蛋白酶产量提高17.7%的枯草芽孢杆菌菌株。对其发酵条件进行优化,得到最佳发酵培养基配方为豆粕粉90 g/L,麦芽糖10 g/L,KH_2PO_4 8 g/L,最佳发酵条件为接种量5%、发酵温度37℃、摇床转速180 r/min。在此条件下,发酵48 h,中性蛋白酶酶活力为384.57 U/m L,比野生株提高了26.48%。     

发酵豆粕分泌蛋白酶的兼性厌氧型菌株筛选与鉴定

在厌氧条件下筛选固态发酵豆粕的生产菌株。以透明圈法分别对中外发酵豆粕、霉豆腐、酱油发酵原液等进行厌氧条件下高产大豆蛋白酶生产菌株进行筛选。利用初筛得到的单菌在厌氧条件下发酵豆粕,以小肽含量和蛋白酶酶活力为指标进行复筛,得到优势菌株NCU646。结果表明：厌氧条件下NCU646菌株在豆粕固态发酵培养基中产蛋白酶活力高达9600U/g,发酵后豆粕中小肽含量提高10倍以上,豆粕中粗蛋白含量增加了近10.0%。经过生理生化鉴定和16S rRNA基因序列分析鉴定,该菌株为兼性厌氧型的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

微生物发酵对豆粕抗原性的影响

探讨了微生物发酵对豆粕抗原性的影响。选用植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和米曲霉这5种菌株,在液态和固态条件下分别发酵豆粕12 h,对发酵产物进行抗原性测定。结果表明:豆粕经这5种菌株发酵后,粗蛋白含量均有所提高,其中枯草芽孢杆菌在固态发酵时降解豆粕抗原蛋白和降低豆粕抗原性的效果优于其它菌株,此时,豆粕蛋白水解度为4.89%,必需氨基酸含量为193.51mg/g。SDS-PAGE显示发酵豆粕中β-伴大豆球蛋白的α’和α亚基消失,β亚基条带和大豆球蛋白的酸性亚基条带密度减弱,同时大豆球蛋白与β-伴大豆球蛋白的抗原性降低率分别为20.62%和50.12%。     

酵母菌单菌固态发酵豆粕的研究

为了选育能够提高豆粕饲用品质的高效菌株,从12株酵母菌中筛选出一株优质酵母菌,以普通生豆粕为原料,通过L25(56)的正交试验,研究其对豆粕中胰蛋白酶抑制因子和小肽含量的影响,并对其发酵条件进行优化.结果表明,最优发酵条件为:6%的接种量,料水比为1:0.9,通气量为45 g/500 mL,在自然pH,30 ℃下发酵48 h;胰蛋白酶抑制因子含量显著下降,降解率达56.2%(42.53～18.63 mg/g),小肽含量提高了4.3倍(1.65%～8.7%).微生物发酵生豆粕能明显降解抗营养因子,从而改善其饲用品质.     

Increasing peptide yield of soybean meal solid-state fermentation of ultrasound-treated Bacillus amyloliquefaciens

The purpose of the study was to investigate the feasibility and mechanisms of increasing peptide yield of soybean meal solid-state fermentation (SSF) products by ultrasound-treated Bacillus amyloliquefaciens. Under the optimal parameters level (frequency of 40 kHz, power density of 40 W/L, time of 17.5 min), peptide content of SSF soybean meal in ultrasonic treatment group reached 150.68 mg/g, which increased by 13.10% compared to the control. Ultrasound-treated B. amyloliquefaciens enhanced peptide yield, biomass and protease activity at early stage of SSF. Analysis of omics and qRT-PCR validated that ultrasound treatment did not promote protease secretion but facilitated the germination of endospores. The germination rate increased from 15.67% to 67.33%. According to growth curve determination, ultrasound-treated B. amyloliquefaciens had shorter lag times due to increased vegetative cell content in the inoculum. In conclusion, peptide yield of soybean meal SSF products can be effectively increased by ultrasound-treated B. amyloliquefaciens, which is because of the facilitation effect of ultrasound on endospores germination.     

产蛋白酶芽孢杆菌的筛选及其发酵对豆粕的影响

筛选高产蛋白酶芽孢杆菌并评价其发酵对豆粕的影响,从吉林省猪饲料中分离出1 株蛋白酶产量为（519.1±4.7）U/g的需氧芽孢杆菌JL8。通过生化实验和16S rDNA基因分析,鉴定其为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）。通过分析不同发酵时间芽孢杆菌产芽孢数量、豆粕中可溶性还原糖含量、总蛋白含量、可溶性蛋白与总蛋白的比值以及蛋白过敏源降解情况,确定最佳发酵时间,并在最佳发酵时间下,通过扫描电镜（scanning electron microscopy,SEM）和X射线衍射（X-ray diffraction,XRD）分析芽孢杆菌发酵对豆粕蛋白微观结构的影响。结果表明：在37 ℃、物料含50%水的条件下,24 h为最佳发酵时间。发酵24 h后,SEM结果显示发酵显著改变了豆粕蛋白的微观结构,使其结构更加疏松。XRD结果显示发酵改变了蛋白质的主链结构,并且使β-折叠结构在二级结构中的占比大幅度提高,可能会提高豆粕蛋白的溶解性。     

Improvement of soybean meal quality by one-step fermentation with mixed-culture based on protease activity

Microbial fermentation can improve the quality of soybean meal by reducing the level of anti-nutrition factors and increasing the content of protein and small peptides. In this study, Bacillus velezensis, Enterococcus faecium and Saccharomyces boulardii were used for one-step mixed fermentation of soybean meal. The fermentation of soybean meal was carried out in an anaerobic bag using fermentation liquid of strains with maximum protease activity as inoculum and water. The results of process optimization showed that the mixture ratio of B. velezensis: E. faecium: S. boulardii was 37.5%:25%:37.5%. The three microorganisms added together as a mixture. Under the conditions of 55% inoculation with microorganisms mixture, 0.8% acid protease addition, 46 ℃ and 6 days, the quality of fermented soybean meal was significantly improved. The small peptides increased from 4.48% to 47.4%, the TCA solution protein increased from 44.3 g/kg to 255.2 g/kg, the antigenic protein glycinin decreased by 94.37% from 320.12 μg/mL to 18.02 μg/mL, and β-conglycinin decreased by 85.83% from 232.11 μg/mL to 32.89 μg/mL. Other anti-nutritional factors urease, phytic acid and stachystryose all decreased. The result indicated that it was feasible to improve the feed quality of soybean meal by one-step mixed fermentation based on protease activity.Industrial relevanceFermentation is the main method to improve the feed quality of soybean meal. Our study revealed that one-step mixed-culture fermentation based on microbial protease activity showed a significant effect on increasing beneficial small peptides, reducing anti-nutrient factors and enhancing palatability of soybean meal. This process simplified the operation of mixed fermentation and could be implemented in solid fermentation system of feed and food industry to improve the beneficial properties of products.     

豆粕混菌液体发酵制种技术试验研究

利用热带假丝酵母和枯草芽孢杆菌混菌发酵进行液体制种。结果表明:受接种量、豆粕含量和培养温度的影响,两株菌种菌数的增长速度具有相对一致的变化趋势;受培养时间的影响,热带假丝酵母菌先增后降,枯草芽孢杆菌先降后增;热带假丝酵母在pH3.5时菌数最大,枯草芽孢杆菌在pH4.5～7.5范围内适宜生长。在豆粕质量分数15%、葡萄糖质量分数1%、初始pH4.5的液体培养基上,两菌分别接种10%,在发酵温度28℃、摇床转速160r/min条件下培养5d,热带假丝酵母菌和枯草芽孢杆菌菌数达到最大,分别为752.5×106和264.2×107 cfu/ml。     

红曲霉发酵高温豆粕高产可溶性多肽

通过利用红曲霉发酵高温豆粕产生可溶性多肽,确定菌株对变性蛋白质有一定的分解作用;并采用紫外诱变红曲霉,经初筛和复筛,最终筛选出能高产可溶性多肽的菌株。结果表明：红曲霉发酵可分解高温豆粕中的蛋白质,并且产生分子质量介于7.8～20.1 kD的可溶性多肽。发酵120 h可产生（13.41±0.20） mg/mL的可溶性多肽,是原豆粕的3.60 倍。15 W紫外线灯35 cm处,搅拌条件下照射50 s,红曲霉的致死率为（82.70±2.20）%。在此诱变条件下得到一株高产可溶性多肽的突变红曲霉0501100菌株。该菌株在发酵豆粕96 h时产生的可溶性多肽含量达到（17.20±0.18） mg/mL,是原菌株在同等发酵时间条件下产生可溶性多肽的1.47 倍,是原豆粕的4.61 倍,缩短了发酵时间并且有较好的遗传稳定性。     

产蛋白酶兼性厌氧菌株的筛选、酶学性质及发酵豆粕应用探究

为筛选得到1 株或几株深层发酵豆粕效果较好的菌株,以透明圈法从自然发酵的豆豉中筛选出4 株兼性厌氧且产蛋白酶菌株,同时发现菌株B-1、B-12在厌氧条件下产蛋白酶能力好于好氧条件,对此现象较明显且平板水解圈直径较大的菌株B-1进行形态学、生理生化和分子生物学实验,鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。进一步对菌株B-1的蛋白酶酶学性质进行研究后发现,酶活力在pH 6.0～9.0的范围内能够维持一个较高的水平,酶反应和酶稳定最适条件为pH 7.0和40 ℃,加入Mn2+对酶反应的促进作用较大。将甲基营养型芽孢杆菌B-1以6%的接种量接种于豆粕固态发酵培养基中堆积（20 cm）发酵,以枯草芽孢杆菌A-12好氧浅层发酵和未发酵豆粕作为对照,发酵结束后测得豆粕中小肽含量和水解度分别高达28.37%和29.55%,比枯草芽孢杆菌固态发酵对照组分别高出了9.04%和16.07%,与未发酵豆粕相比,菌株B-1发酵后豆粕的小肽含量和水解度也分别提高了27.22%和29.13%。